Die Autoren danken Dan Bess von Sigma-Aldrich für die Präsentation des Videos. Wir danken auch Don Branch, Evgenii Cherny, Scott Chesla, Elizabeth Hadac, Amanda Harrison, Damien Heathcote, Annika Hult, Chuan-Ching Lan, Susannah McIntosh, sarvâni Komarraju, Elena Korchagina, Caroline Oliver, Martin Olsson, Stephen Parker, Igor Rodinov, Alexander Tuzikov und Eleanor Williams für ihre Ergebnisse und Beiträge zum Design, der Synthese von FSL-Konstrukte und der Bestimmung biologischer Aktivität.

Das folgende Protokoll beschreibt die allgemeine Vorgehensweise für das Einfügen von FSL-Konstrukte (Abbildung 1) in biologischen Membranen. Der Einfachheit halber wird das Protokoll nur auf Zellen (kodecytes), die bei einer Konzentration von 100% verweisen. Allerdings ist der Begriff Zellen austauschbar mit Virionen (kodevirions) oder Organismen oder zellulärer Strukturen und deren Konzentration in Verdünnungsmittel ist nicht wichtig, vorausgesetzt, es ist immer zwischen den Tests, Kontrollen und Untersuchungen im Einklang. Mit roten Blutkörperchen des Hämatokrits wird in der Regel 80%, aber mit Virionen, Embryonen und anderen Zellen ist es in der Regel weniger als 1%. Die Methode ist sehr robust und wird modifizierten Membranen erzeugen, wenn sie von einer ihrer Varianten verwendet, sondern Verfeinerung erforderlich zu optimieren und zu standardisieren, den Grad der Veränderung für bestimmte Anwendungen benötigt werden. 1. Vorbereitung der FSL-Konstrukten <ol><li> Zur Vorbereitung der FSL konstruieren Lager Lösung zunächst Rekonstitution des trockenen FSL Produkt (Tabelle 1) durch die Zugabe von 1,0 ml Verdünnungsmittel (oder wie in der Packungsbeilage angegeben), um ein Produkt Durchstechflasche. Kurz beschallen (30 Sekunden). Dies wird einen 1mg/ml Lösung, die in 100 ul sterilen Behältern aliquotiert und gelagert werden kann bei 2-8 ° C bis zu einer Woche, oder gefroren für bis zu 3 Monaten. </li><li> Zur Vorbereitung arbeiten FSL konstruieren Lösungen für die Insertion, unmittelbar vor der Verwendung kurz beschallen (30 Sekunden) der Stammlösung keine Mizellen zu homogenisieren. Verdünnen Sie die FSL-Konstrukt in Puffer (vorzugsweise nicht mit Lipiden oder stark hydrophoben Material), um die Konzentration oder über einen Bereich erforderlich, falls gewünscht. </li></ol> Notes: <ol><li> FSL-Konstrukte werden in der Regel in Zellen einfügen in Lipid-haltigen Medien, sondern wird in der Regel so viel wie ein 50X höher FSL arbeitet Konzentrationen, als wenn in PBS oder andere Lipid-freien Medien erfordern. </li><li> Der Arbeitsbereich Verdünnungen wird über den Antrag, das Nachweisverfahren Sensibilität, die Art der FSL zu konstruieren, und der Grad der Modifikation erforderlich abhängen. Typischerweise ist das Spektrum der Verdünnung wird zwischen 10-500 pg FSL pro ml Verdünnungsmittel für den Kohlenhydrat-FSL-Konstrukte und 1-100 ug / mL für andere FSL Konstrukte wie Fluorophore und Biotin werden. </li><li> Wenn der Vorbereitung Einsetzen Verdünnungsmittel mit mehreren FSL konstruieren, fügen Sie einfach die Konstrukte gemeinsam in die gleiche Verdünnungsmittel bei ihrer normalen Arbeitszeit Konzentration. Wenn ein Konstrukt ist, bei viel höherer Konzentration als andere, können einige Anpassungen (Erhöhung) der Konzentration für das kleinere Bau benötigt werden. Alternativ Konstrukte können nacheinander zugegeben werden, vorzugsweise mit der höchsten Konzentration erste Konstrukt, gefolgt von den kleineren. </li><li> FSL konstruieren Konzentrationen oberhalb von 1000 pg / mL können erhebliche Mengen an Lipid in einer Zellmembran einzuführen, und kann die Form der Zelle zu ändern oder machen es anfälliger für Lyse. </li><li> FSL bauen funktionierende Lösungen sollten bei 2-8 ° C gelagert werden und innerhalb von wenigen Tagen. </li><li> FSL-Konstrukte können in Wasser verdünnt werden, sondern reduziert die Stabilität haben und muss innerhalb von Stunden verwendet werden. Wenn Sie die Packungsbeilage gibt Wasser als Verdünnungsmittel Rekonstitution des Produktes in die Durchstechflasche enthält auch Salze (wie in der Packungsbeilage angegeben). </li></ol> 2. Insertion von FSL Construct (s) in Membranen <ol><li> Waschen Sie zuerst die Zellen für FSL Modifikation frei von ungebundenen Lipide durch Zentrifugation und mit PBS-oder Lipid-freie Zelle