Elektronenmikroskopie Arbeit bei Cheng Labor wird zum Teil durch Zuschüsse aus NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 und P50GM082250 (zu A. Frankel)), und einen Zuschuss von UCSF Programm der Durchbruch Biomedical Research, Opportunity Award und New Technology Award zu unterstützen.

1. Vorbereitung der EM-Gitter für Kohlenstoff-Beschichtung <ol><li> Füllen Sie einen großen Becherglas mit destilliertem Wasser. </li><li> Verwenden Sie eine Glaspipette auf einen einzigen Tropfen Kollodium (~ 20 &amp;mgr; l, 2% in Amylacetat, Electron Microscopy Sciences, PA, USA) auf der Oberfläche des Wassertropfens. Collodion wird sich ausbreiten, um eine dünne Kunststoffschicht auf der Wasser / Luft-Oberfläche bilden; Hinweis: Eine erste Tropfen Collodium kann verwendet werden, um die Wasseroberfläche von einer Staubpartikel klar sein. Nach dem Entfernen der Folie von den ersten Tropfen, wird die Wasseroberfläche frei von Staub. </li><li> Legen EM-Gitter, 400 oder 200 mesh Gilder Cu Netze von Ted Pella Inc. (USA), einer nach dem anderen auf die Kunststoffschicht schwimmt auf der Wasseroberfläche gekauft; wir in der Regel Platz 50 ~ 100 Netze in einer dichten Packung Muster, mit der glänzenden Seite der Startaufstellung nach unten in die Kunststoffschicht (Abb. 1A). Hinweis: 400 mesh Gitter sind gut für die Routine negativen Fleck EM-Gitter, während 200 mesh Gitter sind gut für das Sammeln kippen Paar Bilder. </li><li> Schneiden Sie einen Kuchence von Papier mit den Abmessungen etwas größer als der Bereich, in dem Gitter auf der Kunststoff-Schicht aufgebracht werden. Legen Sie das Papier vorsichtig auf der Oberseite des Gitters (Abb. 1B), und warten, bis das Papier wird komplett nass (Abb. 1C). Hinweis: Verschiedene Arten von Papier haben unterschiedliche Wasseraufnahme Raten. Es ist wichtig, dass das Papier nimmt kein Wasser zu schnell. Zum Beispiel, ist eine regelmäßige Filterpapier nicht gut für diesen Zweck, da es Wasser aufnimmt zu schnell und macht eine Menge von Falten. Die Carbon-Folie von zerknittertes Papier gemacht ist nicht flach, und somit nicht gut für das Sammeln kippen Paar Bilder für zufällige konische Neigung 3D-Rekonstruktion. Man muss verschiedene Papiere Test, eine geeignete zu finden. In unserem Labor haben wir mit Papieren aus Notizblöcke aus lokalen Lebensmittelgeschäft gekauft. Manchmal ist das Zeitungspapier war auch als geeignet erwiesen. Eine weitere Möglichkeit ist die relative dicke Reispapier für chinesische / japanische Kalligraphie verwendet wird. </li><li> Schnell machen Einschnitte auf der Kunststoff-Folie rund um und in der NäheDie eingeweichte Papier. Unmittelbar danach, verwenden Sie eine Zange zu holen das Papier mit der Stromnetze zwischen den Kunststoff-Folie und Papier eingeklemmt. Legen Sie das Papier in einer Petrischale mit dem Gitter nach oben für die Lufttrocknung (Abb. 1D); Hinweis: Es ist wichtig, damit das Papier an der Luft trocknen. Trocknung zu schnell erzeugt viele Falten im Papier. </li></ol> 2. Carbon-Beschichtung Gitter <ol><li> Die Kohlenstoff-Beschichtungsanlage in unserem Labor verwendet eine Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon-Coater (Ted Pella). Unser System ist mit einem Cressington Schichtdicke Monitor, der die Dicke des beschichteten Kohlenstoff-Film basiert auf dem Prinzip, dass die Schwingungsfrequenz eines Quarz von der Masse eines abgeschiedenen Films auf seiner Oberfläche verändert Maßnahmen ausgestattet. Die beschriebenen Protokoll hier nicht erforderlich eine Stärke zu überwachen, da sie oft nicht in jedem Labor zur Verfügung. </li><li> Schärfen eines Kohlestab mit einem Spitzer (Ted Pella) und laden Kohlestäbe in Kohlenstoffbeschichtung machine (Abb. 2A). Zwei Stäbe, mit