Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation - Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.

1. hiPSC Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen <ol><li> Wachsen und zu expandieren hiPSCs in menschlichen embryonalen Stammzellen (HES) Medien (Tabelle 1) co-kultiviert auf einem embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Schicht, bis große (aber subkonfluente) Kolonien über eine Embryoidkörper (EB) Zwischen bereit für neuronale Differenzierung (Abbildung 2). Routine hiPSC Kulturbedingungen sind an anderer Stelle beschrieben, 16,17; kurz, wachsen hiPSCs in HES Medien auf einem MEF Feeder-Schicht bis zur Konfluenz, dann enzymatisch Gang mit Kollagenase (1 mg / ml in DMEM) und erweitern etwa 1: 3 alle 7 Tage. </li><li> Um Poly-L-Ornithin / Laminin beschichteten Platten, Kleider Platten mit 10 in sterilem Wasser für Kunststoffoberflächen (50 g / ml für Glasoberflächen) vorzubereiten g / ml Poly-L-Ornithin und Inkubation bei Raumtemperatur für 3-24 Stunden. Mindestens einmal für 3-24 h Waschen mit sterilem Wasser und anschließend mit 5 g / ml Laminin in sterilem PBS bei RT. HINWEIS: Wenn in Plastik verpackt, Platten kannfür bis zu sechs Monate bei -20 ° C gelagert. </li><li> An Tag 1, enzymatisch heben subkonfluenten hiPSCs (im allgemeinen auf MEFs aufgezogen oder hiPSCs in definierten Medien wie TeSR 18 auf Matrigel gezüchtet) von der Platte als große Kolonien mit 1 mg / ml Collagenase IV in DMEM / F12. HINWEIS: Nach 1-2 h Inkubation bei 37 ºC wurden Kolonien werden in die Schüssel zu schweben. </li><li> Behutsam hiPSC Kolonien (durch Absetzen, nicht Zentrifugation) 1-2x mit DMEM / F12, Resuspension in 2 ml / Vertiefung von N2 / B27 Medien (Tabelle 1) und die Übertragung auf nicht-haftenden Schalen mit 6 Vertiefungen (kombinieren 3-Brunnen in 1 -gut) 19. HINWEIS: Über Nacht wird Kolonien schwebenden sphärischen Cluster zu bilden als &quot;Embryoid Bodies&quot; (EVG). Erwarten erhebliche Zelltod. </li><li> Am Tag 2, Neigung Platten und ermöglichen EVG zu begleichen. Medien vorsichtig heraus und einmal abwaschen mit DMEM / F12, um Schmutz zu entfernen. Vorschub mit N2 / B27 Medien mit Dual SMAD-Hemmer (0,1 M LDN193189 und 10M SB431542) 12 ergänzt </sup&gt;. </li><li> An den Tagen 3-7, wird neuralization im Rahmen der dualen SMAD Inhibierung auftreten; überprüfen Sie, ob EVG sind rund, aber nicht zystische. Futter EVG jeden zweiten Tag mit N2 / B27 Medien mit 0,1 M LDN193189 und 10M SB431542 ergänzt. </li><li> An den Tagen 7-14 nach Beschichtung von EVG an Poly-L-Ornithin / Laminin beschichteten Platten, überprüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, dass neuronale Rosetten beginnen, innerhalb von wenigen Tagen erscheinen (gekennzeichnet als runde Clustern Neuroepithelzellen mit apikal-basal Polarität; Abbildung 1). Weiter zur adhärenten EVG jeden zweiten Tag mit N2 / B27 Medien mit 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 und 1 g / ml Laminin ergänzt ernähren. </li></ol> 2. Harvest of Neural Rosetten HINWEIS: Wir empfehlen, dass neuronale Rosetten enzymatisch unter Verwendung von Neural Rosette Selektionsreagenz 20 oder ähnliche Selektionsreagenz geerntet werden. Obwohl neuronale Rosetten manuell in 6-Well-Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Platte, thi abgeholt werdens Methode nimmt eine umfassende Ausbildung zu meistern, und, abhängig von Benutzer Geschick, kann eine zweite Runde der Kommissionierung am Tag 20 zu bereichern für NPCs und Abbau nicht-neuronalen Zelltypen erfordern. <ol><li> Für enzymatische Auswahl an neuronalen Rosetten am Tag 14, absaugen Medien aus halten EVG und 1 ml neuronalen Rosette Selektionsreagenz pro Vertiefung für eine 6-Well-Platte. Bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Mit einem Pipetman P1000, entfernen Enzym aus jeder Vertiefung. 