Medien als Waschlösung. </li><li> Packen Sie die Zellen oder die Aussetzung in 100 ul Verdünnungsmittel. </li><li> Gleichzeitig bereiten Kontrollen, die im Idealfall sowohl unveränderte Zellen (Inkubation mit PBS anstatt FSL-Lösung) und / oder Zellen mit einer gutartigen, aber miteinander verbundene FSL konstruieren geändert werden sollte. </li><li> Geben Sie 100 ul einer geeigneten Verdünnung des FSL-Lösung (mit 1 oder mehr FSL Konstrukte) zu den Zellen und Inkubation für 1-2 Stunden bei 37 ° C. Ein ähnliches Ergebnis kann durch 6 Stunden Inkubation bei 25 ° C erreicht werden oder über Nacht (18 Stunden) bei 4 ° C - Mischen ist alle paar Stunden zu empfehlen, wenn schwere Zellsuspensionen verwendet werden. </li><li> Wash (optional) zweimal mit PBS oder Medium mit einem freien FSL Konstrukte zu entfernen und bereiten eine entsprechende Suspension. </li></ol> Notes: <ol><li> Das Verdünnungsmittel verwendet werden, um die Zellen aussetzen kann Zellkulturmedien, PBS, Zell-Storage-Lösungen, etc, aber möglichst ohne Fett (zB fötales Kälberserum) oder Detergenzien (zB Tween). </li><li> Unterschiedliche Volumina (100 mL) Verhältnisse (als 1:1-Zellen / FSL-Lösung) oder Inkubation Bedingungen von Zeit und Temperatur kann verwendet werden, sofern im gleichen Verhältnis, Konzentration und Volumen werden verwendet, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. </li></ol> 3. Handhabung und Visualisierung <ol><li> Sobald die FSL Änderung abgeschlossen ist die kodecytes können bei 4-8 ° C in Lipid-freien Medien gespeichert oder genutzt werden. </li><li> Kodecytes und kodevirions der Regel verhalten sich genauso wie unveränderten Zellen / Virionen und kann Handled und betrachtet unter normalen Testsysteme (Mikroskopie, Serologie, Durchflusszytometrie, etc). Sie haben meist keine besonderen Anforderungen außer für die Vermeidung von Lösungsmitteln / Detergenzien / Lipide, dass die Lipid-Konstrukte aus Membranen eluieren kann. </li></ol> Notes: <ol><li> Konstruiert wird in der Membran von inaktiven Zellen, wie rote Blutkörperchen bleiben, wenn in Lipid-freien Medien für das Leben der Zelle gespeichert ist. In Zellen mit aktiver Membranen der Konstrukte wird internalisiert und abgebaut werden, mit einer Rate abhängig Zellmembran Aktivität. </li><li> Tote Zellen werden in der Regel einen hohen Gehalt an FSL Konstrukte, dies kann verwendet werden, um lebensfähig Zellen von lebenden Zellen zu trennen. </li><li> Wenn kodecytes gespeichert sind (oder in vivo) in Lipid-haltigen Medien / Umgebungen, wie zB Serum / Plasma des Konstrukts wird langsam aus der Membran eluiert über einen Zeitraum von Stunden oder Tagen, je nach Temperatur-und Lipid-Konzentrationen / Kompositionen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: <ol><li> Die folgende repräsentative Ergebnisse sind abhängig von der Konstruktion verwendet werden (Tabelle 1), seine eingefügt Konzentration und die relative Sensitivität und Spezifität des Nachweises System (s). Im Allgemeinen sind alle FSL Konstrukte in die Zellen nach 1 Stunde einlegen, aber die optimalen Bedingungen müssen für jede Situation geschaffen werden. </li><li> FSL-Konstrukte können verwendet werden, um die Außenseite der eine Vielzahl von lebenden Zellen 3-9,11,14 Label sein. In den Beispielen in Abbildung 2 dargestellten Embryonen in verschiedenen Stadien verwendet wurden (da sie eine fragile Zelle sind), aber auch andere Zellen (Abbildung 3) oder umhüllt Virionen (Abbildung 4) können auch gekennzeichnet werden. FSL-Fluorescein ermöglicht die direkte Markierung von Oberflächen (Abbildungen 2-4), während FSL-Biotin und anderen FSL Konstrukte die Verwendung eines sekundären Detection System (in der Regel Avidin / Antikörper / Lektine) erfordern, um ihre Anwesenheit (Abb. 5) zeigen . </li><li> Blutgruppe Marker für die menschliche oder tierische Spezifität können Zellen, einschließlich Erythrozyten 4-9 (Abbildung 6) angebracht werden. Da die Höhe der FSL auf einem kodecyte Konstrukt ist kontrollierbar und reproduzierbar 4-6, können kodecytes für die Antikörper-Quantifizierung vorgenommen (Tabelle 2 und Abbildung 6). Die eigentliche Quelle der Zellen ist nicht wichtig, können sie alle Arten oder sogar von den gleichen Ursprung wie die Quelle des Antikörpers, wodurch eine auf dem nur unvereinbar Antigen ist, dass durch die FSL 7,8 (Abbildung 6) eingeführt. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3289/3289table2.jpg" alt="Tabelle 2" /> Tabelle 2. Repräsentativen serologischen Reaktionen von drei verschiedenen FSL-A (tri) red cell kodecytes gegen Verdünnungen von monoklonalen anti-A getestet. Die 50 uM Lösung von FSL-A (tri), wenn mit dem gleichen Volumen der Gruppe O Erythrozyten inkubiert produziert starke A-Antigen-positiven Zellen, die durch eine 1:512 Verdünnung des monoklonalen anti-A nachgewiesen werden konnte. Die 5 - und 10-fach niedriger FSL-A (tri)-Lösungen produziert kodecytes mit weniger Blutgruppe A-Antigen-Expression. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig1.jpg" alt="FSL konstruieren Überblick" /> Abbildung 1. FSL konstruieren Überblick. Wie eine Blume FSL Konstrukte besteht aus drei Hauptkomponenten. Die funktionalen Kopf (F) im Fall des FSL-Konstrukt kann eine Vielzahl von verschiedenen biologisch funktionellen Gruppen, einen Abstandshalter (S) entwickelt, um Abstand von F von der Membran zu induzieren, zu verbessern Wasserdispergierbarkeit und nicht-reaktiv mit Serum werden, während die Diacyl Lipid ermöglicht das Konstrukt spontan in Oberflächen zu integrieren. (I) FSL-GB3 mit einer Blutgruppe Gb 3 (oder P k) Trisaccharid Epitop Galα4Galβ4Glcβ. (II) FSL-A (tri) mit einer Blutgruppe A Trisaccharid Epitop GalNAcα3 (Fucα2) Galβ. (III) FSL-Fluorescein. (IV) FSL-Biotin mit einem Biotin-F-Gruppe. Die funktionelle Gruppe von Strukturen in I-III sind konjugiert zu einer aktivierten adipat Derivat Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), während die spacer der Struktur IV ist carboxymethylglycine-adipat basiert. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig2.jpg" alt="FSL-Fluorescein markierter muriner Embryonen" /> Abbildung 2. FSL-Fluorescein markierter muriner Embryonen. Alle Bilder von Live-Embryonen, die beschriftet, wenn ihre Zona pellucida (ZP) war intakt (dh der FSL-Konstrukt durch die ZP auf den Embryo innerhalb label bestanden) waren. Bilder I-IV sind der ZP-freien Embryonen aus ihrer ZP mit Säure Tyrodes post Markierung mit FSL-Fluorescein freigesetzt. Identische Färbung geschieht unabhängig davon, ob Embryonen wurden FSL mit ZP intakt oder ZP frei modifiziert. Die Embryonen werden direkt mit FSL-Fluorescein markiert, durch die 2 Stunden 37 ° C-Methode in serumfreien Zellkulturmedien, gewaschen und dann betrachtet unter Fluoreszenz-Mikroskopie. (I) ZP freien Zwei-Zell-Maus-Embryo, zeigt auch klassische intensive Polkörper Färbung. (II-III) ZP freien Vier-Zellen-und acht Zellen murine Embryonen, die beide zeigen schattenhafte Färbung der Zellen, die outs sindide dem Mikroskop Ebene konzentrieren. (IV) ZP free 16 Zelle murinen Embryo. (V) ZP intakte murine Blastozysten Embryonen (d4-d5), wo beide den Embryo und zona gekennzeichnet sind. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig3.jpg" alt="FSL-Fluorescein und Zebrafisch" /> Abbildung 3. FSL-Fluorescein und Zebrafisch 14. (I) Microangiography auf einem 52 HPF (Stunden nach der Befruchtung) Zebrafischlarven direkt in den Kreislauf mit FSL-Fluorescein injiziert. Der Zebrafisch Gefäßsystem ist gefärbt. (II) FSL-Fluorescein heterogenen Zebrafisch Nierengewebe Zellen (ZK kodecytes) wurden ex vivo erzeugt dann in den Kreislauf eines 52 hpf Empfänger Zebrafisch Mikro-Injektion. In-vivo-Beobachtungen des ZK kodecytes wurden 2 Stunden nach der Injektion durch die Abbildung der Gefäßsystem unter Fluoreszenz mit Zeitraffer-Mikroskopie. Gezeigt wird ein einzelnes Videobild mit großen langsamen oder unbewegliche Zellen (angegeben mit orange Pfeile) und schnelllebigen Zellen (verschwommene Bilder durch Bewegung - angezeigt durch grüne Pfeile). Labeling ermöglicht Echtzeit in vivo Beobachtung des Verhaltens und Bioverteilung des ZK kodecytes. (III) Die orale Aufnahme von FSL-Fluorescein erreicht durch Eintauchen Zebrafischembryonen in FSL-Fluorescein mit Medien für bis zu 5 Tage. Gewaschen wurde durch die Übertragung von Embryonen in die Medien, die keine FSL-Konstrukte (mindestens 6 Stunden erforderlich ist, kann aber für mehrere Tage) erreicht. (IIIa) Hellfeld-Mikroskopie der FSL-Fluorescein behandelt Zebrafisch entsprechend der angrenzenden Fluoreszenzbild (IIIb). Die Fluoreszenz wurde bevorzugt im Darm befindet. Keine Färbung wurde in unbehandelten Kontrolle Embryonen (IVa und IVb) beobachtet. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig4.jpg" alt="FSL-Fluorescein Kennzeichnung von Virionen" /> Abbildung 4. FSL-Fluorescein Kennzeichnung von Virionen 10 VSV und H1N1. (I) vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) wurde direkt mit 10 pg / ml FSL-Fluorescein für 2 h bei 37 ° C gekennzeichnet, gefolgt von Fixieren mit 4% Paraformaldehyd und dann Durchflusszytometrie. Keine Reinigung des VSV kodevirion post FSL Kennzeichnung erforderlich war. (II) Die Durchflusszytometrie von Schweinen Hodenzellen mit menschlichen A / Puerto Rico/8/1934 (H1N1) infiziert kodevirions beschriftet mit FSL-Fluorescein. Nicht infizierte Zellen werden als die schwarze Linie zu sehen, während Fusion der H1N1 kodevirion mit dem ST-Zellen führt zu einem fluoreszierenden Zellen (rote Linie). <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig5.jpg" alt="FSL-Biotin-markierten Zellen" /> Abbildung 5. FSL-Biotin-markierter Zellen und die anschließende Visualisierung über Avidin 7,8. Alle Zellen wurden zunächst mit FSL-Biotin für 1 h bei 37 ° C gekennzeichnet, gewaschen und dann mit Fluorophor markierten Avidin, gewaschen und nass für die Fluoreszenzmikroskopie montiert reagiert. (I) konfokale Abbildung eines murinen Embryo Blastozyste Zusammengestellt. (II) Central konfokalen Scheibe des Embryos aus dem vorhergehenden Bild. (III) Live beweglichen menschlichen Spermien - Unschärfe tritt als Folge ihrer Bewegung. (IV) Feste (4% Paraformaldehyd nach der Insertion) menschlichen Spermien. (V) Human Erythrozyten. (VI) Feste (4% Paraformaldehyd pre-Insertion) RL95 Endometrium menschlichen Karzinom. (VII) Unfixierte RL95 Endometrium menschlichen Zelllinie. (VIII) Biotin RBC kodecytes beobachtet in eine Blutprobe entnommen 2 Stunden nach der intravenösen Infusion von kodecytes mit (VIIIa), was einem Feld unter dem Lichtmikroskop while (VIIIb) ist das gleiche Feld unter Fluoreszenz angesehen, die Identifizierung der beiden kodecytes in das Feld -of-view. Berechnung des Verhältnisses der kodecytes zu unmarkierten Zellen verwenden können als ein Indikator für das Überleben. (IX) Live menschlichen Endometrium Biotin kodecytes visualisiert durch die Bindung an avidinylated Perlen. <img src="/files/ftp_upload/3289/3289fig6.jpg" alt="FSL-Kohlenhydrat der Blutgruppe Marker für serologische Profilierung hinzufügen" /> Abbildung 6. FSL-Kohlenhydrat der Blutgruppe Marker für serologische Profiling hinzuzufügen. (I) Human red cell Galili kodecytes wurden mit einer Reihe Konzentration von FSL-Galili (500 ug / mL) erstellt und getestet gegen Verdünnungen von humanem Serum. Menschliche rote Blutkörperchen nicht auf natürlichem Wege mit dem xenoantigen Galili Antigen auftreten. Solche kodecytes können quantitative Antikörperspiegel im Serum verwendet werden. In diesem Beispiel ist der Spender war entschlossen, eine Anti-Galili Titer von 1:32 haben. (II) Durch die Schaffung kodecytes mit Verminderung der Zahl der FSL (&quot;Antigen-Titer&quot;), eine optimale Antigen Ebene Antikörper erkennen bestimmt werden kann (in diesem Beispiel Le a) sein. Die Zellen können erstellt, um nur ein positives Ergebnis, wenn der Antikörper bei Überschreiten einer bestimmten Titer werden. Die Höhe der FSL-Antigen erforderlich, um ein positives Ergebnis geben, hängt von der Qualität und das Niveau der Antikörper erkannt wird. Für Kohlenhydrat-Antigene, wird ein FSL Lösung von 100 ug / ml in der Regel in einer starken positiven Reaktion führen. (III) Human Gruppe O roten Zellen wurden modifiziert, um ein bestimmtes Niveau der A ant habenigen (standardisierte A kodecytes) und verwendet werden, um präzise und reproduzierbar quantifizieren anti-A in humanem Serum. In diesem Beispiel ist die Anti-A-Titer in der Gruppe O-Serum getestet wird 1:32 und die kodecytes wurden vom Spender der eigenen roten Blutkörperchen vorbereitet. (IV) Blutgruppe A und B-Antigene gleichzeitig in einer einzigen Gruppe O red cell Probe eingefügt werden verwendet, um ein schwaches B schwach kodecytes erstellen. Diese kodecytes kann für ABO Qualitätskontrolle verwendet werden. Dieses Ergebnis zeigt die Analyse einer speziell formulierten Ein schwaches B schwach kodecyte gegen Anti-A und Anti-B-Reagenzien getestet und gibt erwarteten schwachen Reaktionen.