einer scharfen Spitze und das andere mit einem flachen Ende gegeneinander gestellt. </li><li> Anlegen von Vakuum Fett auf die Hälfte der mattierten Fläche von einem Glasträger und legen Sie sie neben dem Gitter (Abb. 2B). Nur die Hälfte der mattierten Fläche der Glasplatte sollte mit Vakuumfett abgedeckt werden. Hinweis: Die mit Vakuumfett wird sich nicht ändern Farbe nach Carbon-Beschichtung. Der Kontrast zwischen den angrenzenden Gebieten mit und ohne Vakuum Fett liefert eine Abschätzung der Dicke des beschichteten Kohlenstoff. </li><li> Legen Sie das Papier mit Gittern auf der Bühne des Kohlenstoff-Beschichtung Maschine. Legen Sie den Objektträger neben dem Gitter (Abb. 2C). Hinweis: Man kann auch zuerst übertragen Gitter mit der Kunststoff-Folie auf einen Glasträger beschichtet vor der Beschichtung, bei vielen Netzen fallen aus dem Papier. </li><li> Pump die Vakuumkammer und warten, bis das Vakuum erreicht ein Niveau von 10 -5 Torr. Hinweis: Beschichtung mit geringer Unterdruck erzeugt oft viele Funken, was zu vielen großen Kohlenstoff-Teilchen aufdas Netz. </li><li> Erhöhen Sie die aktuelle sehr langsam. Die scharfe Spitze der Kohlestab wird zuerst rot und dann weiß wie der Strom steigt. Schauen Sie nicht die hohe Helligkeit Spitze direkt mit dem bloßen Auge. Stoppen steigendem Strom, wenn die Beschichtung beginnt. Die Glasplatte wird Farbe von weiß zu grau ändern und dann dunkelgrau Licht. Die Dunkelheit der Folien korreliert die Dicke der Kohleschicht beschichtet. Schalten Sie den Strom aus der Beschichtung zu stoppen, wenn gewünschte Dicke erreicht ist (Abb. 2D). Anmerkung: 1) Nach wiederholten Kohlenstoff Beschichtungsverfahren beschichtet Kohlenstoff aus dem Inneren der Glasglocke konnte dunkler die Farbe. Dies macht den beschichteten Kohlenstoff-Film dicker erscheinen als es tatsächlich ist. 2) Eines geschärft Kohlestab kann für mehrere Beschichtung verwendet werden. Die Schärfe der Spitze allmählich nach jeder Beschichtung reduziert. Der maximale Strom wird durch die Schärfe der Kohlestab beeinflusst. Ein frisch gespitzten Stab mit kleinerem Durchmesser erfordert eine relativ niedrigereStrom zu Kohlendioxid verdampfen. Später Beschichtung erfordern etwas höheren Strom. </li><li> Vent der Vakuumkammer und entfernen Roste für die spätere Verwendung. Hinweis 1. Die genauere Methode zur Steuerung der Kohlenstoff Dicke wird durch die Verwendung einer Schichtstärke zu überwachen. Oder man kann qualitativ kalibrieren Farbe gegen die genaue Dicke des Monitors gemessen. Ein nützliches Kohlenstoff Dicke für diese Technik liegt zwischen 3 und 7 nm. </li></ol> Dies ist eine einfache und schnelle Methode, um eine große Menge an Kohlenstoff beschichtete Netze vorzubereiten, in der Regel ~ 100 Netze pro Präparat. Die Gitter enthalten eine dünne Kunststoffschicht, die in der Regel keinen Einfluss auf die Qualität der negativ gefärbten Bild. Allerdings sind Netze in diesem Verfahren hergestellte nicht geeignet für cryoEM. Diese Schicht aus Kunststoff kann durch Einweichen der Netze in Chloroform für mehrere Stunden entfernt werden. 3. Vorbereitung Uranyl Formiatlösung (0,75%) für negative Färbung EM. Das detaillierte Protokoll wurdebeschrieben bisher 5 <ol><li> Abwiegen 37,5 mg des Uranyl-formiat in ein kleines Becherglas; </li><li> 5 ml kochendem Wasser und rühren Sie für 5 Minuten im Dunkeln; </li><li> Add 10 &amp;mgr; l 5 M NaOH, weiter rühren 5 Minuten; </li><li> Filtern Sie die Lösung mit einer Spritze Filter (Fisherbrand, 13mm Spritzenfilter, 0,2 um, Nylon unsteril, Katalog-Nummer 09-720-5), und speichern Sie die filtrierte Lösung in einer 8ml Falcon-Röhrchen mit Alufolie bedeckt; Hinweis. Uranyl Formate Pulver kann von Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA), Bestellnummer 