Die Autoren danken Dan Bess von Sigma-Aldrich für die Präsentation des Videos. Wir danken auch Don Branch, Evgenii Cherny, Scott Chesla, Elizabeth Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, sarvâni Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov und Eleanor Williams für ihre Ergebnisse und Beiträge zum Design, der Synthese von FSL-Konstrukte und der Bestimmung biologischer Aktivität.

Das folgende Protokoll beschreibt die allgemeine Vorgehensweise für das Einfügen von FSL-Konstrukte (Abbildung 1) in biologischen Membranen. Der Einfachheit halber wird das Protokoll nur auf Zellen (kodecytes), die bei einer Konzentration von 100% verweisen. Allerdings ist der Begriff Zellen austauschbar mit Virionen (kodevirions) oder Organismen oder zellulärer Strukturen und deren Konzentration in Verdünnungsmittel ist nicht wichtig, vorausgesetzt, es ist immer zwischen den Tests, Kontrollen und Untersuchungen im Einklang. Mit roten Blutkörperchen des Hämatokrits wird in der Regel 80%, aber mit Virionen, Embryonen und anderen Zellen ist es in der Regel weniger als 1%. Die Methode ist sehr robust und wird modifizierten Membranen erzeugen, wenn sie von einer ihrer Varianten verwendet, sondern Verfeinerung erforderlich zu optimieren und zu standardisieren, den Grad der Veränderung für bestimmte Anwendungen benötigt werden. 1. Vorbereitung der FSL-Konstrukten <ol><li> Zur Vorbereitung der FSL konstruieren Lager Lösung zunächst Rekonstitution des trockenen FSL Produkt (Tabelle 1) durch die Zugabe von 1,0 ml Verdünnungsmittel (oder wie in der Packungsbeilage angegeben), um ein Produkt Durchstechflasche. Kurz beschallen (30 Sekunden). Dies wird einen 1mg/ml Lösung, die in 100 ul sterilen Behältern aliquotiert und gelagert werden kann bei 2-8 ° C bis zu einer Woche, oder gefroren für bis zu 3 Monaten. </li><li> Zur Vorbereitung arbeiten FSL konstruieren Lösungen für die Insertion, unmittelbar vor der Verwendung kurz beschallen (30 Sekunden) der Stammlösung keine Mizellen zu homogenisieren. Verdünnen Sie die FSL-Konstrukt in Puffer (vorzugsweise nicht mit Lipiden oder stark hydrophoben Material), um die Konzentration oder über einen Bereich erforderlich, falls gewünscht. </li></ol> Notes: <ol><li> FSL-Konstrukte werden in der Regel in Zellen einfügen in Lipid-haltigen Medien, sondern wird in der Regel so viel wie ein 50X höher FSL arbeitet Konzentrationen, als wenn in PBS oder andere Lipid-freien Medien erfordern. </li><li> Der Arbeitsbereich Verdünnungen wird über den Antrag, das Nachweisverfahren Sensibilität, die Art der FSL zu konstruieren, und der Grad der Modifikation erforderlich abhängen. Typischerweise ist das Spektrum der Verdünnung wird zwischen 10-500 pg FSL pro ml Verdünnungsmittel für den Kohlenhydrat-FSL-Konstrukte und 1-100 ug / mL für andere FSL Konstrukte wie Fluorophore und Biotin werden. </li><li> Wenn der Vorbereitung Einsetzen Verdünnungsmittel mit mehreren FSL konstruieren, fügen Sie einfach die Konstrukte gemeinsam in die gleiche Verdünnungsmittel bei ihrer normalen Arbeitszeit Konzentration. Wenn ein Konstrukt ist, bei viel höherer Konzentration als andere, können einige Anpassungen (Erhöhung) der Konzentration für das kleinere Bau benötigt werden. Alternativ Konstrukte können nacheinander zugegeben werden, vorzugsweise mit der höchsten Konzentration erste Konstrukt, gefolgt von den kleineren. </li><li> FSL konstruieren Konzentrationen oberhalb