<ol>
	<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Strable, E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+of+viruses+and+virus-like+particles.">Chemical modification of viruses and virus-like particles.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 327, 1-21 (2009).</li><li>Henry, S., Bovin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+synthetic+peptidolipids,+glycolipids+and+other+lipid-linked+structures+to+create+designer+red+cells.">The development of synthetic peptidolipids, glycolipids and other lipid-linked structures to create designer red cells.</a> Transfusion. 48, 194A-194A (2008).</li><li>Frame, T., Carroll, T., Korchagina, E., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+glycolipid+modification+of+red+blood+cell+membranes.">Synthetic glycolipid modification of red blood cell membranes.</a> Transfusion. 47, 876-882 (2007).</li><li>Hult, A. K., Frame, T., Henry, S., Olsson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+evaluation+of+red+blood+cells+transformed+with+variable+amounts+of+synthetic+A+and+B+glycolipids.">Flow cytometry evaluation of red blood cells transformed with variable amounts of synthetic A and B glycolipids.</a> Vox Sang. 95, 180-180 (2008).</li><li>Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+red+blood+cells+for+laboratory+quality+control+use.">Modification of red blood cells for laboratory quality control use.</a> Curr. Opin. Hematol. 16, 467-472 (2009).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+neutralization+of+anti-A+and+successful+transfusion+of+A+antigen+incompatible+red+cells+in+an+animal+model.">In vivo neutralization of anti-A and successful transfusion of A antigen incompatible red cells in an animal model.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Oliver, C., Blake, D., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+transfusion+reactions+and+predicting+in+vivo+cell+survival+with+kodecytes.">Modeling transfusion reactions and predicting in vivo cell survival with kodecytes.</a> Transfusion. , (2011).</li><li>Heathcote, D., Carroll, T., Wang, J. J., Flower, R., Rodionov, I., Tuzikov, A., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+antibody+screening+cells,+MUT+Mur+kodecytes,+created+by+attaching+peptides+onto+erythrocytes.">Novel antibody screening cells, MUT+Mur kodecytes, created by attaching peptides onto erythrocytes.</a> Transfusion. 50, 635-641 (2010).</li><li>Hadac, E. M., Federspiel, M. J., Chernyy, E., Tuzikovb, A., Korchagina, E., Bovin, N. V., Russell, S. J., Henry, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+and+radiolabeled+Function-Spacer-Lipid+constructs+allow+for+simple+in+vitro+and+in+vivo+bioimaging+of+enveloped+virions.">Fluorescein and radiolabeled Function-Spacer-Lipid constructs allow for simple in vitro and in vivo bioimaging of enveloped virions.</a> J Virol Meth. 10, (2011).</li><li>Blake, D., Lan, A., Love, D., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-kodecytes+-+fluorescent+function-spacer-lipid+(FSL)+modified+cells+for+in+vitro+and+in+vivo+analyses.">Fluorophore-kodecytes - fluorescent function-spacer-lipid (FSL) modified cells for in vitro and in vivo analyses.</a> FEBS J.. 277, 199-199 (2010).</li><li>Harrison, A. L., Olsson, M. L., Brad Jones, R., Ramkumar, S., Sakac, D., Binnington, B., Henry, S., Lingwood, C. A., Branch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+globotriaosylceramide+analogue+inhibits+HIV-1+infection+in+vitro+by+two+mechanisms.">A synthetic globotriaosylceramide analogue inhibits HIV-1 infection in vitro by two mechanisms.</a> Glycobiology. 27, 515-524 (2010).</li><li>Barr, K., Diegel, O., Parker, S., Bovin, N., Henry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function-Spacer-Lipid+(FSL)+constructs+enable+inkjet+printing+of+blood+group+antigens.">Function-Spacer-Lipid (FSL) constructs enable inkjet printing of blood group antigens.</a> FEBS J. 277, 235-235 (2010).</li><li>Lan, C. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modeling inflammatory bowel disease [dissertation]. , (1988).</li></ol>