22451 bezogen werden. Uranyl Formiatlösung ist lichtempfindlich und sollte weg von direktem Licht gehalten werden, zum Beispiel durch das Abdecken der Falcon-Röhrchen mit Alufolie abdecken. Eine frisch hergestellte Lösung hat eine hellgelbe Farbe (Abb. 3A). Stain-Lösung kann auf der Bank für 1-2 Wochen aufbewahrt werden, bevor es ausfällt beginnt. Uranyl Formiat sauer mit einem pH ~ 4. Hinzufügen NaOH erhöht den pH-Wert, aber das Hinzufügen zu schnelloder im Überschuss kann dazu führen, den Fleck zu fällen. Neben der Erzeugung von Kontrast, Uranyl-formiat behebt auch das Protein Probe. Da die Fixierung Rate ist so schnell, den niedrigen pH-Regel keinen Einfluss auf die gesamte Proteinkonformationen oder Protein-Komplexbildung 7. </li></ol> 4. Protokoll für die Vorbereitung Negativfärbung EM Gitter. Dieses Protokoll wurde im Detail beschrieben bisher 5 <ol><li> Glimmentladung Kohlenstoff beschichtet Raster, mit PELCO easiGlow GlowDischarge System (Ted Pella Inc., USA). Die aktuelle Verwendung 15 mA und Gitter sind Leuchten für 30 Sekunden. Beachten Sie entladen. Glow-entladen Netze kurz nach Glühen Entladen verwendet werden sollte. Wir verwenden oft die Netze in weniger als 2 Stunden nach der Glimmentladung. </li><li> Legen Sie zwei 20 &amp;mgr; l Tropfen destilliertes Wasser und zwei 25 &amp;mgr; l Tropfen Uranyl Formiatlösung auf einem Stück Parafilm (Abb. 3B). </li><li> Halten Sie ein glow-entladen Gitter mit Reverse-force anti-Kapillare Pinzette mit dem Autobon-beschichteten Seite nach oben zeigt. Hinweis: Es ist notwendig, um anti-Kapillare Pinzette verwenden. Andernfalls wird flüssige Probe vom Gitter durch die Kapillarkraft zwischen der Zange angesaugt werden. </li><li> Übernehmen 2μl Protein Probe auf die glow-entladen Netz, und warten Sie 30 Sekunden. Hinweis: Die Wartezeit und die Länge der Glimmentladung Einfluss auf die Konzentration von Proteinen in das Gitter adsorbiert. Sehr verdünnte Proben erfordern längere Adsorptionszeiten. Allerdings kann eine längere Adsorption Änderung der Konzentration des Puffers, da Wasserdampf. Um eine ordnungsgemäße Partikelverteilung in Grid erfordert etwas Versuch und Irrtum-Methode. </li><li> Blot aus der Probe mit Filterpapier. </li><li> Berühren Sie das Grid Oberfläche eines Wassertropfens und dann anschließend das Wasser abtupfen mit Filterpapier. Wiederholen Sie mit dem 2. Tropfen Wasser. </li><li> Berühren Sie das Grid Oberfläche, um die ersten Tropfen Fleck kurz. Blot Sie den Fleck Lösung mit Filterpapier. </li><li> Berühren Sie das Grid Oberfläche auf den zweiten Tropfen Fleck für 20 Sekunden. Blot off Färbelösung mit Filterpapier. </li><li> Trocknen Sie die Gitter mit einem Vakuum. Hinweis: Man kann auch verlassen Gitter auf der Bank oder in einer chemischen Haube an der Luft trocknen. Der Vorteil der Vakuum trocken ist, dass man die Netze in der EM sofort zu beobachten. Die möglichen Artefakt durch schnelle Trocknung erzeugt ungleichmäßige Flecken. </li></ol> 5. Transmissions-Elektronenmikroskop <ol><li> Das Mikroskop in dieser Demonstration wird ein Tecnai T12 (FEI Company) mit einem Gatan 4K x 4K CCD-Kamera ausgestattet. </li><li> Kurz überprüfen Sie die Ausrichtung des Mikroskops vor dem Einsetzen Probe; Hinweis: Dies ist nur erforderlich, einmal pro EM-Sitzung. In einem Modell Mikroskop können nahezu perfekte Ausrichtung einer älteren Version gespeichert werden. Lädt eine solche Ausrichtung Datei sollte dem Mikroskop Ausrichtung auf eine nahezu perfekte Zustand wiederherzustellen. </li><li> Laden Sie die EM Gitter im Singleframe kippen Standard Probenhalter. </li><li> Legen Halter in CompuStage der T12. Warten Sie auf den Pumpzyklus in Anspruch nehmen. </li><li> Setzen Sie