The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

Neutrophile wurden von gesunden Freiwilligen, die eine Einverständniserklärung unterzeichnet haben, isoliert. Die Forschung hat in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Leitlinien für die menschliche Wohlfahrt durchgeführt. 1. Auflage und Wartung von menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen <ol><li> Kultur menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) nach den Anweisungen des Herstellers. Wachsen HUVECs auf Fibronektin (FN) beschichteten Medien mit Gerichten (10 pg / ml, in demineralisiertem Wasser gelöst) (Endothelial Basal Medium (EBM-2)-Medium mit Endothelial Growth Medium (EGM-2) SingleQuots ergänzt). Verwenden Zellkultur zwischen 4-8 Durchgänge für Experimente. </li><li> Tag 1: Mantel Strömungskammern mit 100 ul Fibronectin (10 ug / ml in PBS) für mindestens 2 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Tag 2: Wenn die Zellen 80-90% Konfluenz trypsinize die Zellen nach sorgfältigem Waschen mit RT Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) pH-Wert 7,4, Zentrifuge bei 800 xg und resuspendieren bei 800.000 Zellen / ml mit Medien. Platte 80000 Zellen in jedem einzelnen Kanal der FN-beschichtete Flusskammern und sanft pipettieren die Zellsuspension auf und ab. Kultur O / N in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Tag 3: Aktualisieren Sie die Medien in der Durchflusskammer-Rutsche durch leichtes Kippen des Schiebe in einem 45 ° Winkel. (Siehe Abbildung 1a). HINWEIS: Es wird empfohlen, die Medien nur in den Behältern und nicht in den Kanal selbst zu entfernen. Entfernen der Medien in den Kanälen kann in Endothelzellen Verlust und Tod aufgrund der Spannkraft der durch Pipettieren verursacht Medien führen. </li><li> Überprüfen durch Phasenkontrastmikroskopie, wenn die Endothelzellen haben eine Monoschicht (dh 100% konfluent) gebildet ist. Wenn die Zellen nicht 100% konfluent, ändern Sie die Medien zwei Mal pro Tag, bis sie 100% Konfluenz erreichen. </li><li> Sobald die Zellen Konfluenz erreicht, stimulieren die Zellen mit den Medien (siehe Schritt1,1), enthaltend Entzündungsmediator (TNF-α (10 ng / ml)). Stimulierung HUVECs O / N (dh 12 Stunden) mit TNF-α zu einer entzündlichen Phänotyp des Endothels, dh. Hochregulierung von Zelladhäsionsmolekülen wie ICAM-1 und VCAM-1-13. </li></ol> 2. Polymorphkernige Leukozyten Isolierung mithilfe Percoll Gradienten <ol><li> Bereiten N-2-Hydroxyethyl-N&#39;-2-ethansulfonsäure (HEPES) -Puffer (nachfolgend: flow-Puffer), bevor die Isolierung neutrophilen Granulozyten (PMN). Flow-Puffer verwendet wird, um isolierte PMN waschen und als Puffer in der Flow-Assay. Die Bereitstellung Flusspuffer: 7,72 g NaCl (132 mM), 4,76 g HEPES (20 mM), 0,45 g KCl (6 mM), 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) in 1 l entmineralisiertem Wasser gewaschen und auf pH 7,4 (das Lager kann bei 4 ° C mehrere Wochen lang aufbewahrt werden). </li><li> Frisches 100 ul 1 M CaCl 2 &amp; #160, (1 mM), 2,5 ml Humanalbumin aus einer 200 g / L Stammkonzentration (0,5% v / v) und 0,1 g Glucose in 100 ml (0,1% w / v) der Fließpuffer. Als nächstes filtert die Strömungs Puffer unter Verwendung eines 0,45 um-Filter. HINWEIS: Diese Flusspuffer muss frisch für jeden Versuch vorbereitet werden. </li><li> Vor der Isolierung von PMN, bereiten 10% Trinatriumcitrat (TNC)-Lösung in PBS, pH 7,4. </li><li> Sammle 20 ml Vollblut in Natrium-Heparin vacuettes von einem gesunden Freiwilligen. Verdünnte Gesamtblut 1: 1 mit 10% PBS / TNC in 50 ml-Röhrchen und Pipette 20 ml verdünntem Blut vorsichtig auf 12,5 ml Percoll (ein 23% (w / w) kolloidalen Lösung in Wasser mit einer Dichte von 1,130 g / ml) in einer neuen 50-ml-Tube. Die Rohre in der Zentrifuge vorsichtig und Spin für 20 min bei 800 xg mit geringer Beschleunigung und ohne Unterbrechung bei RT gesetzt. HINWEIS: Bei der Zugabe der verdünnten Blut in