Deborah A. Blank und Stephen M. Henry sind die Mitarbeiter und Aktionäre der KODE Biotech Limited der Patentinhaber der KODE-Technologie. Dan Bess ist ein Mitarbeiter von Sigma-Aldrich, die die Produktion dieses Video-Artikel gesponsert hat.

Ändern Zellen und Virionen mit FSL-Konstrukten ist eine sehr einfache und robuste Technik 3-11. Um zu beschreiben und zu unterscheiden FSL konstruieren modifizierten Zellen und Virionen von unveränderten Zellen, sie sind kodecytes und kodevirions jeweils 6-10 bezeichnet, aber nur, wenn die eingeführte funktionelle Gruppe kann gezeigt werden, enthalten auf ihrer Membran. Wenn kodecytes mit verschiedenen Konzentrationen von FSL Konstrukte hergestellt werden, können sie durch die Konzentration der FSL konstruieren Lösung zur Erstellung verwendet wurden, zB 15 pg / mL A kodecytes, oder wenn mehr als eine FSL wird dann verwendet, eine kombinierte Terminus bezeichnet werden, z. B. A + Biotin kodecytes 7,8. Wenn verschiedene Zellen verglichen, darunter die Zelle Typ in der Beschreibung werden sollen, wird empfohlen, z. B. red cell Biotin kodecytes oder Endometrium-Biotin kodecytes 7,8. Obwohl der Prozess des Einsetzens ist sehr robust und Einfügen (wenn auch mit unterschiedlicher Geschwindigkeit) wird über einen großen Temperaturbereich von 4 auftreten - 37 ° C und innerhalb von Minuten bis Stunden, um reproduzierbare Einsetzen strenge Kontrolle der Einwirkzeit, Temperatur, FSL-Konzentration zu erhalten ( einschließlich Verdünnungsmittel Formulierung) und in geringerem Maße Zellkonzentration erforderlich sind. Bis heute alle FSL Konstrukte verwendet werden, um Zellen mit der gleichen Technik 4-11 verändern, aber es wird erwartet, dass bestimmte Bedingungen wird günstiger sein, Work-flow-und / oder den optimalen Umgang mit Anforderungen der Zellen / Virionen geändert werden . Die genaue FSL-Konzentration, um den gewünschten Effekt zu erzielen muss durch den Anwender 4 ermittelt werden. Der resultierende FSL konstruieren veränderten Zellen / Virionen können in der Regel in der gleichen Weise wie eine unveränderte Zelle / Virion in biologischen oder analytische Systeme 4-11 verwendet werden. Wie der FSL Konstrukte wird langsam von modifizierten Oberflächen eluieren bei Kontakt mit Lipid-Lösungen 7,8, oder durch aktive Zellen 11 konsumiert werden, müssen diese Fragen in Bezug auf den Pegel des Signals oder die Aktivität über die Zeit hinweg erhalten in Betracht gezogen werden. Kodecytes kann fest (z. B. Glutaraldehyd / Formalin) werden nach dem Einsetzen sofern das Fixativ enthält keine Lipid-eluting Lösungsmittel und der funktionellen Gruppe ist kompatibel mit dem Fixateur. Alternativ fixierten Zellen können mit FSL Konstrukte modifiziert werden. Neben der Änderung der Zell-und Virion Oberflächen FSL-Konstrukte können auch direkt in den Kreislauf von Labortieren verursacht in vivo Modifikation von zirkulierenden Zellen 7 infundiert werden und Viren 12, Toxine, 12 und 7 Antikörper zu hemmen. FLS Konstrukte wurden ebenfalls verwendet, um Liposomen dekorieren und kann auf Papier Flächen 13, wo sie bewegungsunfähig gedruckt werden, und kann dann in diagnostischen Assays verwendet werden. Die Fähigkeit, auf einfache Weise ändern lebende Zellen mit einer wachsenden Palette von FSL Konstrukte erweisen sollte ein nützliches Werkzeug für Forschung und Entwicklung für das Studium der Zelloberfläche Biologie sein.