von 1000 pg / mL können erhebliche Mengen an Lipid in einer Zellmembran einzuführen, und kann die Form der Zelle zu ändern oder machen es anfälliger für Lyse. </li><li> FSL bauen funktionierende Lösungen sollten bei 2-8 ° C gelagert werden und innerhalb von wenigen Tagen. </li><li> FSL-Konstrukte können in Wasser verdünnt werden, sondern reduziert die Stabilität haben und muss innerhalb von Stunden verwendet werden. Wenn Sie die Packungsbeilage gibt Wasser als Verdünnungsmittel Rekonstitution des Produktes in die Durchstechflasche enthält auch Salze (wie in der Packungsbeilage angegeben). </li></ol> 2. Insertion von FSL Construct (s) in Membranen <ol><li> Waschen Sie zuerst die Zellen für FSL Modifikation frei von ungebundenen Lipide durch Zentrifugation und mit PBS-oder Lipid-freie Zelle Medien als Waschlösung. </li><li> Packen Sie die Zellen oder die Aussetzung in 100 ul Verdünnungsmittel. </li><li> Gleichzeitig bereiten Kontrollen, die im Idealfall sowohl unveränderte Zellen (Inkubation mit PBS anstatt FSL-Lösung) und / oder Zellen mit einer gutartigen, aber miteinander verbundene FSL konstruieren geändert werden sollte. </li><li> Geben Sie 100 ul einer geeigneten Verdünnung des FSL-Lösung (mit 1 oder mehr FSL Konstrukte) zu den Zellen und Inkubation für 1-2 Stunden bei 37 ° C. Ein ähnliches Ergebnis kann durch 6 Stunden Inkubation bei 25 ° C erreicht werden oder über Nacht (18 Stunden) bei 4 ° C - Mischen ist alle paar Stunden zu empfehlen, wenn schwere Zellsuspensionen verwendet werden. </li><li> Wash (optional) zweimal mit PBS oder Medium mit einem freien FSL Konstrukte zu entfernen und bereiten eine entsprechende Suspension. </li></ol> Notes: <ol><li> Das Verdünnungsmittel verwendet werden, um die Zellen aussetzen kann Zellkulturmedien, PBS, Zell-Storage-Lösungen, etc, aber möglichst ohne Fett (zB fötales Kälberserum) oder Detergenzien (zB Tween). </li><li> Unterschiedliche Volumina (100 mL) Verhältnisse (als 1:1-Zellen / FSL-Lösung) oder Inkubation Bedingungen von Zeit und Temperatur kann verwendet werden, sofern im gleichen Verhältnis, Konzentration und Volumen werden verwendet, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. </li></ol> 3. Handhabung und Visualisierung <ol><li> Sobald die FSL Änderung abgeschlossen ist die kodecytes können bei 4-8 ° C in Lipid-freien Medien gespeichert oder genutzt werden. </li><li> Kodecytes und kodevirions der Regel verhalten sich genauso wie unveränderten Zellen / Virionen und kann Handled und betrachtet unter normalen Testsysteme (Mikroskopie, Serologie, Durchflusszytometrie, etc). Sie haben meist keine besonderen Anforderungen außer für die Vermeidung von Lösungsmitteln / Detergenzien / Lipide, dass die Lipid-Konstrukte aus Membranen eluieren kann. </li></ol> Notes: <ol><li> Konstruiert wird in der Membran von inaktiven Zellen, wie rote Blutkörperchen bleiben, wenn in Lipid-freien Medien für das Leben der Zelle gespeichert ist. In Zellen mit aktiver Membranen der Konstrukte wird internalisiert und abgebaut werden, mit einer Rate abhängig Zellmembran Aktivität. </li><li> Tote Zellen werden in der Regel einen hohen Gehalt an FSL Konstrukte, dies kann verwendet werden, um lebensfähig Zellen von lebenden Zellen zu trennen. </li><li> Wenn kodecytes gespeichert sind (oder in vivo) in Lipid-haltigen Medien / Umgebungen, wie zB Serum / Plasma des Konstrukts wird langsam aus der Membran eluiert über einen Zeitraum von