den Percoll, kippen Sie das Percoll haltige Rohr in einem Winkel von 45 ° und sanft pipettieren Das verdünnte Blut in der Tube Witzh die langsamste Einstellung Pipette Junge. </li><li> Entfernen Sie alle flüssigen und anschließend das Rohr mit eiskaltem Erythrozytenlyse-Puffer (4,15 g NH 4 Cl [0.155 m] 0,5 g KHCO 3 [0.01 M] und 18,5 mg EDTA (Triplex-III) [0,1 mm] 500 ml füllen eiskaltem H 2 O), um Erythrozyten zu lysieren. Lassen Röhrchen auf Eis gelegentlich Umdrehen des Röhrchens, bis die Suspension wird dunkel rot, gefolgt von Zentrifugation 500 g für 5 min bei 4 ° C mit Unterbrechungen aktiviert. HINWEIS: Die Pelletfraktion enthält die PMNs (Neutrophile, Eosinophile, Basophile), zusammen mit den Erythrozyten. </li><li> Überstand entfernen und zweimal waschen Pellet in eiskaltem Lyse-Puffer bei 500 g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Das Pellet mit strömungs Puffer bei RT und bestimmen, PMN-Konzentration entweder mit einer Zählkammer oder automatisierte Zellzähler. Suspendieren die PMN in Fluss Puffer bei 1 x 10 6 Zellen / ml und halten bei RT. </li></ol> 3. Kennzeichnung von Endothelial Junctional VE-Cadherin und PECAM-1 <ol><li> Hinzufügen des PECAM Alexa Fluor 647-Antikörper (Klon WM59) in einer 1: 100 Verdünnung und der calciumunabhängige VE-Cadherin-FITC-Antikörper (Klon 55-7H1) bei einer Verdünnung von 1:50 zu HUVEC-Kulturmedium (siehe Schritt 1.1), und Inkubation für 30 min vor dem Start des Fluss Experiment junctional Dynamik von Endothelzellen während der Neutrophilen-Transmigration unter physiologischen Flussbedingungen zu visualisieren. Hinweis: Vor dem Hinzufügen der direkt markierten Antikörpern zu den Strömungskammern, sicherzustellen, dass das Volumen in jedem Kanal hat 100 ul betragen. Dies hilft, die Antikörper Kosten so niedrig wie möglich. </li></ol> 4. PMN TEM-Assay unter Fluss <ol><li> Platzieren Sie die PMNs in einem Wasserbad für 15 min bei 37 ° C vor der Injektion von ihnen in den Durchflusssystem. </li><li> Schließen Sie den Schlauch an einem leeren Flusskammer und füllen mit warmem (zB 37 ° C) Durchflusspuffer (siehe Schritt 4.3), um die Bildung von Luftblasen zu verhindern, bei der Einrichtung the Flusssystem. </li><li> Eine Seite eines leeren Flusskammer in der Spritzenpumpe Strömungssystem durch Verwendung von Silikonschlauch, die einen 20-ml-Spritze, und legte die Strömungskammer in den Mikroskoptisch. </li><li> Die andere Seite eines leeren Flusskammer zu dem Reservoir Kolben mit 37 ° C Vorlauf-Puffer (Abbildung 1B) gefüllt und starten Sie die Spritzenpumpe, um alle Schläuche mit Durchfluss-Puffer zu füllen. Die Pumpe wird die Strömungs-Puffer aus dem Reservoir durch die Durchflusskammer in die Spritze zu ziehen. Hinweis: Dieser Schlauch enthält auch eine in-line Luer Injektionsöffnung, die PMNs mit einer Nadel in einen laufenden Versuch injiziert werden können, ohne den Durchfluss und die Entstehung von Luftblasen. </li><li> Das leere Flusskammer mit dem Strom-Kammer, die TNF-α-behandelten HUVECs ersetzen, schließen Sie das Flusspuffer haltigen Schläuche und legen Sie sie in den Mikroskoptisch (Abbildung 1c). Kneifen Sie die Rohre vor Trennen und Wiederverbinden derm mit den Kammern, welche die HUVECs, als nicht Abquetschen kann bei der Bildung von Luftblasen im Schlauch und / oder Strömungskammern führen. </li><li> Einstellen der Strömungsgeschwindigkeit auf 1 dyn / cm 2 in Übereinstimmung mit physiologischen Strömungsgeschwindigkeit in post Venolen (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Rekorddifferentialinterferenzkontrast (DIC), FITC (488 nm) und Alexa Fluor 647 (647 nm) gleichzeitig mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. </li><li> Spritzen Sie die PMN über die In-Line-Luer Injektionsöffnung (1D) mit 1 ml-Spritzen (Schritt 4.1) langsam in den Flow-System. </li><li> Nach ein paar Minuten, Leukozyten erscheinen, haften und transmigrate. Stoppen Sie das Experiment zu jedem beliebigen Zeitpunkt durch Abschalten der Schlauch von der Durchflusskammer und Pipettieren Fixierungsmittel (3,7% Formaldehyd in PBS) in die Durchflusskammer. Erlauben Fixierung für 10 min durch Waschen mit PBS. Daten werden mit Imaging-Software (siehe Materialien und Ausrüstung Tabelle) analysiert. HINWEIS: Führen Sie die er-Experiment mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer Klimakammer ausgestattet mit einer konstanten Temperatur bei 37 ° C, 5% CO 2 und eine 63X Öl-Ziel. </li></ol>

