Dieses Protokoll ist wichtig, weil es Forschern die Fähigkeiten vermittelt, spendermenschliche Herzen für präklinische physiologische Arzneimitteltests einzusetzen. Dieses Gewebe nutzt sowohl Spannungs- als auch Kalziumfarbstoffe für die gleichzeitige Charakterisierung von kardialen Wirkungspotentialen und intrazellulären Kalziumtransienten in menschlichen Gewebescheiben. Um das optische Kartierungssystem einzurichten, befestigen Sie ein Gewebebad mit einer unteren Polydimethylsiloxan-Gelschicht an ein Perfusionssystem und zirkulieren Sie einen Liter Erholungslösung bei 37 Grad Celsius mit 100% Sauerstoff durch das Perfusionssystem bei einer Durchflussrate, die schnell genug ist, um die Temperatur zu halten und die Ansammlung von Badperfusate zu verhindern.
Verwenden Sie dann ein Ziel, um den Fokus und die Ausrichtung der beiden CMOS-Kameras einzustellen und verwenden Sie eine grüne LED-Lichtquelle mit einer Wellenlänge von 520 plus oder minus fünf Nanometern, um die spannungsempfindlichen und Kalzium-Indikatorfarbstoffe gleichzeitig zu anregen. Vor der Gewinnung von Gewebeabschnitten, mischen Sie gefrorene und flüssige Kardioplegie-Lösung und legen Sie das Herzgewebe in das eiskalte Cardioplegiebad und identifizieren Sie die linksventrikuläre freie Wand. Kleben Sie das vorgefertigte Agarose-Gel an die Rückseite der Metallgewebehalter des Vibratom.
Schneiden Sie einen Zentimeter gewürfelten Gewebeblöcke in kalter kardioplegischer Lösung und verwenden Sie topischen Hautkleber, um die Gewebeblöcke schnell auf die Metallgewebehalter mit den nach oben gerichteten Endokardenoberflächen zu montieren. Übertragen Sie die Metallhalter in das Vibratombad der eiskalten sauerstoffhaltigen Schneidlösung, so dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist und die Klinge an die Vorderkante des Gewebes bewegt. Schalten Sie das Vibratom ein, um mit dem Schneiden mit den voreingestellten Parametern zu beginnen, indem Sie die ersten mehrere Scheiben verwerfen, bis die Klinge über die Trabeculae hinaus in das glatte Endoskopgewebe reicht.
Wenn das Versuchsgewebe erreicht ist, übertragen Sie jede Scheibe sorgfältig in einzelne 100 Mikrometer Nylon-Netzzellensiebe in einer Kulturschale, die Raumtemperatur enthält, die Wiederherstellungslösung von Tyrode mit Sauerstoff versorgt und die Scheiben mit Netzscheiben bedecken, um die Gewebescheiben vor dem Lockenziehen zu schützen. Wenn alle Scheiben gesammelt wurden, übertragen Sie sorgfältig jede Scheibe in einzelne Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit drei Milliliter PBS pro Brunnen. Spülen Sie die Scheibe mit sanftem Schaukeln und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal mit frisch sterilem PBS, bevor Sie die Proben in einzelne Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit drei Millilitern 37 Grad Celsius Kulturmedium pro Brunnen übertragen.
Legen Sie die Platte dann mit 20 Umdrehungen pro Minute in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad, 30 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid auf einen Orbital-Shaker. Nach 20 Minuten Inkubation in der Erholungslösung für frisch geschnittene Scheiben oder unmittelbar nach der Kultivierung, übertragen Sie vorsichtig die Scheibe von Interesse auf das Perfusionssystem Gewebebad und fixieren Sie die vier Ecken auf die Gelschicht, während minimale Dehnung auf das Gewebe. Lassen Sie die Scheiben in diesem Bad mit zirkulierender Rückgewinnungslösung für etwa 10 Minuten ruhen, bevor Sie 0,3 bis 0,5 Mikroliter Blebbistatin in das Reservoir der Rückgewinnungslösung hinzufügen.
Während die Scheibe im Blebbistatin inkubiert wird, stellen Sie 30 Mikroliter des spannungsempfindlichen Farbstoffs in einem Milliliter Wiederherstellungslösung bei 37 Grad wieder her. Nach 10 Minuten Blebbistatin-Behandlung die Pumpen ausschalten und 0,2 bis 0,3 Milliliter Arbeitsfarbstofflösung über einen Zeitraum von 30 Sekunden langsam auf die Oberfläche der Scheibe laden. Schalten Sie nach 90 Sekunden die Pumpen ein, um überschüssigen Farbstoff auszuwaschen.
Nach dem Absterben der Scheibe mit Stock-Calcium-Indikator, wie gerade gezeigt, fokussieren Sie die Kameras auf die Scheibe und tempoieren Sie die Scheibe bei einem Hertz mit einer Zwei-Millisekunden-Pulsbreite Dauer bei 1,5-facher Amplitude der vorgegebenen Temposchwelle. Legen Sie einen Deckelüberschlag über die Gewebescheibe und beleuchten Sie die Scheibe mit der LED-Anregungslichtquelle. Dann nehmen Sie die emittierten Spannungs- und Kalziumsignale mit den Kameras bei 1.000 Bildern pro Sekunde auf.