Stunden oder Tagen, je nach Temperatur-und Lipid-Konzentrationen / Kompositionen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: <ol><li> Die folgende repräsentative Ergebnisse sind abhängig von der Konstruktion verwendet werden (Tabelle 1), seine eingefügt Konzentration und die relative Sensitivität und Spezifität des Nachweises System (s). Im Allgemeinen sind alle FSL Konstrukte in die Zellen nach 1 Stunde einlegen, aber die optimalen Bedingungen müssen für jede Situation geschaffen werden. </li><li> FSL-Konstrukte können verwendet werden, um die Außenseite der eine Vielzahl von lebenden Zellen 3-9,11,14 Label sein. In den Beispielen in Abbildung 2 dargestellten Embryonen in verschiedenen Stadien verwendet wurden (da sie eine fragile Zelle sind), aber auch andere Zellen (Abbildung 3) oder umhüllt Virionen (Abbildung 4) können auch gekennzeichnet werden. FSL-Fluorescein ermöglicht die direkte Markierung von Oberflächen (Abbildungen 2-4), während FSL-Biotin und anderen FSL Konstrukte die Verwendung eines sekundären Detection System (in der Regel Avidin / Antikörper / Lektine) erfordern, um ihre Anwesenheit (Abb. 5) zeigen . </li><li> Blutgruppe Marker für die menschliche oder tierische Spezifität können Zellen, einschließlich Erythrozyten 4-9 (Abbildung 6) angebracht werden. Da die Höhe der FSL auf einem kodecyte Konstrukt ist kontrollierbar und reproduzierbar 4-6, können kodecytes für die Antikörper-Quantifizierung vorgenommen (Tabelle 2 und Abbildung 6). Die eigentliche Quelle der Zellen ist nicht wichtig, können sie alle Arten oder sogar von den gleichen Ursprung wie die Quelle des Antikörpers, wodurch eine auf dem nur unvereinbar Antigen ist, dass durch die FSL 7,8 (Abbildung 6) eingeführt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tabelle 2" /> Tabelle 2. Repräsentativen serologischen Reaktionen von drei verschiedenen FSL-A (tri) red cell kodecytes gegen Verdünnungen von monoklonalen anti-A getestet. Die 50 uM Lösung von FSL-A (tri), wenn mit dem gleichen Volumen der Gruppe O Erythrozyten inkubiert produziert starke A-Antigen-positiven Zellen, die durch eine 1:512 Verdünnung des monoklonalen anti-A nachgewiesen werden konnte. Die 5 - und 10-fach niedriger FSL-A (tri)-Lösungen produziert kodecytes mit weniger Blutgruppe A-Antigen-Expression. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="FSL konstruieren Überblick" /> Abbildung 1. FSL konstruieren Überblick. Wie eine Blume FSL Konstrukte besteht aus drei Hauptkomponenten. Die funktionalen Kopf (F) im Fall des FSL-Konstrukt kann eine Vielzahl von verschiedenen biologisch funktionellen Gruppen, einen Abstandshalter (S) entwickelt, um Abstand von F von der Membran zu induzieren, zu verbessern Wasserdispergierbarkeit und nicht-reaktiv mit Serum werden, während die Diacyl Lipid ermöglicht das Konstrukt spontan in Oberflächen zu integrieren. (I) FSL-GB3 mit einer Blutgruppe Gb 3 (oder P k) Trisaccharid Epitop Galα4Galβ4Glcβ. (II) FSL-A (tri) mit einer Blutgruppe A Trisaccharid Epitop GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-Fluorescein. (IV) FSL-Biotin mit einem Biotin-F-Gruppe. Die funktionelle Gruppe von Strukturen in I-III sind konjugiert zu einer aktivierten adipat Derivat Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), während die spacer der Struktur IV ist carboxymethylglycine-adipat basiert. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="FSL-Fluorescein markierter muriner Embryonen" /> Abbildung 2. FSL-Fluorescein markierter muriner Embryonen. Alle Bilder von Live-Embryonen, die beschriftet, wenn ihre Zona pellucida (ZP) war intakt (dh der FSL-Konstrukt durch die ZP auf den Embryo innerhalb label bestanden) waren. Bilder I-IV sind der ZP-freien Embryonen aus ihrer ZP mit Säure Tyrodes post Markierung mit FSL-Fluorescein freigesetzt. Identische Färbung geschieht unabhängig davon, ob Embryonen wurden FSL mit ZP intakt oder ZP frei modifiziert. Die Embryonen werden direkt mit FSL-Fluorescein markiert, durch die 2 Stunden 37 ° C-Methode in serumfreien Zellkulturmedien, gewaschen und dann betrachtet unter Fluoreszenz-Mikroskopie. (I) ZP freien Zwei-Zell-Maus-Embryo, zeigt auch klassische intensive Polkörper Färbung. (II-III) ZP freien Vier-Zellen-und acht Zellen murine Embryonen, die beide zeigen schattenhafte Färbung der Zellen, die outs sindide dem Mikroskop Ebene konzentrieren. (IV) ZP free 16 Zelle murinen Embryo. (V) ZP intakte murine Blastozysten Embryonen (d4-d5), wo beide den Embryo und zona gekennzeichnet sind. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-Fluorescein und Zebrafisch" /> Abbildung 3. FSL-Fluorescein und Zebrafisch 14. (I) Microangiography auf einem 52 HPF (Stunden nach der Befruchtung) Zebrafischlarven direkt in den Kreislauf mit FSL-Fluorescein injiziert. Der Zebrafisch Gefäßsystem ist gefärbt. (II) FSL-Fluorescein heterogenen Zebrafisch Nierengewebe Zellen (ZK kodecytes) wurden ex vivo erzeugt dann in den Kreislauf eines 52 hpf Empfänger Zebrafisch Mikro-Injektion. In-vivo-Beobachtungen des ZK kodecytes wurden 2 Stunden nach der Injektion durch die Abbildung der Gefäßsystem unter Fluoreszenz mit Zeitraffer-Mikroskopie. Gezeigt wird ein einzelnes Videobild mit großen langsamen oder unbewegliche Zellen (angegeben mit orange Pfeile) und schnelllebigen Zellen (verschwommene Bilder durch Bewegung - angezeigt durch grüne Pfeile). Labeling ermöglicht Echtzeit in vivo Beobachtung des Verhaltens und Bioverteilung des ZK kodecytes. (III) Die orale Aufnahme von FSL-Fluorescein erreicht durch Eintauchen Zebrafischembryonen in FSL-Fluorescein mit Medien für bis zu 5 Tage. Gewaschen wurde durch die Übertragung von Embryonen in die Medien, die keine FSL-Konstrukte (mindestens 6 Stunden erforderlich ist, kann aber für mehrere Tage) erreicht. (IIIa) Hellfeld-Mikroskopie der FSL-Fluorescein behandelt Zebrafisch entsprechend der angrenzenden Fluoreszenzbild (IIIb). Die Fluoreszenz wurde bevorzugt im Darm befindet. Keine Färbung wurde in unbehandelten Kontrolle Embryonen (IVa und IVb) beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="FSL-Fluorescein Kennzeichnung von Virionen" /> Abbildung 4. FSL-Fluorescein Kennzeichnung von Virionen 10 VSV und H1N1. (I) vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) wurde direkt mit 10 pg / ml FSL-Fluorescein für 2 h bei 37 ° C gekennzeichnet, gefolgt von Fixieren mit 4% Paraformaldehyd und dann Durchflusszytometrie. Keine Reinigung des VSV kodevirion post FSL Kennzeichnung erforderlich war. (II) Die Durchflusszytometrie von Schweinen Hodenzellen mit menschlichen A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) infiziert kodevirions beschriftet mit FSL-Fluorescein. Nicht infizierte Zellen werden als die schwarze Linie zu sehen, während Fusion der H1N1 kodevirion mit dem ST-Zellen führt zu einem fluoreszierenden Zellen (rote Linie). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="FSL-Biotin-markierten Zellen" /> Abbildung 5. FSL-Biotin-markierter Zellen und die anschließende Visualisierung über Avidin 7,8. Alle Zellen wurden zunächst mit FSL-Biotin für 1 h bei 37 ° C gekennzeichnet, gewaschen und dann mit Fluorophor markierten Avidin, gewaschen und nass für die Fluoreszenzmikroskopie montiert reagiert. (I) konfokale Abbildung eines murinen Embryo Blastozyste Zusammengestellt. (II) Central konfokalen Scheibe des Embryos aus dem vorhergehenden Bild. (III) Live beweglichen menschlichen Spermien - Unschärfe tritt als Folge ihrer Bewegung. (IV) Feste (4% Paraformaldehyd nach der Insertion) menschlichen Spermien. (V) Human Erythrozyten. (VI) Feste (4% Paraformaldehyd pre-Insertion) RL95 Endometrium menschlichen Karzinom. (VII) Unfixierte RL95 Endometrium menschlichen Zelllinie. (VIII) Biotin RBC kodecytes beobachtet in eine Blutprobe entnommen 2 Stunden nach der intravenösen Infusion von kodecytes mit (VIIIa), was einem Feld unter dem Lichtmikroskop while (VIIIb) ist das gleiche Feld unter Fluoreszenz angesehen, die Identifizierung der beiden kodecytes in das Feld -of-view. Berechnung des Verhältnisses der kodecytes zu unmarkierten Zellen verwenden können als ein Indikator für das Überleben. (IX) Live menschlichen Endometrium Biotin kodecytes visualisiert durch die Bindung an avidinylated Perlen. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-Kohlenhydrat der Blutgruppe Marker für serologische Profilierung hinzufügen" /> Abbildung 6. FSL-Kohlenhydrat der Blutgruppe Marker für serologische Profiling hinzuzufügen. (I) Human red cell Galili kodecytes wurden mit einer Reihe Konzentration von FSL-Galili (500 ug / mL) erstellt und getestet gegen Verdünnungen von humanem Serum. Menschliche rote Blutkörperchen nicht auf natürlichem Wege mit dem xenoantigen Galili Antigen auftreten. Solche kodecytes können quantitative Antikörperspiegel im Serum verwendet werden. In diesem Beispiel ist der Spender war entschlossen, eine Anti-Galili Titer von 1:32 haben. (II) Durch die Schaffung kodecytes mit Verminderung der Zahl der FSL (&quot;Antigen-Titer&quot;), eine optimale Antigen Ebene Antikörper erkennen bestimmt werden kann (in diesem Beispiel Le a) sein. Die Zellen können erstellt, um nur ein positives Ergebnis, wenn der Antikörper bei Überschreiten einer bestimmten Titer werden. Die Höhe der FSL-Antigen erforderlich, um ein positives Ergebnis geben, hängt von der Qualität und das Niveau der Antikörper erkannt wird. Für Kohlenhydrat-Antigene, wird ein FSL Lösung von 100 ug / ml in der Regel in einer starken positiven Reaktion führen. (III) Human Gruppe O roten Zellen wurden modifiziert, um ein bestimmtes Niveau der A ant habenigen (standardisierte A kodecytes) und verwendet werden, um präzise und reproduzierbar quantifizieren anti-A in humanem Serum. In diesem Beispiel ist die Anti-A-Titer in der Gruppe O-Serum getestet wird 1:32 und die kodecytes wurden vom Spender der eigenen roten Blutkörperchen vorbereitet. (IV) Blutgruppe A und B-Antigene gleichzeitig in einer einzigen Gruppe O red cell Probe eingefügt werden verwendet, um ein schwaches B schwach kodecytes erstellen. Diese kodecytes kann für ABO Qualitätskontrolle verwendet werden. Dieses Ergebnis zeigt die Analyse einer speziell formulierten Ein schwaches B schwach kodecyte gegen Anti-A und Anti-B-Reagenzien getestet und gibt erwarteten schwachen Reaktionen.