<ol>
	<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis--an+inflammatory+disease.">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Szekanecz, Z., Koch, A. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li><li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains.">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Aus diesem Protokoll ist es wichtig, die Bildung von Luftblasen in den Strömungskammern zu verhindern, da dies in Zell-Apoptose und eines gestörten Einzelschicht führen. Um dies zu vermeiden, möchten wir betonen, besonderes Interesse auf die Schritte 4.2 und 4.5, in denen die Rohre auf die Strömungskammer angeschlossen bezahlen. Ein weiterer wichtiger Schritt im Protokoll ist das Priming der PMNs, die bei Raumtemperatur durch Inkubation für 15-30 Minuten bei 37 ° C vor dem Einspritzen zu der Strömungskammer (Schritt 4.1) gehalten sind. Dies führt bei der Grundierung von Leukozyten-Integrine, so dass sie auf Adhäsionsmolekülen wie ICAM-1 oder VCAM-1 auf dem Endothel anhaften. Dieses Protokoll ist nicht auf die Transmigration von Neutrophilen zu studieren. Auch andere Leukozyten Typen wie Monozyten oder Lymphozyten verwendet werden. Beachten Sie, dass Schritt 4,1, dh, Grundieren der Leukozyten zwischen Leukozyten-Typen unterscheiden. Es können auch andere Arten von Endothel-Zellen verwendet werden. Für diese kritische bleibtdie Endothelzellen mit geeigneten Entzündungsreize wie TNF-α oder IL-1β stimuliert. Wenn Neutrophile nicht in transmigrating reagiert, kann man überlegen Behandlung der Neutrophilen kurz (5 Minuten) mit N-Formyl-L-Methionyl-L-Leucyl-L-phenylalanin (fMLP) Peptid 16. Dadurch werden die Neutrophilen noch weiter zu fördern, insbesondere deren Integrine, was sie anfälliger für am Endothel haften. Typischerweise 1 dyn / cm 2 Fließgeschwindigkeit verwendet wird. Diese Strömungsgeschwindigkeit wird in der Post-Venolen, Websites, auf denen die meisten Leukozyten transendotheliale Migration tritt 17 gemessen. Verwendung der beschriebenen Strömungskammern ist es möglich, Strömungsgeschwindigkeit bis zu 10 dyn / cm 2 zu erhöhen. Es wird jedoch nicht empfohlen, um die Scher weiter zu erhöhen. Es kann zu unerwünschten Leckage von dem Schlauch und Ablösung der Zellen von der Strömungskammer führen. Die in 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass dieseAntikörper können verwendet werden, zu visualisieren und zu untersuchen, die Dynamik der endothelialen Zell-Zell-Übergänge während der Leukozyten-Diapedese werden. Insbesondere, zusätzlich zu den bestehenden Trans Assays Dieses Protokoll erlaubt es, parazellulären von transzellulären Migration unter physiologischen Flussbedingungen in Echtzeit zu unterscheiden. Da die Antikörper färben die Zell-Zell-Verbindungen, kann man die Anzahl der Leukozyten, die VE-Cadherin / PECAM-1-positiven Kreuzungen überqueren gegen kraft VE-Cadherin / PECAM-1-Stellen punkten. Auf diese Weise transzellulären Migration von parazellulären Migration unterschieden werden. Es ist wichtig zu unterstreichen, dass diese Antikörper nicht mit der Funktion der Proteine ​​zu binden, stören sie: die PECAM-1-Antikörper, die in dieser Studie verwendet wird, gegen die zweite extrazelluläre Domäne gerichtet. Endothelzellen, die in Gegenwart des Antikörpers plattiert wurden keine Defekte in Verstreuen oder Bilden einer Monoschicht zeigen, was