1 ml DMEM / F12 pro Napf waschen. </li><li> Mit P1000, sammeln Sie die 1 ml DMEM / F12 und schnell vertreiben die DMEM / F12 zurück in den Brunnen, damit Lösen der Rosetten von der Platte. Sammeln Sie die Rosetten in ein Falcon-Röhrchen. </li><li> Pipette weitere 1 ml DMEM / F12 und schnell in derselben Wanne auszustoßen, um verbleibende Rosetten abzulösen. (Verreiben Sie nicht. Versuchen Sie, nicht zu brechen Rosette Aggregate). Sammeln Sie die neuronale Rosetten in gleichen Falcon-Röhrchen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.4 wie nötig. Wenn Rosetten nicht leicht zu lösen, fügen moWieder Enzym und wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 2,1 bis 2,4) </li><li> Spin-Zellen bei 300 xg für 3 min. Saugen Sie die Wäsche, und wieder auszusetzen Rosetten in 2 ml NPC Medien (Tabelle 1). Übertragungszellen (1: 1) in eine Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete 6-Well-Platte. </li><li> Von 15 bis 21 Tagen werden die neuronalen Rosetten zu erweitern; Feed Rosetten jeden zweiten Tag mit NPC Medien. </li><li> Bewerten Sie die Qualität der neuronalen Rosetten und sicherzustellen, dass Flach Fibroblasten-ähnlichen Zellen nicht in der Kultur erweitert. HINWEIS: Wenn nicht-Rosetten bestehen bleiben, kann der NPC Kultur manchmal durch manuelle Kommissionierung geborgen werden, die Auswahl nur die besten der aufgenommenen Rosetten in Accutase. Distanzieren 15 min bei 37 ° C. Pellet, waschen und Platte in NPC Medien auf 24-Well-Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Platte. </li></ol> 3. Ausbau der neuronalen Vorläuferzellen HINWEIS: hiPSC NSC können entweder Matrigel- oder Poly-L-Ornithin / Laminin beschichteten Platten gezüchtet werden. Wir verwenden in der Regel Matrigel-Platten, da sie schneller und bereit sein zu geringeren Kosten. <ol><li> Auf Matrigel-beschichteten Platten herzustellen, schnell auftauen und Resuspendieren eine 1mg gefrorenes Aliquot Matrigel in 24 ml kaltes DMEM / F12 und sofort verteilen 2 ml zu jeder Vertiefung der zwei Sechs-Well-Platten. Inkubieren für wenigstens 1 Stunde bei 37 ºC. HINWEIS: Matrigel muss nur angesaugt werden, nicht gewaschen, unmittelbar vor der Verwendung. </li><li> Feed-NPCs jeden zweiten Tag und zu warten mit sehr hoher Dichte oder sie spontan zu Neuronen zu differenzieren. HINWEIS: Obwohl etablierten NPCs werden in der Regel im Verhältnis 1: 4 pro Woche kann sehr niedrigen Durchgang NPCs aufgeteilt werden 1: 2 so selten wie einmal alle zwei Wochen. </li><li> So teilen Sie zunächst absaugen Medien und 1 ml warmem Accutase (1X) pro Vertiefung 6-Well-Platte. Bei 37 ° C für 10-15 min. </li><li> Abgelösten Zellen übertragen Sie leicht in ein 15 ml Röhrchen mit DMEM / F12 mit so wenig mechanischer Belastung wie möglich. Zellen titriert niemals während der Enzym. Pellet-Zellen durch Spinning bei 1.000 × g für 5 min. </li><li> Saugen Sie das Waschen und resuspendieren NPCs in ~ 1 ml NPC Medien pro Original auch der 6-Well. HINWEIS: Erwarten Sie, dass ein konfluenter Vertiefung einer 6-Well-Gericht hat 5-10 Million Zellen; Dies kann durch Zählen einer 10l Aliquot von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers vor dem Wiederbeschichtungs bestätigt werden. </li><li> Nach Resuspension, Wiederplatte NPCs als NPCs, Neuronen oder Neurosphären. Um NPCs halten Platte etwa 1-2 