<img src="/files/ftp_upload/3289/3289table1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Handelsübliche FSL Konstrukte in diesem Papier beschrieben.

fsl constructs: a simple method for modifying cell/virion surfaces with a range of biological markers without affecting their viability

Die Möglichkeit zum Ändern / Visualisierung biologischer Oberflächen, und dann studieren die modifizierte Zelle / Virion in einer Reihe von in vitro und in vivo-Umgebungen ist wichtig, gelungen, weitere Einsichten in die Funktion von spezifischen Molekülen oder das gesamte Unternehmen. Studium der biologischen Oberflächenmodifizierung sind in der Regel zur Gentechnik des Organismus oder die kovalente Bindung von chemischen Einheiten an die Zelloberfläche 1,2 begrenzt. Allerdings sind diese traditionellen Techniken setzen die Zelle chemische Reaktionspartner, oder sie erfordern einen erheblichen Manipulationen um das gewünschte Ergebnis zu erzielen, so dass sie mühsam, und sie können auch versehentlich die Lebensfähigkeit / Funktionalität der veränderten Zelle. Eine einfache Methode, um harmlos zu modifizieren der Oberfläche von Zellen erforderlich ist. Kürzlich wurde eine neue Technologie, hat KODE Technologie eine Reihe von neuen Konstrukten, bestehend aus drei Komponenten eingeführt: eine funktionelle Kopfgruppe (F), einen Abstandshalter (S) und einer Lipid-tail (L) und sind als Funktions-Spacer-Lipid-oder FSL bekannt constructs3. Der Spacer (S) wird ausgewählt, um ein Konstrukt, das in Wasser dispergierbar ist zu schaffen, noch spontan und stabil in einer Membran zu integrieren. FSL konstruieren funktionelle Einheiten (F) so weit zählen eine Reihe von Sacchariden wie Blutgruppe Determinanten, Sialinsäuren, Hyaluronsäure Polysaccharide, Fluorophore, Biotin, radioaktive Marker, und eine Reihe von Peptiden 3-12. FSL Konstrukte zu modifizieren Embryonen, Spermien, Zebrafisch, epithelialen / Endometrium-Zellen, rote Blutkörperchen und Virionen verwendet worden, um Qualitätskontrollen Systeme und diagnostische Platten, zu schaffen, um die Zelladhäsion / Interaktion / Trennung / Immobilisierung ändern und für die in vitro und in vivo-Bildgebung von Zellen / Virionen 3-12. Der Prozess der Modifikation von Zellen / Virionen ist generisch und extrem einfach. Die häufigste Verfahren ist die Inkubation von Zellen (in Lipid-freien Medien) mit einer Lösung für FSL Konstrukte für 1-2 Stunden bei 37 ° C 4-10. Während der Inkubation der FSL Konstrukte spontan integrieren in die Membran, und der Prozess abgeschlossen ist. Waschen ist optional. Zellen durch FSL Konstrukte modifiziert werden als kodecytes 6-9 bekannt, während Virionen kodevirions 10 sind. FSL Konstrukte als direkte Infusionen und kodecytes / kodevirions in experimentellen Tiermodellen 7,8,10 benutzt worden sein. Alle kodecytes / kodevirions scheinen ihre normale Vitalität und Funktionalität zu behalten, während gewinnt die neue Funktion der F-Einheit 7,8,10,11. Die Kombination von Dispergierbarkeit in biokompatiblen Medien, spontane Einbau in Zellmembranen, und scheinbare geringe Toxizität, macht FSL Konstrukte wertvolle Recherche-Tools für die Untersuchung von Zellen und Virionen.

Watch this Scientific Journal Video about FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability at JoVE.com

FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

Function-Spacer-Lipid (FSL) Konstrukte erlauben die Oberflächeneigenschaften von lebenden Zellen und Virionen ohne Verlust der Vitalität geändert werden. Die Methode erfordert nur einfache Berührung eines FSL konstruieren Lösung mit einer Zelle / Virion und spontan und stabile Oberfläche Einarbeitung erfolgt.

FSL Konstrukte: Eine einfache Methode für das Ändern von Cell / Virion Oberflächen mit einer Reihe von biologischen Markern, ohne die Durchführung

The ability to modify/visualize biological surfaces, and then study the modified cell/virion in a range of in vitro and in vivo environments is essential ...

fsl-constructs-simple-method-for-modifying-cellvirion-surfaces-with

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Aufrufe.  AUT University and KODE Biotech Ltd. Function-Spacer-Lipid (FSL) Konstrukte erlauben die Oberflächeneigenschaften von lebenden Zellen und Virionen ohne Verlust der Vitalität geändert werden. Die Methode erfordert nur einfache Berührung eines FSL konstruieren Lösung mit einer Zelle / Virion und spontan und stabile Oberfläche Einarbeitung erfolgt.