darauf hindeutet, dass der Antikörper zumindest nichtstören homotypische Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen. Darüber hinaus, müssen beide Antikörper die Fähigkeit von Neutrophilen an Endothelzellen durch die Monoschicht zu migrieren beeinträchtigen. Zusätzlich wird die Anzahl von Neutrophilen, die durch die endotheliale Monoschicht in der Abwesenheit oder Anwesenheit der Antikörper transmigrieren nicht verändert (Daten nicht gezeigt). Wichtig ist, gibt uns der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie die Möglichkeit, verschiedene Fluoreszenzkanäle und DIC gleichzeitig aufnehmen. Somit ermöglicht dieser Test die Untersuchung der Dynamik von VE-Cadherin und PECAM-1 bei der gleichen Zeit, wenn eine neutrophile kreuzt die endothelialen Zell-Zell-Übergang und wird helfen, zu verstehen, warum Leukozyten wählen eine Strecke über die andere, dh gegenüber transpara.

Effiziente und streng kontrollierten Leukozyten transendotheliale Migration (TEM) ist von zentraler Bedeutung bei physiologischen Prozessen wie der Immunüberwachung und akute Entzündungen. Jedoch unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen, unkontrollierte und übermäßige TEM beobachtet, was zu chronischen entzündlichen Erkrankungen (zB rheumatoide Arthritis, Arteriosklerose, Asthma). Auch während der Tumorzellmetastasierung, ist der Prozess der transendothelialen Migration Instrumental für Tumorzellen, um die Zirkulation zu metastasieren 1-3 zu verlassen. Um speziell mit übermäßiger Leukozyten oder Tumorzell TEM stören, ist ein detailliertes Verständnis der Regulation dieses Prozesses erforderlich. Es wird angenommen, daß die TEM-Prozess durch verschiedene Schritte auftritt. Samen Studien, die von Butcher und Springer überprüft vor zwei Jahrzehnten, führte zu dem mehrstufigen Modell den Prozess der TEM 4,5 beschreibt. Dieses Modell gilt immer noch, auch wenn einige adliche Schritte wurden aufgenommen, 6. Alon et al. Die Notwendigkeit für das Vorhandensein immobilisierten Chemokinen auf der Oberfläche des Endothels 7. Kürzlich zeigten sie, dass das Endothel selbst erzeugt Chemokine, die an der endothelialen apikalen Oberfläche 8 dargestellt sind. Darüber hinaus setzen die gleiche Gruppe nach vorne die Bedeutung der Strömungsverhältnisse während der TEM-7. Kürzlich, können mehrere Publikationen zu den zwei verschiedenen Wegen Leukozyten konzentriert in der letzten Phase der TEM Diapedesis nehmen. Sie können entweder über die Zell-Zell-Verbindungen gehen, dh der parazellulären Migrationsroute, oder quer durch die endotheliale Zellkörper, wie der transzellulären Migration Route 9 bekannt. Carman und Kollegen untersuchten diese Wege im Detail und folgerte, dass Leukozyten bevorzugt wählen Sie die parazellulären Migrationsroute (90%) über den transzellulären Weg (10%) beim Überschreiten einer Nabelvenen-Endothelzellen Monolage 10.Wenn jedoch Endothelzellen aus anderen Ursprungs verwendet wurden, zB Gehirn oder Mikrogefäß, verwendet mehr Leukozyten den transzellulären Weg (30%) 11. Die Vestweber Gruppe kürzlich gezeigt, dass, wenn die Zell-Zell-Übergänge konnten voneinander durch Verwendung eines Knock-in-Tiermodell ersetzt endogenen dissoziieren VE-Cadherin für ein VE-Cadherin-Catenin alpha-Chimäre wurde Leukozyten TEM vollständig blockiert 12 . Überraschenderweise stellten die Autoren fest, dass TEM wurde in mehreren blockiert, aber nicht allen, Geweben. Insgesamt zeigen diese Experimente, dass Leukozyten elegant bevorzugt den parazellulären Weg über den transzellulären Weg, auch wenn die regulatorischen Signale, die diese Entscheidung auslösen, sind noch unbekannt. Auch wenn die Mehrheit der Leukozyten bevorzugen den parazellulären Migrationsroute, ist es immer noch schwierig ist, zwischen beiden Wegen zu unterscheiden. Hinzu kommt, dass, obwohl mehrere Studien, die die Rolle der endothelialen Zell-Zell junctIonen, die Dynamik dieser