Millionen Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. Die Effizienz der Neurosphären-Bildung zwischen den Experimenten und Zelllinien variieren, aber im allgemeinen erfolgt am besten, wenn die zwischen 200.000 und 1.000.000 Zellen pro Loch einer nicht-haftenden Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät; wenn Verklumpung der Neurosphären, reduzieren die Anzahl der Zellen ausgesät. Um zu Neuronen zu differenzieren, Platte etwa 200.000 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ersetzt NPC Medien mit Neuron Medien. </li><li> Immunhistochemisch validieren jede etablierte NPC Linie. Sobald genügend Zellmaterial wurde expanded, Label NPCs mit Antikörpern für NESTIN und SOX2. Geprüftes NPC Leitungen sollten auch in Neuronen für 4-6 Wochen differenzieren und mit Antikörpern für III-Tubulin-und MAP2ab markiert. <ol><li> Fix Zellen in 4% Paraformaldehyd in PBS bei 4 ° C für 10 min. Permeabilisieren NSC bei RT für 15 min in 1,0% Triton in PBS, und dann wird der Block in 5% Eselserum mit 0,1% Triton bei RT für 30 min. </li><li> Inkubation mit dem primären Antikörper in 5% Eselserum mit 0,1% Triton, über Nacht bei 4 ° C. HINWEIS: Wir empfehlen folgende Antikörper: Ziegen-Anti-Sox2, 1: 200; Maus-anti-Mensch-Nestin, 1: 200; Kaninchen-anti-βIII-Tubulin, 1: 500; Maus-Anti-βIII-Tubulin, 1: 500; Maus-Anti-MAP2ab, 1: 200. (Abbildung 2). </li><li> Nach einem Waschen mit PBS, inkubiert Sekundärantikörper Zellen mit der entsprechenden konjugierten Sekundärantikörper, um Ziege, Maus oder Kaninchen bei 1: 300, im in 5% Eselserum mit 0,1% Triton für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur. Um Kerne, Flecken Zellen mit 0,5 &amp; mgr; g / ml DAPI (4 &#39;visualisieren, 6-Diamino-2-phenylindol) und montieren Sie mit Vectashield. </li></ol></li></ol> 4. NPC Transduction <ol><li> Verwenden spinfection (Zentrifugation von Zellkulturplatten in Gegenwart von Virus bei 1.000 × g für 1 Stunde), um den Prozentsatz der transfizierten Zellen 21 erhöhen. Absaugen Medien und ersetzen mit dem entsprechenden Überexpression (oder Kontrolle) Lentiviren (oder Retroviren), auf die gewünschte Multiplizität der Infektion (MOI) (in der Regel 1 bis 10), in NPC Medien verdünnt titriert. Verwenden von 1,5 ml pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen (oder eines geeignet skalierten Volumen für andere Typen von Gewebekulturplatten). Spin bei 1.000 xg und 37 ° C für 1 Stunde in einer Plattenzentrifuge. HINWEIS: Im Idealfall transduzieren NPCs mit lentiviralen oder retroviralen Vektoren in 1-2 Tagen der Spaltung. Ob mit kommerziellen oder Labor vorbereitet Viren, kann es hilfreich sein, entsprechend titrieren Chargen des Virus im Voraus durch serielle Verdünnung ist. (Abbildung 3). </li><li> Um cel reduzierenzellulären Tod ersetzen Medien innerhalb von 8 h spinfection. HINWEIS: Viral Integration und Expression des Transgens sollte innerhalb von 24 Stunden nach Reportergen Fluoreszenz nachweisbar sein. (Wenn der Virus fehlt ein fluoreszierendes Reporter, das ist schwieriger zu beurteilen; erfolgreiche Transfektion kann am besten durch Immunoblot, Immunhistochemie oder qPCR zur Überexpression Produkte überprüft werden.) Voll Ausdruck kann 3-7 Tage; wiederholt spinfections mit zusätzlichen Virus benötigt, um den Prozentsatz der transfizierten Zellen erhöhen. Wiederkehrende spinfections kann täglich erfolgen, muss aber nicht so häufig. Im Idealfall, wenn mit einer fluoreszierenden Reporter,&gt; 80% der Zellen sollten gekennzeichnet werden. </li></ol> 5. Neurosphere Migration Assay HINWEIS: Neurospheres spontan bilden, nach der enzymatischen Spaltung