Diese Arbeit wurde von NEI und NIMH finanziert.

1. Videoumschalter 1.1. Verbinden mit einem Computer Videoumschalter Die Videoumschalter (1) empfängt analoge Video (VGA) Eingänge und wird verwendet, um Kathodenstrahlröhre (CRT) Farbmonitore fahren. Vor der Verwendung der Videoumschalter, ob der Computer-Grafikkarte verfügt entweder über einen VGA-Anschluss (2A) oder einen Digital Visual Interface (DVI-I)-Anschluss (2B), die sowohl digitale als auch analoge Videosignale überträgt. Ein DVI-zu-VGA-Adapter (Abbildung 2C) ist notwendig, um die DVI-I Anschluss mit dem Videoumschalter anschließen. Schalten Sie den Computer und Monitor aus und trennen Sie den Monitor vom Computer Grafikkarte. Schließen Sie das VGA-oder den DVI-I-Anschluss des Computers Grafikkarte mit dem Eingang-Port des Videoumschalter mit dem mitgelieferten VGA-Kabel. Verwenden Sie einen kleinen Schraubendreher, um die Verbindungen zu sichern. Schließen Sie den Monitor VGA-Kabel an den Ausgang des Videoumschalter einND sichern die Anschlüsse. Schließen Sie das Videoumschalter an eine Stromquelle mit dem mitgelieferten Netzteil. Schalten Sie den Computer und den Monitor. 1.2. Zwei Anzeigemodi des Video-Switcher Der Schalter-Taste auf der Videoumschalter kann der Benutzer hin-und her zu schalten in zwei Modi dargestellt. In der Farben-Modus, wird der Videoumschalter nichts an der Video-Signal vom Computer Grafikkarte. In der Graustufen-Modus, wird die Anzeige monochromatischen, mit Luminanz überwiegend durch das Videosignal von der Blau-Kanal von der Grafikkarte, leicht durch das Signal von dem roten Kanal beeinträchtigt ist, und ohne Beteiligung des grünen Kanals bestimmt. Dies ist, weil die Widerstands-Netzwerk innerhalb der Videoumschalter dämpft das Signal von dem roten Kanal um einen Faktor von ungefähr 128, und das Signal von den grünen Kanal überhaupt nicht wirken. Das Verhältnis der Beiträge von den blauen eind Rotkanäle mit dem Ausgang der Videoumschalter wird als Blau-nach-Rot-Verhältnis (BRratio). Das ist BRratio Eigenschaft eines Video-Umschalter, unabhängig von der Display-Setup. Es kann experimentell für jede Videoumschalter (siehe 1.3) bestimmt werden. Die Anzeige kann auch durch Senden eines speziellen Signals durch den grünen Kanal der Grafikkarte mit einem Aufruf der Funktion in Matlab geschaltet werden: PsychVideoSwitcher (&#39;SwitchMode&#39;, whichScreen, ToGrayMode); wo ToGrayMode von 1 oder 0 bedeutet, zu wechseln, Graustufen-oder Farb-Modus. Abbildung 3 zeigt die schematische Darstellung eines Videoumschalter. 1.3. Messen Sie BRratio Die BRratio kann für jeden Videoumschalter gemessen werden mit Hilfe eines Rechtecksignals Gitter Erkennung Aufgabe. Die beiden Ebenen der Rechteckwelle RGB-Werte wie (0, 0, 40) zugeordnet ist und (x, 0, 39). Man kann den Wert von x bis zum Rechteck Gitter anpassenverschwindet, an welchem ​​Punkt der x-Wert der BRratio ist --- die Größe des Signals in der R-Kanal, der der Intensität um eine Einheit des Signals in den B-Kanal hergestellt führt. Obwohl man die BRratio elektronisch messen kann, zum Beispiel, um das Verhältnis der Spannungsausgänge eines Videoumschalter bei RGB-Werte (0, 0, 255) und (255, 0, 0) zu messen, ist die psycho hier beschriebenen Verfahren sehr einfach und genau. 1.4. Display-Kalibrierung Für die meisten Monitoren erzeugt Anzeigeluminanz nicht linear mit der Graustufenwert von der Grafikkarte des Computers festgelegt. Die Beziehung kann wie folgt beschrieben werden: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq1.jpg" alt="Gleichung 1" /> wobei L max, L min und γ mit einer Gamma-Korrektur Verfahren bestimmt, entweder mit Photometer oder durch eine Kombination der psycho Verfahren und photometrische Messungen 7,8. Gamma-Einstellung important eine genaue Kontraste auf einer Anzeige zu erzeugen, es muss für jede Anzeigevorrichtung durchgeführt werden. Mit einem Photometer, kann man einfach zeigen eine große einheitliche quadratische Pixel bei verschiedenen Graustufen (z. B. von 0 bis 255), messen die Helligkeit der Mitte des Platzes, und passen Sie die Ergebnisse mit Gleichung 1 zu γ erhalten. Die psychophysische Verfahren umfasst das Erstellen, in einem Bereich der Sichtfläche, die eine möglichst gleichmäßige Mischung (in Raum und Zeit) von gleichen Mengen von Null-und Voll-Pixel-Intensität und Bestimmen der Grauwert von Pixeln in einer benachbarten homogenen Bereich ( bei dem alle Pixel die gleiche Intensität haben), die