Herzinsuffizienz ist die häufigste Todesursache für Männer und Frauen in der Welt. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Veränderungen im Herz- und Systemstoffwechsel zur Pathologie der Herzinsuffizienz beitragen. Schnell zu erkennen, welche Metaboliten die Anregungs-Kontraktion-Kopplung beeinflussen, ist immer noch eine Herausforderung.
Der traditionelle Ansatz, Herzmyozyten von der erwachsenen Maus zu isolieren, ist ein zeitaufwändiger und herausfordernder Prozess. Die innovative Methode in diesem Artikel macht einen strengen Prozess effizienter und einfacher durchzuführen. Darüber hinaus können wir mit fluoreszierender Sonde viele phänotyptische Bewertungen durchführen, wie Chemikalien Herztoxizität oder Dysfunktion auf zellulärer Ebene induzieren können.
Durch die Identifizierung, welche Moleküle die Myozytenfunktion verändern, können neue Therapeutika für die Behandlung von Herzinsuffizienz identifiziert werden. Mit transgenen Mäusen können wir verschiedene Gene untersuchen, um zu bestimmen, welche die Herzinsuffizienz verhindern und dazu beitragen können. Diese Informationen werden für die zukünftige Heilung von Herzinsuffizienz von entscheidender Bedeutung sein.
Demonstriert wird das Verfahren von Matthew Klos und einem Studenten Shreyas Suresh. Um zu beginnen, tauen Sie die arbeitende Lamininlösung auf Eis auf. Mit einer P1000 Pipette, aspirieren 200 Mikroliter Laminin und ziehen Sie die Pipettenspitze entlang einer Kante des sterilisierten Deckelrutsches sanft, damit Kapillarwirkung eine winzige Menge Laminin herausziehen kann, um die Abdeckung der Sechs-Well-Platte zu erleichtern.
Dann vertreiben Sie das verbleibende Laminin in der Mitte des Deckels in einer kreisförmigen Bewegung. Verteilen Sie das Laminintröpfchen über den Deckel. Legen Sie die Abdeckungen mindestens eine Stunde und bis zu 24 Stunden vor der Isolierung in einen 37 Grad Celsius Inkubator.
Um Myozyten aus einem präparierten Herz in kaltem KHB-HB zu isolieren, legen Sie die Probe unter ein Stereomikroskop. Um Emboli zu verhindern, grundieren Sie die Aortenkanüle, indem Sie sie in die KHB-HB-Lösung eintauchen und eine 20-Milliliter-Spritze verwenden, um die Lösung durchzuforsen. Stellen Sie sicher, dass das Herz untergetaucht ist und die Kanüle vor der Herzexzision grundiert ist.
Mit einer 5 Zange, kann das Herz zu nulate. Bestätigen Sie die richtige Positionierung der Kanüle, indem Sie die Spitze der Kanüle etwa einen Millimeter über der Aorteneinfügung in den Ventrikel visualisieren. Dann starten Sie den Fluss der KHB-HB, indem Sie den Stopphahn auf dem Langendorf drehen.
Verbinden Sie die Kanüle mit dem Langendorf, um das Herz für fünf Minuten zu durchdringen. Drehen Sie als Nächstes den Stopphahn, um die Perfusion vom KHB-HB-Reservoir in das Verdauungspufferreservoir zu schalten. Sobald der Verdauungspuffer das Herz erreicht hat, stellen Sie einen Timer ein.
Sammeln Sie die Perfusate in einem sterilen 100 Milliliter Becher. Füllen Sie den Verdauungspufferbehälter nach Bedarf mit dem Perfusate nach, bis die Verdauungszeit abgelaufen ist. Nach der Verdauung, in einem sterilen 100 Milliliter Becher, trennen Sie die Kammern des Herzens mit Zangen und Irisschere.
Legen Sie jede Kammer in einen separaten Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte. Gießen Sie fünf Milliliter Kollagenase-Lösung in jeden Brunnen. Verwenden Sie sofort eine Schere, um das Herzgewebe in Stücke von etwa einem Kubikmeter zu zerkleinern.