Kreuzungen, insbesondere die Junction-Proteine ​​VE-Cadherin und PECAM-1, während Leukozyten-Überfahrt ist noch immer umstritten. Wir entwickelten einen relativ einfachen Test, bei dem diese Verbindungsstelle Moleküle können in Echtzeit während der Leukozyten-Diapedese unter physiologischen Flussbedingungen unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern überwacht werden. Diese Antikörper nicht stören oder blockieren junktionale Integrität oder Mobilität der Zielproteine. Dieser Test ermöglicht es uns, die Dynamik von Proteinen junctional während des Prozesses der parazellulären TEM folgen. Darüber hinaus ermöglicht dieser Test auch Unterscheidung zwischen den para und transzellulären Migrationsrouten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

Während der Entzündung, lassen Leukozyten den Kreislauf und über die Endothel zu kämpfen eindringende Krankheitserreger in das darunter liegende Gewebe. Dieser Prozess wird als Leukozyten transendotheliale Migration bekannt. Zwei Wege zur Leukozyten an das Endothel-Monoschicht durchqueren wurden beschrieben: die parazelluläre Route, dh durch die Zell-Zell-Übergänge und dem transzellulären Weg, dh durch die endotheliale Zellkörper. Jedoch ist es technisch schwierig, zwischen dem Parameter und transzelluläre Route unterscheiden. Wir entwickelten eine einfache in vitro-Test, um zu studieren die Verteilung der endogenen VE-Cadherin und PECAM-1 während der Neutrophilen transendotheliale Migration unter physiologischen Flussbedingungen. Vor der Perfusion Neutrophilen wurden Endothelzellen kurz mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen VE-Cadherin und PECAM-1 behandelt. Diese Antikörper nicht mit der Funktion beider Proteine ​​stören, wie durch elektrische Zell Substra bestimmtte Impedanz-Mess und FRAP-Messungen. Unter Verwendung dieses Tests konnten wir folgen die Verteilung der endogenen VE-Cadherin und PECAM-1 während transendotheliale Migration unter Flussbedingungen und zu unterscheiden zwischen den para und transzellulären Migrationsrouten der Leukozyten durch das Endothel.

Zunächst überprüft, wenn die Antikörper nicht mit der Barrierefunktion des Endothels stören. Wir messen den Widerstand der endothelialen Monoschichten mit Hilfe elektrischen Zell-Substrat-Impedanz-Mess (ECIS). Details siehe Van Buul et al. Keine 13 Widerstandsänderung beobachtet wurde, wenn die Anti-VE-Cadherin-fluoreszenzmarkierten Antikörper wurde zu den Zellen (2A) aufgenommen. Ein Anti-VE-Cadherin-Antikörper, gut erkannt zu Block VE-Cadherin-Funktion reduziert den Widerstand drastisch (Abbildung 2A). Auch die für die Bildgebung verwendet werden, nicht die Dynamik zu ändern VE-Cadherin-Antikörper, wie durch Messung der Fluoreszenzerholung nach Photobleaching (FRAP) der bewerteten VE-Cadherin-GFP (2B). Nach 1-2 min, Neutrophilen an aktivierten endothelialen Monoschicht anhaftet als könnte im DIC Kanal (3A) dargestellt werden. Nach kriechen 5-30 sec, die große Mehrheit der Neutrophilen transmigrierten durch die endothelialen Monoschicht durch die Zell-Zell-Verbindungen, die mit den gegen PECAM-1 gerichteten Antikörper markiert waren und VE-Cadherin. Während des Prozesses der Diapedese, die Verteilung der VE-Cadherin und PECAM-1 wurde in Echtzeit (3B) folgt. An den Standorten der Neutrophilen-Diapedese, VE-Cadherin wurde lokal gestört und PECAM-1 zeigte eine ringartige Struktur. Nach Beendigung der Diapedese, die Verbindungsstellen nahe und VE-Cadherin und PECAM-1 deutlich an den Stellen der Diapedese (3C) verlagert. Man beachte, dass Teile des Anti-PECAM-1-Antikörper wurden an der Oberfläche der Neutrophilen nachgewiesen, wenn die Neutrophilenzahl erreichte die basolaterale Seite des Endothels. Dies führte jedoch nicht verhindern, dass Neutrophile aus der Überquerung des Endothels. Die beobachtete Dynamik der VE-Cadherin in Echtzeit während der Neutrophilen transendotheliale Migration