erzeugt eine psycho Übereinstimmung mit der Helligkeit des gemischten-Pixel-Bereich. Das erste Spiel bestimmt den Grauwert-Wert für 1/2 der maximalen Leuchtdichte. Eine Mischung von Pixeln mit Luminanzintensitäten 1/2 und 1 verwendet, um die 3/4 zu bestimmen, und dieses Verfahren wird wiederholt, bis sieben Werte fROM 1/8 bis 7/8 bestimmt worden sind. Diese Spiele werden wiederholt, und verschiedene Prüfungen auf Konsistenz hergestellt werden, wie zum Beispiel überprüfen, ob eine Mischung aus 3/4 und 1/4 Spiele 1/2. In diesem Verfahren werden sowohl der B und R Ebenen der homogenen Bereich eingestellt, und U = B + R / BRratio. Die Ergebnisse lassen sich mit Gleichung 1 angepasst werden, um γ zu erhalten. Nachdem wir Werte von L min, L max und γ zu erhalten, können wir den Hintergrund Leuchtdichte L 0 = (L + L max min) / 2, ist die Beziehung zwischen Pixel-Kontrast c (U) und U-Graustufenwert: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq2.jpg" alt="Gleichung 2" /> Wir können die Gleichung umschreiben, um das gewünschte Grauwert für einen bestimmten Gegensatz zu lösen: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq3.jpg" alt="Gleichung 3" /> wobei U ist in der Regel eine nicht-ganze Zahl ist. Der RGB-Wert des entsprechenden Pixels ist: R = BRratio * [U-int (U)], G = 0, B =int (U), wo int () stellt den ganzzahligen Wert ihres Eingangs. 1.5. Demo einer Sinuswelle Gitter Der Effekt des erhöhten Graustufenauflösung kann durch den Vergleich zweier Sinuswelle Gitter angezeigt werden. Das Gitter auf der linken verwendet die volle Kapazität der Videoumschalter mit jedem Pixel-Intensität mit dem entsprechenden R und B-Werte angegeben. Das Gitter auf der rechten Seite ist die gleiche wie die linke außer dass nur die abgerundeten U als B-Wert jedes Pixels verwendet, imitiert die Ausgabe eines 8-Bit-Anzeigevorrichtung. 2. RTbox 2.1. Schließen Sie das RTbox an einen Computer Schließen Sie das RTbox (Abbildung 4) an einen USB-Port eines Computers mit dem mitgelieferten Kabel. Bei Bedarf laden Sie den Treiber des Gerätes aus <a href="http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm">http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm</a> . Installieren Sie den Treiber gemäß den Anweisungen auf der Website. 2.2. Verwenden Sie die RTBox Reaktionszeit messen Die RTbox kann auf zwei verschiedene Arten verwendet werden. Wenn der Benutzer des Programms können zuverlässige Reizbeginn mal, wie die Zeit von Screen wieder zurückkehren (&#39;Flip&#39;) und PsychPortAudio in Psychtoolbox [8], die RTbox kann wie eine Tastatur verwendet werden. Weil Reizbeginn Zeiten und RTbox Taste mal die Uhren von dem Host-Computer und dem RTbox basieren, bzw. müssen wir synchronisieren die beiden Uhren. Dies wird mit einem Aufruf der Funktion RTBox (&#39;clear&#39;) vor jedem Beginn des Stimulus, um unerwünschte Ereignisse im Puffer löschen getan. Die Reaktionszeit kann einfach gemessen werden, wie t bzw. = t - t Beginn, wo Tonset ist die Anregung aus dem Anwenderprogramm zurück, und t ist die Zeit, die der Schaltfläche Funktionsaufruf [t, Taste] = RTBox zurück (Timeout). Dies liegt daran, RTBox Treiber wandelt automatisch die Taste Zeit von der Zeit, RTbox Computer Zeit auszurichten. Wenn der Benutzer des Programms kann nichtzurück zuverlässige Reizbeginn Zeiten muss Triggersignale anzeigt Stimulus Onset der RTbox Verfügung gestellt werden. Eine Lösung ist, einen Lichtsensor verwendet, um das Einsetzen des Reizes oder ein Lichtfleck, der auf den Reiz synchronisiert wird, zu detektieren. Der Ausgang des Lichtsensors mit der Lichtöffnung des RTbox verbunden. Eine zweite Lösung besteht darin, die Trigger-Ausgang der Videoumschalter verwenden. Der Trigger kann direkt an den Puls-Port des RTbox angeschlossen werden. Eine dritte Lösung ist, um das Audiosignal des Host-Computers auf die Schallöffnung des RTbox verbinden. Um eine Stimulusbeginn Trigger aus der Videoumschalter zu generieren, den grünen Kanal der Pixel in dem zentralen Abschnitt des ersten Rahmens des visuellen Stimulus &quot;einschalten&quot;. Weil es nicht mit dem Widerstand Netzwerks beitragen wird, ist das Signal im grünen Kanal unsichtbar für das Sachgebiet. Ein Aufruf der Funktion [t, Taste] = RTBox (&quot;Puls&quot;, Timeout) gibt die Antwort Zeit, wo &quot;Puls&quot; weist den RTbox zu berechnen t<html> er Ansprechzeit Bezug auf den Trigger. Die gleiche Funktion Anruf wird für Sound-Trigger verwendet. Für Lichtsensor Trigger, ist der Aufruf der Funktion [t, Taste] = RTBox (&quot;light&quot;, Timeout). 