den Halter in die Spalte. &lt;/ Li&gt; <li> Fokus Probe und eine gewünschte Unschärfe, in der Regel-1.5um. Hinweis: Die Fokussierung kann entweder manuell durch Fokussierung mit dem minimalen Kontrast-Methode oder mittels CCD-Kamera Live-Bilder erfassen und berechnen leben Fourier Leistungsspektrum erreicht werden. </li><li> Rekord ein Bild mit CCD-Kamera; </li><li> In Bilder von negativ angefärbten Proteine ​​Proben, sind Proteine, oft mit Weiß-Kontrast, also weiß Dichte gegen einen dunkleren Hintergrund zu sehen. Beachten Sie, dass während der Protein-Konzentrationen in verschiedenen Bereichen des gleichen Raster sind in der Regel sehr ähnlich, man muss unterschiedliche Färbung in verschiedenen Bereichen des gleichen Raster zu beobachten. Manche Gebiete haben könnte ungleichmäßige Färbung oder sogar positive Färbung (Protein erscheint dunkel auf hellem Hintergrund), während einige andere Gebiete perfekte Fleck haben. Es ist oft notwendig, das Netz Suche auf einem guten Bereich für die Bildgebung zu finden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Beispiele für typische gute Bilder von negativ stainiert Proben, Pferd Ferritin (Abbildung 4A), Fab (4B), Archaea 20S Proteasom (Abb. 4C) und Nukleosomen (Abb. 4D), gezeigt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vorbereitung von Kohlenstoff Roste für negative Färbung EM. A) Plazierung EM-Gitter one-by-one in einer geschlossenen Verpackung Muster auf der Oberfläche von Kollodium Film. B) Platzierung ein Stück Papier etwas größer als die Fläche der Netze. C) Warten Sie, bis das Papier wird komplett nass. D) Nehmen Sie das Papier zusammen mit den Gittern für Luft-Trocknung. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" /> Abbildung 2. . Coating EM-Gitter mit Kohlenstoff-A)-Setup des Kohlenstoffs Verdampfer: Legen Sie die beiden Kohlenstoff-Stäbchen in der Beschichtungsanlage, mit einem Stab (links) geschärft zu einem Punkt Spitze. Die andere Stange (rechts) hat eine flache Oberfläche und kommen in Kontakt mit dem Punkt Spitze des einen in die entgegengesetzte side. B) Legen Sie eine kleine Menge Vakuumfett in einer Seite eines gefördert Glasträger. Der Bereich innerhalb des schwarzen Rahmens ist Vakuumfett. C) Setup der Netze für die Beschichtung. Die Glasträger werden verwendet, um das Papier in Position zu halten. Die Pfeilspitze zeigt den Bereich mit Vakuum-Fett. D) Nach der Beschichtung wird die Farbe der Folie mit Vakuum-Fett bedeckt nicht die Farbe. Der Kontrast zeigt die Dicke des beschichteten Kohlenstoff. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" /> Abbildung 3. Veranschaulichung der negativen Färbung. A) Frisch zubereitete (links) Uranyl Formiatlösung ist transparent, ohne Anzeichen von Niederschlägen. Nach 1 bis 2 Wochen Niederschläge beginnen, der sich in der unteren in die Boden des Röhrchens. B) Legen Sie zwei Tropfen (~ 25 &amp;mgr; l) aus destilliertem Wasser und zwei Tropfen Uranyl Formiatlösung in einem Stück Parafilm. Verwenden Sie ein Paar anti-Kapillare Pinzette, um einen Schein entlassen Kohlenstoff-beschichteten EM-Gitter mit Kohlenstoff Seite haltenup. Ein Tropfen der Probe (~ 2μl) ist in das Gitter gelegt. C) Nach einer Wartezeit von 30 Sekunden, trocknen Sie die Lösung mit einem Filterpapier. D) Flip Startplatz auf die Probe Seite des Gitters mit dem ersten Tropfen Wasser zu berühren. Wiederholen Sie den Schritt C und D, um den Prozess der Färbung abzuschließen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiele für EM-Bilder von negativ gefärbten Protein-Proben. A) Pferd Ferritin, B) Fragment des Antigen-Bindung (Fab), C) Archaea 20S Proteasom und D) Nukleosomen. Alle Bilder wurden mit der gleichen Vergrößerung aufgenommen. Der Maßstab ist 20nm.