von NPC (durch eine Art und Weise identisch zu der in NPC Expansion verwendet - Schritte 3,3-3,6), wenn die Zellen in Suspension in NPC Medien kultiviert werden. <ol><li> Kurz gesagt, wachsen distanzierend NPCs in NPC Medien für 48 Stunden in nichthaftende Platten, um Neurosphären zu erzeugen. (Abbildung 4). </li><li> Für Neurosphäre Migration, bereiten Sie frisches Matrigel Platten mit kaltem NPC Medien, anstatt DMEM, in einer 96-Well-Platte, 1-2 Stunden vor der Neurosphäre sammeln. Matrigel saugen Sie nicht aus den Vertiefungen. </li><li> Wie ursprünglich für embryonale Stammzellen abgeleiteten Neurosphären 22 veröffentlicht wurde, manuell NPC-derived Neurosphären holen unter dem Mikroskop nach einmaligem Waschen in NPC Medien, um Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen eines Neurosphäre zu jeder Vertiefung einer Matrigel-beschichtete 96-Well-Platte. </li><li> Hinzufügen eines zusätzlichen 0,5 mg Matrigel, in kaltem NPC Medium verdünnt, um die Neurosphären in jeder 96-Well-Platte. </li><li> Manuell Zentrierung jeder einzelnen Neurosphären in der Mitte des Bohrlochs unter Verwendung einer Pipettenspitze. HINWEIS: Es ist wichtig, Neurosphären von ähnlicher Größe wählen, um die Variabilität der Ergebnisse zu reduzieren. </li><li> Lassen Sie die Migration auf 48 Stunden auftreten und dann fix Zellen with 4% Paraformaldehyd und Fleck mit gewünschten immunhistochemischen Markern. </li><li> Wenn radiale Migration zu bestimmen ist, fotografieren Neurosphären in ihrer ganz mit einem 4x Mikroskopobjektiv. Schließen alle Neurospheres Kontaktieren der Kante des Bohrlochs oder eine zweite Neurosphäre aus der Analyse. HINWEIS: Bei der Umlagerung für länger als 48 Stunden, wird der resultierende radiale Migration wahrscheinlich zu groß, um sein Bild mit einem 4-fach Objektiv. </li><li> Messen durchschnittlichen Migration von jeder Neurosphären mit NIH ImageJ Software (Abbildung 5). Dies kann entweder unter Verwendung der unten beschriebenen Analyseverfahren durchgeführt werden: <ol><li> Radial-Migration: <ol><li> Manuelles Spuren den Rand der am weitesten wandernden Zellen mit dem Freihandauswahlwerkzeug verwenden Sie dann die Maßnahme (Strg + M) Funktion, um den Bereich der sich ergebende Form zu berechnen. Vor der Messung der Bereich, um sicherzustellen, dass Area liegt in der Set-Messungen Fenster unter der Registerkarte Analysieren finden überprüft. Verwenden Sie dieWert der Bereichsmessung und der Gleichung für die Fläche eines Kreises (A = &amp; pgr; r 2), um den Radius (äußeren) bestimmen. </li><li> Verfolgen Sie die Kante des Originals Neurosphäre, messen Sie den Bereich und die Berechnung der Radius (innen) in der gleichen Weise. Berechne den radialen Migration als die Differenz zwischen dem äußeren und inneren Radien. </li></ol></li><li> Greatest Zellmigration: <ol><li> Messen Sie den Abstand von den fünf am weitesten Zellen bewegt von der Kante der inneren Neurosphären mit dem geradlinigen Auswahlwerkzeug, gefolgt von der Maßnahme (Strg + M) Funktion. </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Wir haben Methoden, mit denen zu unterscheiden hiPSCs in NPCs, ein neuronales Zelltyp, in dem ein erheblicher Anteil der Gen-Signatur von hiPSC abgeleiteten Neuronen erhalten bleibt und das kann als Näherungswert für die Entwicklungswege potenziell einen Beitrag zur Pathogenese der Erkrankung dienen 8 beschrieben, 11. Darüber, wie wir detailliert haben, sind NPCs ein robust replikativen und einfach transduzierten neuronalen Bevölkerung, die unserer Meinung nach für molekulare und biochemische Untersuchun...

Genexpressionsstudien von Neuronen in vitro aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) von uns 1 differenziert und andere 2,3 zeigen, dass hiPSC Neuronen ähnlich fetalen anstatt Erwachsenen Hirngewebe. Derzeit kann hiPSC basierte Modelle geeigneter für das Studium der Prädisposition statt später Merkmale, neurologischen Erkrankungen. Wir haben bereits berichtet, dass ein signifikanter Anteil der Gen-Signatur von Schizophrenie hiPSC abgeleiteten Neuronen bei Schizophrenie hiPSC neurale Vorläuferzellen (NPC) konserviert, was darauf hinweist, dass NPC eine nützliche Zelltyp für die Untersuchung der molekularen Wege beiträgt, Schizophrenie 1 sein . Wir und andere haben anomale Migration, erhöhten oxidativen Stress und reaktive Sauerstoffspezies, Sensibilität für Unterschwellenumweltbelastungen und einer Beeinträchtigung der Funktion der Mitochondrien bei der Schizophrenie hiPSC NPCs 1,4-6, sowie verringerte neuronale c berichtetVernetzungsoptionen und synaptische Funktion in der Schizophrenie hiPSC Neuronen 5,7-10. Wenn die molekularen Faktoren, die aberrant Migration und / oder oxidativer Stress bei Schizophrenie hiPSC NSC ebenfalls Grundlage der reduzierten neuronalen Konnektivitäts bei Schizophrenie hiPSC abgeleiteten Neuronen könnte NSC ein robustes und hoch replikativen neuronalen Population mit denen die Mechanismen der Erkrankung verantwortlich studieren. Darüber hinaus, weil man schnell erzeugen große Mengen von Zellen und müssen warten nicht Wochen oder Monate für die neuronale Reifung sind NPC basierte Assays geeignet für die Untersuchung von größeren Patientenkohorten und sind empfänglicher für Hochdurchsatz-Screening. Wir glauben, dass hiPSC NPCs können als Näherungswert für die Entwicklungswege potenziell einen Beitrag zur Pathogenese der Erkrankung dienen, wie bereits in so unterschiedlichen Erkrankungen wie Schizophrenie 1 und Huntington-Krankheit 11 gezeigt. Um NPCs aus hiPSCs, erste neuronale Differenzierung inProduktion von Dual-SMAD Hemmung (0,1 mM und 10 mM LDN193189 SB431542) 12 durchgeführt. Durch Antagonisierung BMP und TGF-Signalisierung mit dieser kleinen Moleküle wird Endoderm und Mesoderm Spezifikation blockiert, die Beschleunigung der neuronalen Differenzierung und die zur Bildung von sichtbaren neuronalen Rosetten innerhalb einer Woche nach Beschichtung. Neuronale Muster tritt früh in diesem Prozess, die vermutlich während der Periode des neuronalen Rosettenbildung und unmittelbar danach. In Ermangelung anderer Hinweise, diese primitiven Nervenzellen gehen von einer vorderen Stirnhirn ähnlichen Schicksal 13. Unmittelbar nach neuronalen Rosettenbildung und während NPC zu beobachtende Erweiterung sind Vorderhirn NPCs mit FGF2 8,14 kultiviert. Sie verfügen über Dual-Linie Potenzial und kann zu neuronalen Populationen von 70-80% III-Tubulin-positiven Neuronen und 20-30% saure Gliafaserprotein (GFAP) -positiven Astrozyten (Abbildung 1) zu unterscheiden. Der Großteil der Vorderhirn hiPSC Neuronen VGLUT1-positiveUnd so sind vermutlich glutamatergen, obwohl etwa 30% der Neuronen GAD67-positive (GABA) 8. NPCs werden regelmäßig mehr als zehnmal in vitro passagiert und gleichzeitig die konsistente Differenzierung Profile und ohne anfall Karyotyp Anomalien. Gruppen Passagieren NPCs mehr als 40-mal 15, aber wir finden, dass über zehn Passagen, NPCs zeigen eine erhöhte Neigung zu Astrozyten Differenzierung ausgewiesen. NPCs gut vertragen mehrere gefrier taut und wechselte als Neurosphären, indem Sie einfach die Kultivierung in nicht-haftenden Platten wachsen werden. NPCs werden effizient durch virale Vektoren transduziert und ermöglicht eine schnelle Auswertung der molekularen und zellulären Konsequenzen der genetischen Störung und einfach erweiterbar, um ausreichend Material für biochemische Untersuchungen ergeben. Darüber hinaus, da virale Vektoren erlauben robuste Überexpression und / oder Zuschlagskrankheitsrelevanter Gene, entweder Kontroll- oder Patienten gewonnen neural Zellen, kann man diese Plattform nutzen, um die Wirkung der genetischen Hintergrund auf diesen Manipulationen zu testen. Obwohl nicht für die synaptische oder aktivitätsbasierten Assays erfordern ausgereifte Neuronen geeignet, kann NPCs eine praktische Alternative für viele einfache molekulare oder biochemische Analysen von Patienten stammende Nervenzellen sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1174">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:500px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#11330</td>