Mit einer sterilen Transferpipette das gehackte Herzgewebe vorsichtig mit Verdauungspuffer trituieren. Sobald die Gewebestücke weiß und gefiedert werden, legen Sie die Platte unter ein invertiertes Mikroskop, um die Zellen zu untersuchen. Wenn die Anzahl der lebensfähigen Zellen größer als 80% ist, gehen Sie fort, die Zellen mit einem 100-Mikron-Zellsieb in eine 50 Milliliter konische Röhre zu legen.
Wenn die Anzahl der lebensfähigen Zellen weniger als 80% beträgt, überprüfen Sie die Zeit, die zum Cannulaten erforderlich war. Wenn die Cannulationszeit mehr als fünf Minuten beträgt, versuchen Sie es mit einem anderen Herzen. Wenn nicht, assay neue Kollagenase Schlitze durch die Kollagenase Sampling-Programm.
Als nächstes pellet die Zellen durch Zentrifugieren bei 215 mal g für zwei Minuten. Das Pellet sollte kompakt und nicht locker sein. Wenn das Pellet lose ist, enthält das Präparat viele abgestorbene Zellen.
In einer Gewebekulturhaube das kompakte Pellet in 10 MilliliterStopppuffer wieder aufsetzen. Pellet die Zellen wieder durch Zentrifugieren bei 215 mal g für zwei Minuten. Setzen Sie die Zellen in fünf Millilitern Beschichtungspuffer aus.
Führen Sie eine Zellzahl auf einem Cytozähler durch und passen Sie das Volumen des Beschichtungspuffers an, um eine endgültige Myozytenkonzentration von zwei mal 10 auf die vier Zellen pro Milliliter zu erreichen. Entfernen Sie nun die lamininbeschichteten Abdeckungen aus dem Inkubator. Aspirieren Sie das Laminintröpfchen, wenn vorhanden.
Platte 200 Mikroliter Myozytenaufhängung auf jedem Deckel. Legen Sie die Deckellipsen in einen 37 Grad Celsius Inkubator mit 21% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid für zwei Stunden, um die Befestigung zu ermöglichen. Nach zwei Stunden nehmen Sie die Abdeckungen heraus und aspirieren die nicht angeschlossenen Zellen.
Fügen Sie im Inkubator bis zu vier Tage lang zwei Milliliter Kulturmedien und Kultur bei 37 Grad Celsius hinzu. Entfernen Sie zunächst Komponente A und Komponente B aus dem Membranpotential-Kit. In einem 15 Milliliter konischen Rohr 50 Mikroliter der Komponente B und fünf Mikroliter der Komponente A zu einem Spannungsfarbstoffgemisch kombinieren.
Wirbel zu mischen. Fügen Sie 10 Milliliter Beschichtungsmedien in das 15 Milliliter konische Rohr, das das Spannungsfarbstoffgemisch enthält, um das Membranpotential-Farbstoffgemisch zu bilden. Wieder Wirbel zu mischen.
Dann entfernen Sie eine Sechs-Well-Platte von Myozyten aus dem Inkubator. Aspirieren Sie die Medien. Fügen Sie 800 Mikroliter der Membran potential Farbstoffmischung zu jedem Brunnen.
Bedecken Sie die Platte mit Folie und lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Danach die Farbstoffmedienmischung aus jedem Brunnen ansaugen und jedem Brunnen einen Milliliter modifizierter Tyrodes Lösung hinzufügen. Abdeckung mit Folie.
Schalten Sie das Gerät in der Reihenfolge von Mikroskop, Lichtbogenlampe, HyperSwitch, Fluoreszenz-Schnittstellensystem, MyoCam-Netzteil, Feldstimulator und Computer ein. Stellen Sie sicher, dass die Anregungsemissionsfiltersätze für den Bildfarber geeignet sind. Zum Beispiel wird Fura-2 mit 340 Nanometern und 380 Nanometern Licht angeregt.
Es emittiert 510 Nanometer Licht. Fluo-4 und der Spannungsmembranfarbstoff werden mit 485 Nanometern Licht angeregt und emittieren 520 Nanometer Licht. Primieren Sie das Aufzeichnungssystem, indem Sie das Vakuum einschalten, die Schlauchklemme vollständig öffnen und jede 60-Milliliter-Spritze mit Tyrodes Lösung vorsichtig in den Verteiler eintauchen.