Serie: FSL Constructs: A Simple Method for Modifying Cell/Virion Surfaces with a Range of Biological Markers Without Affecting their Viability

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Forschung

Krebsforschung

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic applications and vaccine development.1,2,3 Current approaches to modifying viral surfaces, which are mostly genetics-based, often suffer from attenuation of virus production, infectivity and cellular transduction.4,5 Using chemoselective click chemistry, we have developed a straightforward alternative approach which sidesteps these issues while remaining both highly flexible and accessible.1,2
The goal of this protocol is to demonstrate the effectiveness of using bioorthogonal click chemistry to modify the surface of adenovirus type 5 particles. This two-step process can be used both therapeutically1 or analytically,2,6 as it allows for chemoselective ligation of targeting molecules, dyes or other molecules of interest onto proteins pre-labeled with azide tags. The three major advantages of this method are that (1) metabolic labeling demonstrates little to no impact on viral fitness,1,7 (2) a wide array of effector ligands can be utilized, and (3) it is remarkably fast, reliable and easy to access.1,2,7
In the first step of this procedure, adenovirus particles are produced bearing either azidohomoalanine (Aha, a methionine surrogate) or the unnatural sugar O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), both of which contain the azide (-N3) functional group. After purification of the azide-modified virus particles, an alkyne probe containing the fluorescent TAMRA moiety is ligated in a chemoselective manner to the pre-labeled proteins or glycoproteins. Finally, an SDS-PAGE analysis is performed to demonstrate the successful ligation of the probe onto the viral capsid proteins. Aha incorporation is shown to label all viral capsid proteins (Hexon, Penton and Fiber), while O-GlcNAz incorporation results in labeling of Fiber only.
In this evolving field, multiple methods for azide-alkyne ligation have been successfully developed; however only the two we have found to be most convenient are demonstrated herein &#x2013; strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) and copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosphere.

Adenovirus particles are engineered to contain either the unnatural amino acid analogue azidohomoalanine or the azido sugar O-GlcNAz. The azide group of each is chemoselectively ligated via "click" chemistry reactions as a means of viral surface modification.

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

Immunologie und Infektion

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Biotechnik

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Biologie

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with respect to how viral members of the microbiome affect subsequent microbe interactions with these virus-infected host cells. The co-habitation of virus with bacteria and fungi is principally present on the mucosal surfaces of the oral cavity and genital tract. Mucosal cells, particularly those with persistent chronic or persistent latent viral infections, could have a significant impact on members of the microbiome through virus alteration in number and type of receptors expressed. Modification in host cell membrane architecture would result in altered ability of subsequent members of the normal flora and opportunistic pathogens to initiate the first step in biofilm formation, i.e., adherence. This study describes a method for quantitation and visual examination of HSV&#39;s effect on the initiation of biofilm formation (adherence) of S. aureus and C. albicans.

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, genetic programmability, and biodegradability. While they&#39;re highly amenable to bioconjugation reactions for adding synthetic ligands onto their surface, the range in bioconjugation methodologies on these aqueous born capsids is relatively limited. To facilitate the direction of functional biomaterials research, non-traditional bioconjugation reactions must be considered. The reaction described in this protocol uses dibromomaleimides to introduce new functionality in the solvent exposed disulfide bonds of a VLP based upon Bacteriophage Q&#946;. Furthermore, the final product is fluorescent, which has the added benefit of generating a trackable in vitro probe using a commercially available filter set.

Here, we present a procedure to fluorescently functionalize the disulfides on Q&#946; VLP with dibromomaleimide. We describe Q&#946; expression and purification, the synthesis of dibromomaleimide-functionalized molecules, and the conjugation reaction between dibromomaleimide and Q&#946;. The resulting yellow fluorescent conjugated particle can be used as a fluorescence probe inside cells.

Konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche Partikel durch Dibromomaleimide-Disulfid Chemie zu machen

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arboviren Infektionen als Screening-Tools für die Identifizierung von viralen Immunmodulatoren und Host antiviralen Faktoren

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

<meta charset="utf8"></head><body>Analyse von SARS-CoV-2 mittels Dual-Reporter- und Multiplex-Technologie

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung antiviraler Strategien durch neuartige Immuneinfang- und Massenspektrometrietechniken

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

Profilierung von Oberflächenprotein-Epitopen auf viralen Partikeln mittels Multiplex-Dual-Reporter-Strategie

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...