waren in Übereinstimmung mit der Arbeit von Shaw und Kollegen, diezeigte, mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und VE-Cadherin-GFP-transfizierten Endothelzellen, die VE-Cadherin-GFP seitlich diffus, wenn Leukozyten querte die endotheliale Zell-Zell-Verbindungsstellen 14. Arbeiten auch von Su und Mitarbeiter unterstrich unsere Beobachtungen von PECAM-1. Sie zeigten, dass neben lateralen VE-Cadherin Diffusion auf Leukozyten Passage wurde PECAM-1 lokal in einem Ring um die transmigrating neutrophilen 15 verteilt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> Abbildung 1. In-vitro-Flusskammer. (A) Der Pfeil zeigt das Reservoir, aus dem das Medium muss aktualisiert werden. (B) Silikonschlauch, der die Strömungskammer mit dem in-line Luer Einspritzöffnung zum Einspritzen von PMNs ohne Lösen der Rohrleitung (Pfeilspitze) verwendet verbindet. (C) ConnReflexion eines leeren Flusskammer zu dem Reservoir Kolben mit 37 ° C Vorlaufpuffer (Pfeilspitze) gefüllt. (D) Verbindung der Strömungskammer mit dem TNF-α-behandelten HUVECs zur Strömungs-Puffer enthaltenden Schlauch und in dem Mikroskoptisch (Pfeilkopf) angeordnet ist. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. VE-Cadherin Antikörper nicht mit Junction-Dynamik oder die Funktion stören. (A) Endothelial Zellschicht Impedanz wird mit ECIS gemessen. Y-Achse drückt Impedanz in Ohm und x-Achse die Zeit in Stunden. VE-Cadherin-Antikörper Klon 55-7H1, mit Alexa647 (blaue Linie) markiert oder Isotyp IgG-Alexa647 Kontrolle (rote Linie) nicht endothelialen Zellschicht Impedanz nicht verändern, während die VE-Cadherin-blockierenden Antikörper CL75 (schwarze Linie) haben reduzieren die Impedanz . (B </strong&gt;) VE-Cadherin-GFP wurde in HUVEC exprimiert und FRAP-Analyse unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie zeigte keine Änderung in der Wiederherstellung der Fluoreszenz in der Gegenwart oder Abwesenheit der VE-Cadherin-Antikörper 55-7H1. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3 VE-Cadherin und PECAM-1-Verteilung während Neutrophilen TEM in Echtzeit. (A) Neutrophile (mit weißer Linie gekennzeichnet) auf dem Endothel anhaften und über den Zell-Zell-Übergang, ohne die Verteilung der VE-Cadherin und PECAM -1. (B) über den Neutrophilen-Endothel-Monoschicht durch die Zell-Zell-Verbindungen. Eine lokale Dispersion der VE-Cadherin und PECAM-1 kann beobachtet werden, wenn eine Neutrophilen durch Zell-Zell-Junctions vorsteht. Weiße Linie zeigt Neutrophilen Gegenwart noch an der Spitze des Endothels. Gelbe Linie zeigt Neutrophilen Membran that ist bereits unter Endothel. (C) Neutrophile vollständig überquerte die endothelialen Monolayer. VE-Cadherin und PECAM-1 werden an den Standorten der Diapedese verlegt. Gelbe Linie zeigt Grenzen der transmigrierten Neutrophilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden.

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

19.5K Aufrufe.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam.  Leukozyten überqueren die endothelialen Monolayer mit Hilfe der parazellulären oder transzelluläre Route. Wir haben einen einfachen Test zu folgen die Verteilung endogener junctional VE-Cadherin und PECAM-1 während Leukozyten transendotheliale Migration unter physiologischen Fluss zwischen den beiden Seelenwege unterscheiden. 

Serie: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Real-time Imaging von Leukotrien B 4 Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Echtzeit-Bildgebung und Quantifizierung der Pilz Biofilm-Entwicklung mit einem Zweiphasensystem rezirkulierenden Flow

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Echtzeit-Bildgebung von Zell-Zell-Endothelial Junctions Während Neutrophile Transmigration unter physiologischen Fluss

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Real-time Imaging von Leukotrien B₄ Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin