Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium aus kanadischen Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749) unterstützt. L. Liu ist ein Empfänger CIHR New Investigator Award (MSH-95374).

1. Vorbereitung der Lockstoff in Agarose Gel <ol><li> Je 10 ml 2 × PBS in einem 50-mL konischen Rohr, und Aufwärmen der Röhre, indem Sie es in ein Becherglas mit heißem Wasser. </li><li> Je 10 ml destilliertem Wasser und 0,4 g Agarose Pulver in einem anderen 50-mL konischen Rohr (mit seiner Mütze etwas gelockert) und erhitzt die Mischung bis kurz Kochen in der Mikrowelle (für ca. 1 min in einem 700-Watt-Mikrowelle) . </li><li> Fügen Sie die erwärmte 2 × PBS für Agarose-Lösung Schlauch, wirbeln die gemischte Lösung und halten Sie sie warm in das heiße Wasser Becher. </li><li> Micropipette chemoattractant Lösung (z. B. 10 ul 0,5 ug CXC-Chemokin MIP-2 oder 12 ul 1 mM WKYMVm) in den Deckel eines 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen mit 3 ul Tusche und gut mischen durch Absaugen mit einer Mikropipette (zu vermeiden Luftblase). </li><li> Schneiden Sie die Spitze eines 200-ul Pipettenspitze und Mikropipette 110 ul Agarose-Lösung (42 ° C) in den Deckel und sofort gut mischen mit einem anderen Pipettenspitze (Vermeidung von Luftblasen). </li><li> Bewahren Sie die Lockstoff-Gel bei +4 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung der Cremaster Muskel für Intravital Mikroskopie (Abbildung 1) <ol><li> Anesthetize ein erwachsener Mann mit der Maus durch eine ip-Injektion einer Mischung von 10 mg / kg Xylazin und 200 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid. </li><li> Shave Bereich über rechte äußere Halsschlagader und der Vorderseite des Hodensacks mit einem elektrischen Rasierer. Nach der Anästhesie, ist es wichtig, besondere Aufmerksamkeit und Sorgfalt auf die narkotisierten Maus zu geben. Eine Wärmelampe kann verwendet werden, um die Maus vor Unterkühlung zu verhindern. Die Maus sollte frei sein von Schmerz-Reflex. </li><li> Machen Sie ein horizontaler Schnitt, finden und Katheterisierung der Jugularvene mit einer PE-10-Schlauch mit 100 U / mL Heparin Kochsalzlösung gefüllt. Katheterisierung der Jugularvene für die Verabreichung von zusätzlichen Anästhesie und Medikamente benötigt, wenn erforderlich. </li><li> Fix Maus Hinterbeine mit Nabelschnur-Band mit der Maus mit dem Gesicht auf einem hausgemachten M. cremaster Bord (Abbildung 1). </li><li> Verbinden Sie das Board zu einem 37 ° C Wasser Thermostaten zu halten cremaster Muskel-und Maus Körper warm. </li></ol> Hinweis: Alle Verfahren 2,6 bis 2,14 müssen sehr vorsichtig 5 durchgeführt werden. <ol start="6"><li> Machen Sie einen Schnitt in der Haut des Hodensackes auf der linken M. cremaster aussetzen. Sorgfältig sezieren den Muskel aus dem zugehörigen Faszie. </li><li> Superfuse M. cremaster mit 37 ° C vorgewärmt Bicarbonat-gepufferte Kochsalzlösung (NaCl 131,9, 4,7 KCl, 1,2 MgSO 4, 20 NaHCO 3, in mM, pH 7,4) mit einer Schlauchpumpe. </li><li> Tie einem 4:0-Naht am distalen Ende des M. cremaster zu halten auf die klare Sichtscheibe Sockel des M. cremaster Bord. </li><li> Cauterize M. cremaster in Längsrichtung. Mit 4-0 Nahtmaterial, halten Sie die Muskeln flach und befestigen Sie es an den Rändern auf dem Podest. Trennen Sie die Hoden und Nebenhoden von der darunter liegenden Muskeln und verschieben Sie sie in die Bauchhöhle. </li><li> Superfuse der Muskel bei ~ 0,6 ml / min mit dem 37 ° C vorgewärmt Perfusionspuffer und decken den freigelegten Muskel mit einer 22 × 22 mm Deckglas. </li><li> Setzen Sie den M. cremaster Bord auf dem Mikroskoptisch, untersuchen Sie die Muskeln unter dem Mikroskop, einen geeigneten postkapillären venule (Wählen Sie die venule, dass gerade und unverzweigt ist und normale Scherrate und einen Durchmesser in 25-40 um) und passen Sie die Video-Kamera damit die venule zu sein in einer vertikalen Position auf der linken oder rechten Ende der TV-Monitor visualisiert. </li><li> Nach 30 min aus dem Gleichgewicht, Aufzeichnung der Videobilder der ausgewählten postkapillären venule für 5 min als Ausgangswert Steuerdaten mit Hilfe eines Video-Recorders. </li><li> Stoppen Sie die Superfusion und entfernen Sie das Deckglas auf den Muskel. </li><li> Ein ~ 1-mm 3 große Lockstoff-Gel auf der Oberfläche des M. cremaster in einem vorgewählten Bereich von 350 um und parallel zu den beobachteten postkapillären venule, fügen Deckglas auf das Gel in Position zu halten und superfuse das Muskelgewebe in einem sehr langsam (≤ 10 ml / min), um die Einrichtung einer Steigung von Lockstoff, die langsam freigesetzt wird und gebildet aus dem Gel zu ermöglichen. </li><li> Notieren Sie sich die Video-Bild für 90 min nach der Zugabe der Lockstoff Gel. Während der Aufnahme einstellen und halten das Mikroskop Fokus auf die Einhaltung, Krabbeln, transmigrating und chemotaxing Leukozyten im venule und im Muskelgewebe. </li><li> Nach dem Experiment, importieren Sie die Video-Datei auf einen Computer zur Auswertung. </li></ol> 3. Handy-Tracking mit ImageJ <ol><li> Auf einem Computer, extrahieren und konvertieren das Video in AVI-Format (zB Nutzung freier Software bitRipper auf DVD-Video zu AVI Datei umwandeln). </li><li> Verwenden Sie Video-Editing-Software, um die zeitversetzt Film zu erzeugen. Verwenden Sie zum Beispiel Windows Movie Maker zu einem zeitversetzt Film (auf 1 / 512 oder 1 / 1024 im Zeitraffer einet 30-fps-Rate) von der ursprünglichen, Echtzeit-Video. Konvertieren und speichern Sie die unkomprimierte zeitversetzt Films an ein DV-AVI-Format. </li><li> Notieren Sie sich die Bilder der Kalibrierung Mikrometer unter den gleichen Mikroskop-Einstellung, importieren Bilder auf den Computer, öffnen Sie die Bilder mit ImageJ. In ImageJ, erscheinen die insgesamt Pixel auf dem oberen Rand des Bildschirms (z. B. 720 × 480 Pixel) links. Messen Sie die Größe des Bildschirms an beiden Achsen X und Y (z. B. 200 × 150 pm). Daraus errechnen die Anzahl der Pixel pro um (zB x = 720/200 = 3,6 Pixel / um, und y = 480/150 = 3,2 Pixel / um). </li><li> So importieren Sie den Film, offene ImageJ wieder, klicken Sie auf &quot;Datei-Import-Mit Quicktime Movies Plug-in&quot;, wählen Sie den Film zu analysieren und klicken Sie auf &quot;OK&quot; an der Schnittstelle von &quot;QT Film Opener&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Plugins-Manual Tracking&quot;, um Zellen zu verfolgen. Füllen Sie die relevanten Informationen in die Felder unten vor dem Start Tracking-Systems. Kurz gesagt, <ol><li> Zeitintervall (in sec) = fold-time-lapse/30 (zum Beispiel ein 1020 × Zeitraffer wäre 1020-1030 = 34 sec / frame Intervall). </li><li> x / y = Kalibrierung der um / pixel-Messung mit der Kalibrierung des Bildes des Mikrometers. </li><li> z-Kalibrierung = 0 (wie die Maus M. cremaster einer extrem dünnen Schicht aus Gewebe und Zellen kriechen und Migration sind ca. 2D unter Hellfeld-Durchlicht ist). </li><li> Suche Quadratmeter Größe zur Zentrierung = 1. </li><li> Punktgröße / Line Breite / Schriftgrad: Sie können bei Bedarf angepasst werden. </li></ol></li><li> Wählen Sie einen stabilen und klaren Punkt als Bezugspunkt. Dieser Bezugspunkt kann eine klare und kleine struktureller Hinsicht, dass unverändert und stabil in der gesamten Experiment bleibt. Klicken Sie auf &quot;Add Track&quot; zum Bezugspunkt von der ersten bis zur letzten Frame aus und klicken Sie &quot;End Track&quot;. Die Daten erscheinen auf den Ergebnissen Tabelle automatisch. </li><li> Spur kriecht und die Migration von Neutrophilen eins nach dem anderen: klicken Sie auf &quot;Add Track&quot;, um die Zelle von ihrer Erscheinung in Gewebe bis zu seinem Verschwinden in jedem Frame aus und klicken Sie &quot;End Track&quot; zu beenden und speichern die Ergebnisse in Microsoft Excel. </li></ol> 4. Die Analyse der Neutrophilen Recruitment Parameters <ol><li> Öffnen Sie die Ergebnisse in Microsoft Excel, und die Daten analysieren (nehmen Sie die Änderungen der Bezugspunkt in-Analyse). </li><li> Intraluminale kriechen <ol><li> Crawling Distanz: die totale Entfernung der Zelle kriecht in das Lumen von der ersten Anhänger vor Ort, um die optimale Seelenwanderung Website (um). </li><li> Crawling Geschwindigkeit: Crawling Weg / Zeit (um / min). </li></ol></li><li> Transendotheliale Migration <ol><li> Transmigration Zeit: ab dem Zeitpunkt der Zelle beginnt in Endothel, um die Zeit abwandern, wenn die ganze Zellkörper liegt etwas außerhalb des venule und keine Zelle Körper kann in das Lumen (min