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	<li>Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+near-atomic+resolution+in+single-particle+electron+microscopy.">The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).</li><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+cryo+electron+microscopy+of+macromolecular+complexes.">Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes.</a> Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).</li><li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Rabl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+gate+opening+in+the+20S+proteasome+by+the+proteasomal+ATPases.">Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases.</a> Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).</li><li>Zhao, F. Q., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining.">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).</li><li>Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+from+a+single-exposure,+random+conical+tilt+series+applied+to+the+50S+ribosomal+subunit+of+Escherichia+coli.">Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli.</a> J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).</li><li>Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+adjustment+of+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters.</a> J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).</li><li>Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+leukocyte+beta2+integrins+by+conversion+from+bent+to+extended+conformations.">Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations.</a> Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Negative Fleck EM ist ein leistungsstarkes Tool, mit dem 3D-Strukturen von gereinigtem Protein-Proben, wie z. B. die Verwendung zufälliger konische Neigung 8-Methode, die das Sammeln ein Paar Bilder mit einem von der Probe gekippt, um 60 ° und einer aus der gleichen Gegend erfordert Studie kann aber ungekippten, um 3D-Rekonstruktionen von makromolekularen Komplexen zu berechnen. Darüber hinaus, negative Färbung EM kann noch viele andere Anwendungen, wie zB Screening für zweidimensionale (2D) Kristalle von Membranproteinen 9, Visualisierung Protein-Komplexe in verschiedenen Konformationen 10, oder einfach nur zur Visualisierung von Homogenität und / oder Heterogenität von gereinigten Proteinen Probe so Bereitstellung von Rückmeldungen zum Proteinreinigung Verfahren zu verbessern, usw. Es kann ein leistungsfähiges Test für Biochemiker werden. In diesem Artikel haben wir die Protokolle von der Vorbereitung der Kohlenstoff-beschichteten Gitter zu sammeln Bilder von negativ angefärbten Protein-Proben in einem Elektronenmikroskop. Wie hier dargestellt,das Verfahren ist relativ einfach und leicht zu folgen. Wenn Sie versuchen, 3D-Rekonstruktionen der Probe durch zufällige konische Neigung Methode beobachtet zu berechnen, ist es notwendig, kippen Paar Bilder zu erwerben. Allerdings, wenn die Durchführung Einzelpartikelanalyse ist der Zweck, werden mehrere ungekippten Bilder ausreichen. In beiden Fällen ist eine weitere Bildverarbeitung erforderlich, und dies würde den Rahmen dieses video Artikel. Wie bei jeder Methode gibt es Änderungen an den Protokollen. Uranyl-formiat funktioniert sehr gut als eine negative Färbung Reagenz in den meisten Fällen. Uranylacetat ist eine weitere häufig eingesetzte Negativfärbung Reagenz. Es funktioniert sehr ähnlich wie Uranyl Formiat, aber mit einer größeren Korngröße und, in vielen Fällen einen geringeren Kontrast als Uranyl-Formiat. Der Vorteil der Verwendung Uranylacetat ist, dass die Lösung länger als Uranyl-formiat dauert. Man braucht nicht zu einer frischen Lösung vorzubereiten alle ein bis zwei Wochen. Beide Uranyl Formiat und Acetat sind sauer. Ein offensichtliches Problem ist, dass dieniedrigen pH-Wert können Veränderungen im Protein zu untersuchende Probe zu induzieren. Beide Flecken Lösungen funktionieren auch als Protein Fixiermittel. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass sowohl fix Protein-Proben schnell 7. Diese schnelle Fixierung macht die niedrigen pH-Wert weniger wichtig. Während des Prozesses der Färbung, fest ein Protein Probe wird vor dem niedrigen pH-Änderungen hervorrufen kann. Dennoch können andere negative Färbung Reagenzien, wie Ammoniummolybdat und Phosphorwolframsäure, bessere Ergebnisse für die Färbung Proben bei niedrigen pH-Wert ist ein für 7. Beide Ammoniummolybdat und Phosphorwolframsäure einen etwa neutralen pH-Wert, sondern der Kontrast der Protein-Proben von diesen Flecken erzeugt wird, in der Regel schlechter als Uranyl-Formiat.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Collodion </td><td> Electron Microscopy Sciences, PA, USA </td><td> 12620-30 </td><td> 30ml, 2% in Amylacetat </td></tr><tr><td> Gilder Cu Netze </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> G400/G200 </td><td> 400/200 mesh </td></tr><tr><td> Cressington 208C High Vacuum Turbo Carbon-Coater </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> 9260 </td><td></td></tr><tr><td> Doppel wies Carbon Stab </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> 58 </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl-formiat </td><td> Electron Microscopy Sciences, PA, USA </td><td> 16984-59-1 </td><td> 99,9% Reinheit </td></tr><tr><td> PELCO easiGlow GlowDischarge System </td><td> Ted Pella Inc., USA </td><td> 91000 </td><td> Kaufen Sie bei der örtlichen Apotheke </td></tr><tr><td> Whatman Nr. 1 Filterpapier </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-805E </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain em: from grid preparation to image acquisition

Einzelne Partikel-Elektronenmikroskopie (EM), der sowohl negative als auch gebeizt oder gefroren hydratisierten biologischen Proben, hat sich zu einem vielseitigen Werkzeug in der Strukturbiologie 1. In den letzten Jahren hat diese Methode großen Erfolg in Studium Strukturen von Proteinen und makromolekularen Komplexen 2, 3 erreicht. Verglichen mit Elektronen Kryomikroskopie (cryoEM), in dem gefrorenen hydratisierten Protein-Proben in einer dünnen Schicht aus glasigem Eis 4 eingebettet sind, ist negative Färbung eine einfachere Probenvorbereitung Methode, bei der Protein-Proben in einer dünnen Schicht aus getrocknetem Schwermetallsalz eingebettet sind zu erhöhen Probe Gegensatz 5. Die verbesserten Kontrast des negativen Fleck EM ermöglicht die Untersuchung von relativ kleinen biologischen Proben. Neben der Bestimmung von dreidimensionalen (3D) Struktur der gereinigten Proteine ​​oder Proteinkomplexe 6, kann diese Methode für viel breiter genutzt werden. Zum Beispiel, negative Färbung EM problemlos eingesetzt werden kann, um zu visualisieren gereinigtProtein-Proben, um Informationen wie Homogenität / Heterogenität der Probe, die Bildung von Protein-Komplexe und große Baugruppen, oder einfach, um die Qualität eines Proteins Vorbereitung zu bewerten. In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein vollständiges Protokoll für den Einsatz eines EM negativ gefärbten Protein Probe zu beobachten, von der Vorbereitung Kohlenstoff beschichtete Netze für negative Färbung EM auf den Erwerb Bilder von negativ gefärbten Probe in einem Elektronenmikroskop bei 120 kV Beschleunigungsspannung betrieben. Diese Protokolle haben in unserem Labor routinemäßig und lassen sich leicht um unerfahrene Anwender zu beachten.

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Visualizing Protein-Proben von negativen Fleck-Elektronenmikroskopie (EM) hat sich zu einem beliebten Strukturanalyse Methode. Es ist für die quantitative Struktur-Analyse nützlich, wie zum Beispiel die Berechnung einer 3D-Rekonstruktion der Moleküle untersucht, und auch für qualitative Prüfung der Qualität von Protein-Präparationen. In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Vorbereitung der EM-Gitter, Färbung der Probe und die Visualisierung der Probe in einem Elektronenmikroskop. Unerfahrene Benutzer können diese Protokolle einfach zu folgen und zu nutzen Negativfärbung EM als Routine-Test, zusätzlich zu anderen biochemischen Assays für die Bewertung ihrer Protein-Proben.

Visualizing Proteine ​​und Makromolekulare Komplexe von Negative Stain EM: von Grid Vorbereitung auf Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

visualizing-proteins-macromolecular-complexes-negative-stain-em-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

58.3K Aufrufe.  University of California San Francisco. Visualizing Protein-Proben von negativen Fleck-Elektronenmikroskopie (EM) hat sich zu einem beliebten Strukturanalyse Methode. Es ist für die quantitative Struktur-Analyse nützlich, wie zum Beispiel die Berechnung einer 3D-Rekonstruktion der Moleküle untersucht, und auch für qualitative Prüfung der Qualität von Protein-Präparationen. In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Vorbereitung der EM-Gitter, Färbung der Probe und die Visualisi...

Serie: Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Forschung

Biotechnik

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Herstellung von Hydroxy-PAAm Hydrogele zur Entkopplung der Auswirkungen von Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

In Vitro Modell der menschlichen kutanen hypertrophen Narbenbildung mit makromolekularer Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der zellulären Inkorporation und des anschließenden biologischen Abbaus chemisch synthetisierter Eisenoxid-Nanopartikel

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Visualizing Proteine ​​und Makromolekulare Komplexe von Negative Stain EM: von Grid Vorbereitung auf Image Acquisition

Visualizing Proteine und Makromolekulare Komplexe von Negative Stain EM: von Grid Vorbereitung auf Image Acquisition