			<td>for HES media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#10565</td>
			<td style="width:500px;">for neural media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">KO-Serum Replacement</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#10828</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Glutamax</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#35050</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">NEAA</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#11140</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">2&#8208;mercaptoethanol (55mM 1000x)</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#21985-023</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">N2</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#17502-048</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27-RA</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#12587-010</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FGF2</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#13256-029</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LDN193189</td>
			<td style="width:171px;">Stemgent</td>
			<td style="width:216px;">#04-0074</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">SB431542</td>
			<td style="width:171px;">Stemgent</td>
			<td style="width:216px;">#04-0010</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:216px;">#450-02</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">GDNF&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#450-10</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Dibutyryl cyclic-AMP</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#D0627</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">#A0278</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in H20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#05832</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Accutase</td>
			<td style="width:171px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:216px;">AT-104</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#17104019</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">CF1 mEFs</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">#PMEF-CF</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">P3655</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Laminin, Natural Mouse 1mg</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#23017-015</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">BD Matrigel</td>
			<td style="width:171px;">BD</td>
			<td style="width:216px;">#354230</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:216px;">3506</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ultra low attachment 6-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:216px;">3471</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">goat anti-Sox2&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:216px;">sc&#173;17320</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-human Nestin</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">MAB5326</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">rabbit anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:171px;">Covance</td>
			<td style="width:216px;">PRB&#173;435P</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:171px;">Covance</td>
			<td style="width:216px;">MMS&#173;435P</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-MAP2AB</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">M1406</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Plate centrifuge</td>
			<td style="width:171px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to generating and using hipsc derived npcs for the study of neurological diseases