oder sec) gesehen werden. </li><li> Detachment der Zeit: von der Zeit die ganze Zellkörper liegt etwas außerhalb des venule (unmittelbar nach der Seelenwanderung), um den Zeitpunkt, wenn die Zell-Kontakt verliert mit der venule (den Schwanz eingezogen) (min oder sec). </li></ol></li><li> Chemotaxis in Gewebe <ol><li> Laufstrecke: die Summe der Abstand der Zelle bewegt sich vom Startpunkt bis zum Endpunkt der Wanderung im Gewebe (um). </li><li> Geschwindigkeit der Migration: Laufstrecke im Gewebe / Uhrzeit (um / min). </li><li> Chemotaxis Entfernung: die Summe der Abstand der Zelle wandert in x-Achse im Gewebe (um). </li><li> Velocity der Chemotaxis: Chemotaxis Weg / Zeit (um / min). </li><li> Chemotaxis Index: Das Verhältnis der Aufteilung der Chemotaxis Abstand von der Laufstrecke im Gewebe. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Obwohl bightfield Intravitalmikroskopie zur Untersuchung der Leukozyten-Endothel-Zell-Interaktionen benutzt wird und nicht unbedingt für Neutrophile, bestätigt uns, dass durch unsere Histologie Studien, mehr als 95% der rekrutierten Zellen in neutrophilen Lockstoff behandelten cremaster Muskeln waren in der Tat Neutrophilen . In diesem Bericht, mit Neutrophilen-selektive Lockstoffe, präsentieren wir Verfahren zur Verfolgung der Rekrutierung von Neutrophilen in vivo. Insbesondere beschreiben wir ein Protokoll der Tracking neutrophilen intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in cremaster Muskelgewebe in narkotisierten Mäusen mit Zeitraffer-Intravitalmikroskopie Video-Mikroskopie und ImageJ. Der Lockstoff-haltigen Agarosegel auf dem M. cremaster langsam freisetzt chemoattractant und ermöglicht einen Lockstoff-Gradienten in Gewebe festgestellt werden. Neutrophile chemoattractant induziert Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen in cremasterica postkapillären Venolen in Mäusen. Das ganze Experiment ist unter einer aufrechten Hellfeld intravital Mikroskop mit Videobildern von einer Farb-Videokamera zu einem TV-Monitor projiziert und von einem Videorecorder visualisiert. Wir bestimmten die Neutrophilenintraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Migration und Chemotaxis in Muskelgewebe als Reaktion auf neutrophilen chemoattractant MIP-2 und WKYMVm in Agarosegel hergestellt (Abb. 2). Wir fanden, dass MIP-2 (bei 0,5 pM) und WKYMVm (bei 0,1 mM) neutrophilen intraluminale kriechen hervorgerufen zu ähnlichen Geschwindigkeit, Neutrophilen transendotheliale Migration und Ablösung von der venule für vergleichbare Länge der Zeit, die Migration von Neutrophilen-Chemotaxis und im Muskelgewebe mit nahezu gleichen Geschwindigkeit und mit ähnlichen Neutrophilen-Chemotaxis Indizes (P&gt; 0,05, Student t-Test). <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die schematische Darstellung einer intravitalen Mikroskop-System. Die Maus M. cremaster ist auf der klare Sicht Sockel M. cremaster Bord auf Mikroskoptisch exteriorisiert und superfundiert mit 37 ° C vorgewärmt Bicarbonat-gepufferte Kochsalzlösung. Die aufrechten Mikroskop ist mit einem CCD-Farb-Videokamera für Hellfeld Intravitalmikroskopie verbunden. Eine monochrome tief gekühlte CCD-Kamera ist auch für Mikroskop-Port für die Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie verbunden, die Bilder aus, die direkt von einem Computer verarbeitet. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Neutrophil Rekrutierung Parameter Hellfeld Intravitalmikroskopie. Neutrophile Rekrutierung wurde durch die allmähliche Freisetzung von neutrophilen chemoattractant MIP-2 oder WKYMVm im Agarosegel Vorbereitung platziert 350 um neben der postkapillären venule induziert. Zeitversetzt Videodaten wurden von ImageJ nach der Verarbeitung der Echtzeit-Video-Aufzeichnung des Experiments analysiert werden. Neutrophile intraluminale kriechen (A), Seelenwanderung Zeit und Distanz der Zeit (B), Wanderungsgeschwindigkeit und Chemotaxis Geschwindigkeit im Gewebe (C), und Chemotaxis Index in M. cremaster (D) wurden nach der Verabreichung von MIP-2 oder WKYMVm Agarosegel festgestellt M. cremaster in C57BL / 6 Mäuse (n = 3, # der verfolgten Zellen = 22 (in A und B) und 27 (in C und D) bzw. für MIP-2 und = 26 (in A und B) und 44 ( in C und D) bzw. für WKYMVm).

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	<li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment:+organ-specific+mechanisms+of+action.">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li><li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+leukocyte+recruitment:+an+in+vivo+perspective.">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li><li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites:+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade.">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li><li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation.">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Intravitalmikroskopie ist das wesentliche Werkzeug für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten während der Entzündung. Quantitative Visualisierung für die Bestimmung der Leukozyten-Endothel-Zell-Interaktionen in Mikrovaskulatur von transluzenten Gewebe wie M. cremaster und Mesenterium bleibt der Goldstandard für die Anwendung der Technik 1,5. Die konventionellen Hellfeld Intravitalmikroskopie hat viele einzigartige technische Ausstattung und die Rekrutie...

Tabelle: Materialien, Reagenzien und Geräte <table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Polyethylen-Schlauch, PE10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427401 </td><td> ID 0,28 mm × 0,61 mm OD </td></tr><tr><td> Tusche </td><td> Speedball Art </td><td> Super Black </td><td> 100% Rußpigment-keine Farbstoffe </td></tr><tr><td> Kauter </td><td> Aaron Medical </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Bayer HealthCare, Bayer Inc. </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin-Hydrochlorid </td><td> Bioniche Tiergesundheit Kanada, Inc. </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> Murine rekombinanten MIP-2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharmaceuticals, Inc. </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapure </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> Aufrechte Mikroskope </td><td> Olymp </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> 3CCD Farb-Videokamera </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD-Videorecorder </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> TV-Monitor </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Wasser Thermostaten </td><td> Thermo Scientific </td><td> HAAKE DC10 </td><td></td></tr><tr><td> Schlauchpumpe </td><td> Gilson, Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster Muskel Bord </td><td> University of Saskatchewan </td><td></td><td> Hausgemachte </td></tr></table>

tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy

Die Rekrutierung von zirkulierenden Leukozyten aus Blut, um das entzündete Gewebe ist ein wesentlicher und komplexer Prozess der Entzündung 1,2. In den postkapillären Venolen des entzündeten Gewebes, Leukozyten zunächst Leine und rollen auf der luminalen Oberfläche von venulären Wand. Rollende Leukozyten Festnahme am Endothel und unterziehen feste Verklebung als Reaktion auf Chemokin oder andere Lockstoffe auf die venulären Oberfläche. Viele adhärenten Leukozyten von der ersten Seite der Haftung auf dem junctional Extravasationsbezirks in Endothel zu verlagern, bezeichnet ein Verfahren, intraluminale kriechen 3. Nach kriechen, Leukozyten in Endothel (Seelenwanderung) bewegen und wandern in extravaskulären Gewebe in Richtung der Quelle der Lockstoff (Chemotaxis) 4. Intravitalmikroskopie ist ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung von Leukozyten-Endothelzell-Interaktionen in vivo und aufschlussreich zellulären und molekularen Mechanismen der Rekrutierung von Leukozyten 2,5. In diesem Bericht stellen wir eine umfassende Beschreibung der Verwendung von Hellfeld Intravitalmikroskopie zu visualisieren und zu bestimmen, die genauen Abläufe des neutrophilen Rekrutierung in Maus M. cremaster in Reaktion auf den Verlauf eines Neutrophilen Lockstoff. Um neutrophilen Rekrutierung, ein kleines Stück Agarosegel (~ 1-mm Größe 3) mit neutrophilen chemoattractant MIP-2 (CXCL2, ein CXC-Chemokin) oder WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, ein synthetisches Analogon zu induzieren von bakteriellen Peptid) wird auf das Muskelgewebe neben den beobachteten postkapillären venule platziert. Mit Zeitraffer-Video Fotografie und Computer-Software ImageJ, Neutrophilen intraluminale Kriechen auf Endothel, Neutrophilen transendotheliale Migration und der Migration und Chemotaxis in Gewebe sichtbar gemacht und verfolgt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige und quantitative Analyse von vielen Neutrophilen Rekrutierung Parameter wie intraluminale krabbeln Geschwindigkeit, Seelenwanderung Zeit, Distanz Zeit, Wanderungsgeschwindigkeit, Chemotaxis Geschwindigkeit und Chemotaxis Index im Gewebe. Wir zeigen, dass dieses Protokoll verwenden, diese neutrophilen Rekrutierung Parameter stabil bestimmt werden können und die einzelne Zelle Fortbewegung bequem in vivo verfolgt.

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Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K Aufrufe.  University of Saskatchewan. Wir beschreiben ein Protokoll von Hellfeld Intravitalmikroskopie zur Messung dynamischer Neutrophilen-Endothel-Zell-Interaktionen während der neutrophilen Granulozyten Rekrutierung in Reaktion auf die Quelle eines neutrophilen Lockstoff in vivo. Neutrophile intraluminale Krabbeln, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Maus cremaster Muskelgewebe visualisiert mit Zeitraffer-Video Fotografie und verfolgt mit ImageJ.

Serie: Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

Intravitalmikroskopie der Leistenbruch Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

Quantitative Bewertung der humanen neutrophilen Migration Über eine Zucht Blasenepithel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Abbilden Neutrophilen und Monozyten in Mesenterialvenen von Intravitalmikroskopie an narkotisierten Ratten in Echtzeit

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&amp;#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Intravital Imaging von Neutrophilen Priming Mit IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mäuse

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...