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Deborah A. Blank und Stephen M. Henry sind die Mitarbeiter und Aktionäre der KODE Biotech Limited der Patentinhaber der KODE-Technologie. Dan Bess ist ein Mitarbeiter von Sigma-Aldrich, die die Produktion dieses Video-Artikel gesponsert hat.

Ändern Zellen und Virionen mit FSL-Konstrukten ist eine sehr einfache und robuste Technik 3-11. Um zu beschreiben und zu unterscheiden FSL konstruieren modifizierten Zellen und Virionen von unveränderten Zellen, sie sind kodecytes und kodevirions jeweils 6-10 bezeichnet, aber nur, wenn die eingeführte funktionelle Gruppe kann gezeigt werden, enthalten auf ihrer Membran. Wenn kodecytes mit verschiedenen Konzentrationen von FSL Konstrukte hergestellt werden, können sie durch die Konzentration der FSL konstruieren Lösung zur Erstellung verwendet wurden, zB 15 pg / mL A kodecytes, oder wenn mehr als eine FSL wird dann verwendet, eine kombinierte Terminus bezeichnet werden, z. B. A + Biotin kodecytes 7,8. Wenn verschiedene Zellen verglichen, darunter die Zelle Typ in der Beschreibung werden sollen, wird empfohlen, z. B. red cell Biotin kodecytes oder Endometrium-Biotin kodecytes 7,8. Obwohl der Prozess des Einsetzens ist sehr robust und Einfügen (wenn auch mit unterschiedlicher Geschwindigkeit) wird über einen großen Temperaturbereich von 4 auftreten - 37 ° C und innerhalb von Minuten bis Stunden, um reproduzierbare Einsetzen strenge Kontrolle der Einwirkzeit, Temperatur, FSL-Konzentration zu erhalten ( einschließlich Verdünnungsmittel Formulierung) und in geringerem Maße Zellkonzentration erforderlich sind. Bis heute alle FSL Konstrukte verwendet werden, um Zellen mit der gleichen Technik 4-11 verändern, aber es wird erwartet, dass bestimmte Bedingungen wird günstiger sein, Work-flow-und / oder den optimalen Umgang mit Anforderungen der Zellen / Virionen geändert werden . Die genaue FSL-Konzentration, um den gewünschten Effekt zu erzielen muss durch den Anwender 4 ermittelt werden. Der resultierende FSL konstruieren veränderten Zellen / Virionen können in der Regel in der gleichen Weise wie eine unveränderte Zelle / Virion in biologischen oder analytische Systeme 4-11 verwendet werden. Wie der FSL Konstrukte wird langsam von modifizierten Oberflächen eluieren bei Kontakt mit Lipid-Lösungen 7,8, oder durch aktive Zellen 11 konsumiert werden, müssen diese Fragen in Bezug auf den Pegel des Signals oder die Aktivität über die Zeit hinweg erhalten in Betracht gezogen werden. Kodecytes kann fest (z. B. Glutaraldehyd / Formalin) werden nach dem Einsetzen sofern das Fixativ enthält keine Lipid-eluting Lösungsmittel und der funktionellen Gruppe ist kompatibel mit dem Fixateur. Alternativ fixierten Zellen können mit FSL Konstrukte modifiziert werden. Neben der Änderung der Zell-und Virion Oberflächen FSL-Konstrukte können auch direkt in den Kreislauf von Labortieren verursacht in vivo Modifikation von zirkulierenden Zellen 7 infundiert werden und Viren 12, Toxine, 12 und 7 Antikörper zu hemmen. FLS Konstrukte wurden ebenfalls verwendet, um Liposomen dekorieren und kann auf Papier Flächen 13, wo sie bewegungsunfähig gedruckt werden, und kann dann in diagnostischen Assays verwendet werden. Die Fähigkeit, auf einfache Weise ändern lebende Zellen mit einer wachsenden Palette von FSL Konstrukte erweisen sollte ein nützliches Werkzeug für Forschung und Entwicklung für das Studium der Zelloberfläche Biologie sein.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Handelsübliche FSL Konstrukte in diesem Papier beschrieben.

fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability

Die Möglichkeit zum Ändern / Visualisierung biologischer Oberflächen, und dann studieren die modifizierte Zelle / Virion in einer Reihe von in vitro und in vivo-Umgebungen ist wichtig, gelungen, weitere Einsichten in die Funktion von spezifischen Molekülen oder das gesamte Unternehmen. Studium der biologischen Oberflächenmodifizierung sind in der Regel zur Gentechnik des Organismus oder die kovalente Bindung von chemischen Einheiten an die Zelloberfläche 1,2 begrenzt. Allerdings sind diese traditionellen Techniken setzen die Zelle chemische Reaktionspartner, oder sie erfordern einen erheblichen Manipulationen um das gewünschte Ergebnis zu erzielen, so dass sie mühsam, und sie können auch versehentlich die Lebensfähigkeit / Funktionalität der veränderten Zelle. Eine einfache Methode, um harmlos zu modifizieren der Oberfläche von Zellen erforderlich ist. Kürzlich wurde eine neue Technologie, hat KODE Technologie eine Reihe von neuen Konstrukten, bestehend aus drei Komponenten eingeführt: eine funktionelle Kopfgruppe (F), einen Abstandshalter (S) und einer Lipid-tail (L) und sind als Funktions-Spacer-Lipid-oder FSL bekannt constructs3. Der Spacer (S) wird ausgewählt, um ein Konstrukt, das in Wasser dispergierbar ist zu schaffen, noch spontan und stabil in einer Membran zu integrieren. FSL konstruieren funktionelle Einheiten (F) so weit zählen eine Reihe von Sacchariden wie Blutgruppe Determinanten, Sialinsäuren, Hyaluronsäure Polysaccharide, Fluorophore, Biotin, radioaktive Marker, und eine Reihe von Peptiden 3-12. FSL Konstrukte zu modifizieren Embryonen, Spermien, Zebrafisch, epithelialen / Endometrium-Zellen, rote Blutkörperchen und Virionen verwendet worden, um Qualitätskontrollen Systeme und diagnostische Platten, zu schaffen, um die Zelladhäsion / Interaktion / Trennung / Immobilisierung ändern und für die in vitro und in vivo-Bildgebung von Zellen / Virionen 3-12. Der Prozess der Modifikation von Zellen / Virionen ist generisch und extrem einfach. Die häufigste Verfahren ist die Inkubation von Zellen (in Lipid-freien Medien) mit einer Lösung für FSL Konstrukte für 1-2 Stunden bei 37 ° C 4-10. Während der Inkubation der FSL Konstrukte spontan integrieren in die Membran, und der Prozess abgeschlossen ist. Waschen ist optional. Zellen durch FSL Konstrukte modifiziert werden als kodecytes 6-9 bekannt, während Virionen kodevirions 10 sind. FSL Konstrukte als direkte Infusionen und kodecytes / kodevirions in experimentellen Tiermodellen 7,8,10 benutzt worden sein. Alle kodecytes / kodevirions scheinen ihre normale Vitalität und Funktionalität zu behalten, während gewinnt die neue Funktion der F-Einheit 7,8,10,11. Die Kombination von Dispergierbarkeit in biokompatiblen Medien, spontane Einbau in Zellmembranen, und scheinbare geringe Toxizität, macht FSL Konstrukte wertvolle Recherche-Tools für die Untersuchung von Zellen und Virionen.