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

Neural Rosetten können morphologisch durch ihre charakteristische Aussehen als runde Clustern Neuroepithelzellen mit apikal-basal Polarität (Abbildung 1) identifiziert werden, mit einem Hellfeldmikroskop. Obwohl NPCs sind in der Regel bei sehr hohen Zelldichte kultiviert, unmittelbar im Anschluss an Passagieren, leicht pyramidenförmige Soma und Neuriten bipolare Struktur sichtbar (Abbildung 1D). Validiert NSC exprimieren NESTIN und SOX2 in der Mehrzahl der Zellen, jedoch III-Tubulin-...

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A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Eine Anleitung zum Erstellen und Verwenden von hiPSC Abgeleitet NPCs für das Studium der Neurologische Erkrankungen

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

a-guide-to-generating-using-hipsc-derived-npcs-for-study-neurological

Research

JoVE Journal

Medicine

18.1K Aufrufe.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

Serie: A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Forschung

Medizin

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

Mit Hilfe Transkranielle Magnetstimulation auf die menschliche neuromuskuläre System zu studieren

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Mit Saccadometry mit Deep Brain Stimulation Normale und Pathologische Funktion des Gehirns zu studieren

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

Eine Phänotypisierung Regimen für genetisch modifizierte Mäuse verwendet, um Gene in menschlichen Krankheiten des Alterns Beteiligt Study

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

Setting Up a Stroke Team Algorithm and Conducting Simulation-based Training in the Emergency Department - A Practical Guide

Time is of the essence when caring for an acute stroke patient. The ultimate goal is to restore blood flow to the ischemic brain. This can be&#160;achieved by either&#160;thrombolysis with recombinant tissue-plasminogen activator (rt-PA), the standard therapy for stroke patients who present within the first hours of symptom onset without contraindications, or by an endovascular approach, if a proximal brain vessel occlusion is detected. As the efficacy of both therapies declines over time, every minute saved along the way will improve the patient&#39;s outcome.
This critical situation requires thorough work and precise communication with the patient, the family and colleagues from different professions to acquire all relevant information and reach the right decision while carefully monitoring the patient. This is a high fidelity situation. In nonmedical high-fidelity environments such as aviation, Crew Resource Management (CRM) is used to enhance safety and team efficiency.
This guide shows how a Stroke Team algorithm, which is transferable to other hospital settings, was established and how regular simulation-based trainings were performed. It requires determination and endurance to maintain these time-consuming simulation trainings on a regular basis over the course of time. However, the resulting improvement of team spirit and excellent door-to-needle times will benefit both the patients and the work environment in any hospital.
A dedicated Stroke Team of 7 persons who are notified 24/7 by a collective call via speed dial and run a binding algorithm that takes approximately 20 min, was established. To train everybody involved in this algorithm, a simulation-based team training for all new Stroke Team members was conceived and conducted at monthly intervals. This led to a relevant and sustained reduction of the mean door-to-needle time to 25 min, and enhanced the feeling of stroke readiness especially in junior doctors and nurses.

Every min counts in acute stroke care. This guide shows how to establish a Stroke Team algorithm and enhance its performance with regular simulation training. The principles of Crew Resource Management (CRM) facilitate a straight workflow, reduce door-to-needle times and increase staff satisfaction.

Einrichten eines Stroke-Team-Algorithmus und Durchführung von Simulationsbasierte Ausbildung in der Notaufnahme - Praktischer Leitfaden

Time is of the essence when caring for an acute stroke patient. The ultimate goal is to restore blood flow to the ischemic brain. This can ...

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This compound is currently under investigation as a PET tracer for demyelination. We recently described a novel chemical reaction to produce metafluorinated pyridines consisting of direct fluorination of a pyridine N-oxide and the utilization of this reaction for the radiochemical synthesis of [18F]3F4AP. In this article, we demonstrate how to produce this tracer using an automated synthesizer and an in-house made flow hydrogenation reactor. We also show the standard quality control procedures performed before releasing the radiotracer for preclinical animal imaging studies. This semi-automated procedure may serve as the basis for future production of [18F]3F4AP for clinical studies.

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

We demonstrate the semi-automated radiochemical synthesis of [18F]3F4AP and quality control procedures.

Automatisierte radiochemische Synthese von [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Ein neuartiger PET-Tracer zur Bildgebung von demyelinisierenden Krankheiten

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

Retinale Bildgebung bei der Demenz zu studieren

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...