Verwenden Sie für Kalziumaufnahmen die Lösung von Tyrode. Verwenden Sie für Spannungsaufzeichnungen die modifizierte Tyrodes Lösung. Schalten Sie die Inline-Heizung ein.
Halten Sie die Temperatur so, dass die Perfusate in der Kammer bei 36 plus oder minus ein Grad Celsius für mindestens 15 Minuten ist. Öffnen Sie als Nächstes die Erfassungssoftware. Stellen Sie sicher, dass die Parameter für den richtigen Bildfarbe färben.
Schalten Sie den Stimulator aus. Im Dunkeln die Folie von der Sechs-Brunnen-Platte entfernen und einen Deckelschlupf in die Schrittkammer legen. Stellen Sie die Platte unter ein Mikroskop und konzentrieren Sie sich auf die Myozyten mit dem 10X Objektiv.
Sobald Sie im Fokus sind, beginnen Sie mit dem Tempo durch Feldstimulierung bei einem Hertz und 0,2 Volt. Erhöhen Sie nach und nach die Spannung, bis ein Eins-zu-Eins-Tempo erreicht wird. Erhöhen Sie dann die Spannung, bis das 1,5-fache des Schwellenwerts erreicht ist.
Wechseln Sie vom 10X-Ziel zum 40X-Ziel. Konzentrieren Sie sich auf eine Zelle, die einem Eins-zu-Eins-Tempo folgt. Passen Sie die Kunststofftöne so an, dass sich nur eine Zelle im Sichtfeld befindet.
Mit der Software platzieren Sie den Interessenbereich auf klar definierten Sarcomeren. Starten Sie die Erfassungssoftware, um das Anregungslicht zu initiieren. Passen Sie mit den Neutraldichtefiltern die Intensitätseinstellung entsprechend an, um ein angemessenes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
Hier werden die repräsentativen Kalzium- und Sarcomere-Verkürzungsspuren gezeigt, die von C57BL/6 Mausmyozyten mit Fura-2 aufgezeichnet wurden. Eine Quantifizierung der durchschnittlichen Ensembledaten von C57BL/6-Mäusen und ihren transgenen Wurfgefährten zeigt keinen Unterschied zwischen den Gruppen außer der Entspannungszeit bei 10 Hertz Tempo. Die Spannungsverfolgung, die von einem C57BL/6-Mausmyozyten mit 10 Hertz aufgezeichnet wurde, wurde postverarbeitet, um ein nutzbares Signal zu erhalten.
Das Ensemble durchschnittliche Aktionspotenzial nach einem Tiefpass Butterworth oder ein Savitzky-Golay Digitalfilter angewendet wurde zeigen subtile Unterschiede in der Form der Aktionspotenziale. Die Spuren, die von Rattenmyozyten aufgezeichnet wurden, die mit einem Hertz schritt, zeigen zusätzlich zu, dass das Spannungssignal niedriger ist als das Kalziumsignal, die Kontrakturtik ist auch unterschiedlich. Dies liegt daran, dass Kalziumfarbstoffe Kalzium puffern, spannungsgefärbt nicht.
Wie beim Kalziumtransienten zeigten Myozyten tempoabhängige Veränderungen ihrer optischen Wirkungspotentialdauer. Auch eine medikamentöse Verlängerung des Aktionspotentials wurde nachgewiesen. Die letzten 11 Sekunden einer 20-Sekunden-Aufnahme deuteten darauf hin, dass eine längere Exposition von Myozyten gegenüber blauem Licht zu einer ausgelösten Aktivität führt.
Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist das Wichtigste, sich daran zu erinnern, das lichtte Licht mit der niedrigsten Intensität zu verwenden, damit Sie die Myosyten nicht beschädigen. Myozyten isoliert mit unserem Ansatz kann auch für die Immunhistochemie verwendet oder für Western Blot-Analyse durchgeführt werden. Die Schönheit dieser Technik, ermöglicht es Forschern, schnell zu beurteilen, wie die Vielfalt der Moleküle und Gene helfen Anregung-Kontraktion Kopplung mit einem einzigen System.