Um die Spannungs- und Calcium-optischen Mapping-Daten zu konditionieren, klicken Sie in der entsprechenden Analysesoftware auf Zustandsparameter und entfernen Hintergrund. Passen Sie dann die Signalkonditionierungsparameter an, um ein optimales Aktionspotenzial und Kalziumtransientenspuren zu erhalten. Um die Leitungsgeschwindigkeit zu berechnen, wählen Sie die Aktivierungskarte aus, und geben Sie eine Start- und Endzeit ein, um ein einzelnes Aktionspotenzial in der Ablaufverfolgung zu umfassen.
Klicken Sie dann auf regionales Land, und wählen Sie den gewünschten Bereich aus, um die Aktivierungskarte der ausgewählten Region anzuzeigen. Wählen Sie als Nächstes die Leitungsgeschwindigkeitskarte und die Start- und Endzeiten aus. Passen Sie die Werte für die Auflösung zwischen Pixeln je nach Einrichtung nach Bedarf an.
Klicken Sie auf Vektorzuordnung generieren, um einen Interessenbereich auszuwählen und die Leitungsgeschwindigkeitsvektoren innerhalb dieses Bereichs anzuzeigen. Der Mittelwert, der Median, die Standardabweichung und die Anzahl der in die Analyse einbezogenen Vektoren sowie der durchschnittliche Ausbreitungswinkel der Leitungsgeschwindigkeitsvektoren in der ausgewählten Region werden angezeigt. Um die Aktionspotentialdauer zu berechnen, wählen Sie die Dauer des Aktionspotentials, die Karte der transienten Kalziumdauer aus, und wählen Sie die Start- und Endzeiten aus, um ein vollständiges Aktionspotenzial zu umfassen.
Klicken Sie dann auf regionale Aktionspotenzialdauerberechnung, um eine Interessenregion auszuwählen und die Aktionspotenzialdauerzuordnung zu generieren. Um die Anstiegszeit zu bestimmen, wählen Sie die Anstiegszeit und die Start- und Endzeiten aus, um den Aufschlag eines einzelnen Aktionspotentials oder Kalziumtransienten auszuwählen. Geben Sie die Start- und Endprozentwerte ein, und klicken Sie auf Berechnen, um den Interessenbereich auszuwählen und den Mittelwert, den Median, die Standardabweichung und die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die in der Analyse der Anstiegszeit enthalten sind.
Um den Calciumzerfall zu bestimmen, wählen Sie Kalziumzerfall und geben Sie die Start- und Endzeiten ein, um den gesamten Zerfallsanteil eines einzelnen Transientensignals zu umfassen. Klicken Sie dann auf Tau berechnen, um den Interessenbereich auszuwählen und den Mittelwert, den Median, die Standardabweichung und die Anzahl der Pixel zu bestimmen, die in die Analyse der Kalziumzerfallszeitkonstante einbezogen sind. In diesem repräsentativen Experiment wurden das Wirkungspotential und die kalziumtransienten Spuren signalkonditioniert.
Die Aktivierungszeiten wurden für jedes Pixel bestimmt und isochronale Karten der Aktivierungszeiten wurden aus den konditionierten Spannungs- und Kalziumspuren gezeichnet. Leitungsgeschwindigkeitsvektoren wurden anhand der Aktivierungszeiten und der bekannten Auflösung zwischen Pixeln berechnet. Die Calciumtransientenzerfallskonstante wurde gemessen, indem ein Polynom an den zerfallenden Teil der Kalziumspuren anpasste.
Die Wirkungspotentialdauer und die transiente Calciumdauer wurden als Zeitdauer zwischen der Aktivierungszeit und einem bestimmten Prozentsatz der Repolarisation bzw. Kalziumentfernung aus dem Zytoplasma gemessen. Die Anstiegszeiten der Spannungs- und Kalziumspuren wurden ebenfalls gemessen und kartiert. In dieser repräsentativen Analyse wurde die Wirkung von Doxorubicin auf die Herzleitung getestet, was zu einer Verringerung der Transvergängigkeitsgeschwindigkeit führte.
Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Scheiben in vollständiger kardioplegischer Verhaftung sind, um Schäden am Gewebe während des Schneidvorgangs zu minimieren und lebensfähige Scheiben zu erhalten. Am Ende des Protokolls können die Scheiben eingefroren oder zur molekularen Bewertung fixiert werden. Die mechanistischen Bahnen, die an dem elektrophysiologischen Phänomen von Interesse beteiligt sind, können dann bestimmt werden.
Die Entwicklung dieses menschlichen Herzscheibenmodells hat es ermöglicht, die Reaktionen auf Behandlungen und Krankheiten im menschlichen Herzgewebe zu untersuchen, die die Kluft zwischen tierischen und klinischen Studien überbrücken. Achten Sie bei der Arbeit mit menschlichen Geweben während der Ausführung dieser Technik darauf, die entsprechende PSA zu tragen und alle anderen notwendigen Sicherheitsvorkehrungen zu treffen.