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FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Function-Spacer-Lipid (FSL) Konstrukte erlauben die Oberflächeneigenschaften von lebenden Zellen und Virionen ohne Verlust der Vitalität geändert werden. Die Methode erfordert nur einfache Berührung eines FSL konstruieren Lösung mit einer Zelle / Virion und spontan und stabile Oberfläche Einarbeitung erfolgt.

FSL Konstrukte: Eine einfache Methode für das Ändern von Cell / Virion Oberflächen mit einer Reihe von biologischen Markern, ohne die Durchführung

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

fsl-constructs-simple-method-for-modifying-cellvirion-surfaces-with

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JoVE Journal

Biology

13.7K Aufrufe.  AUT University and KODE Biotech Ltd. Function-Spacer-Lipid (FSL) Konstrukte erlauben die Oberflächeneigenschaften von lebenden Zellen und Virionen ohne Verlust der Vitalität geändert werden. Die Methode erfordert nur einfache Berührung eines FSL konstruieren Lösung mit einer Zelle / Virion und spontan und stabile Oberfläche Einarbeitung erfolgt.

Serie: FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Forschung

Biologie

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Herstellung von Myogenic Engineered Tissue Konstrukte

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

A Lectin HPLC Method to Enrich Selectively-glycosylated Peptides from Complex Biological Samples

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the internal status of the cell. Glycans on tumor cells tend to have abundant sialic acid and fucose moieties. We propose that these cancer-associated glycan variants be exploited for biomarker development aimed at diagnosing early-stage disease. Accordingly, we developed a mass spectrometry-based workflow that incorporates chromatography on affinity matrices formed from lectins, proteins that bind specific glycan structures. The lectins Sambucus nigra (SNA) and Aleuria aurantia (AAL), which bind sialic acid and fucose, respectively, were covalently coupled to POROS beads (Applied Biosystems) and packed into PEEK columns for high pressure liquid chromatography (HPLC). Briefly, plasma was depleted of the fourteen most abundant proteins using a multiple affinity removal system (MARS-14; Agilent). Depleted plasma was trypsin-digested and separated into flow-through and bound fractions by SNA or AAL HPLC. The fractions were treated with PNGaseF to remove N-linked glycans, and analyzed by LC-MS/MS on a QStar Elite. Data were analyzed using Mascot software. The experimental design included positive controls&mdash;fucosylated and sialylated human lactoferrin glycopeptides&mdash;and negative controls&mdash;high mannose glycopeptides from Saccharomyces cerevisiae&mdash;that were used to monitor the specificity of lectin capture. Key features of this workflow include the reproducibility derived from the HPLC format, the positive identification of the captured and PNGaseF-treated glycopeptides from their deamidated Asn-Xxx-Ser/Thr motifs, and quality assessment using glycoprotein standards. Protocol optimization also included determining the appropriate ratio of starting material to column capacity, identifying the most efficient capture and elution buffers, and monitoring the PNGaseF-treatment to ensure full deglycosylation. Future directions include using this workflow to perform mass spectrometry-based discovery experiments on plasma from breast cancer patients and control individuals.

Lectin-conjugated POROS beads were employed for HPLC. Glycopeptide standards served as positive and negative controls. MARS-14 depleted, trypsin-digested human plasma was chromatographed and flow-through (FT) and bound fractions collected for ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptides were enriched in the bound fraction as compared to FT.

A Lectin HPLC-Methode zur selektiven glykosylierte Peptide aus komplexen biologischen Proben Enrich

Glycans are an important class of post-translational modifications. Typically found on secreted and extracellular molecules, glycan structures signal the ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

Synthese und Kalibrierung von Phosphorescent Nanoprobes für Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Eine einfache Methode zur Bildgebung Arabidopsis Leaves Mit Perfluordecalin als Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering homologen Rekombination Konstrukte in<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Ein Verfahren zur Mikroinjektion von<em&gt; Patiria Minata</em&gt; Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.