3. Integrieren Videoumschalter und RTbox Wir haben ein Demo-Programm, das die Videoumschalter verwendet, um das Display, die RTbox, um eine genaue Antwort Zeit zu sammeln, und die RTbox zu Event-Code und die Reaktionen auf ein ERP-System senden Steuerung programmiert. Das Programm kann heruntergeladen werden unter <a href="http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m">http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m</a> . 4. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Bild von einem Video-Switcher. Es verfügt über VGA-Eingang und-Ausgang (beide weiblich), eine Schaltfläche, um zwischen zwei Anzeigemodi umschalten, und einen Trigger-Ausgang. NHALT &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Bilder von VGA (A) und DVI-I (B)-Ports und ein DVI-I auf VGA-Adapter (C). <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Das Schema eines Video-Switcher. Der Multiplexer weist zwei Eingabemodi, durch eine Spannung gesteuert. Wenn es in dem Modus in der schematischen gezeigt ist, die RGB-Kanäle von einem Monitor das gleiche Signal erhalten, so dass sich das Display im Graustufen-Modus. Die Schaltspannung wird von einem CPLD-Chip, durch Signale in der G-Kanal und dem Schaltknopf gesteuert erzeugt. Der Auslöser wird auch durch den Eingang in der G-Kanal gesteuert werden. <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Bild von einem RTbox. Es verfügt über eine USB-B-Port, ein Licht-Eingang, einen Puls / Ton-Eingang, einen externen Taster-Eingang und einen TTL-Ausgang.

<ol>
	<li>Li, X., Lu, Z. -. L., Xu, P., Jin, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+high+gray-level+resolution+monochrome+displays+with+conventional+computer+graphics+cards+and+color+monitors.">Generating high gray-level resolution monochrome displays with conventional computer graphics cards and color monitors.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 9-18 (2003).</li><li>Pelli, D. G., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+control+of+contrast+on+microcomputer+displays.">Accurate control of contrast on microcomputer displays.</a> Vision Research. 31, 1337-1350 (1991).</li><li>Li, X., Liang, Z., Kleiner, M., Lu, Z. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTbox:+A+device+for+highly+accurate+response+time+measurements.">RTbox: A device for highly accurate response time measurements.</a> Behavior Research Methods. 42 (1), 212-225 (2010).</li><li>Lu, Z. L., Sperling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-order+reversed+phi.">Second-order reversed phi.</a> Perception Psychophysics. 61, 1075-1088 (1999).</li><li>Colombo, E., Derrington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+calibration+of+CRT+monitors.">Visual calibration of CRT monitors.</a> Displays. 22, 87-95 (2001).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Video-Switcher bietet eine kompakte, kostengünstige und einfach zu bedienende Methode zur Erzeugung hoher Leuchtdichte-Auflösung zeigt mit herkömmlichen Computer-Grafikkarten und analogen Farb-Monitore. Es befindet sich zwischen den analogen Ausgängen der Grafikkarte und den Monitor angeschlossen. Es kann auch zwischen monochrome und farbige Display-Modi zu wechseln, eine zusätzliche Erleichterung. Seine Triggerkanal ermöglicht es den Forschern, andere Geräte zu synchronisieren, visuelle Displays. <p clas...

enabling high grayscale resolution displays and accurate response time measurements on conventional computers

Display-Systeme auf konventioneller Basis von Computer-Grafikkarten sind in der Lage die Erzeugung von Bildern mit 8-Bit-Graustufen-Auflösung. Allerdings verlangen die meisten Experimente in der Forschung Vision Displays mit mehr als 12-Bit-Luminanz-Auflösung. Mehrere Lösungen sind verfügbar. Bit + + 1 und DataPixx 2 Verwenden Sie den Digital Visual Interface (DVI)-Ausgang von Grafikkarten und hochauflösende (14 oder 16-Bit) Digital-Analog-Wandler, um analoge Anzeigegeräte zu fahren. Der Videoumschalter drei hier beschriebenen kombiniert analoge Video-Signale von den roten und blauen Kanäle von Grafikkarten mit unterschiedlichen Gewichten mit einem passiven Widerstands-Netzwerk 4 und eine aktive Schaltung, um identische Video-Signale auf die drei Kanäle von Farbmonitoren zu liefern. Das Verfahren stellt eine kostengünstige Möglichkeit, hochauflösende monochrome Displays unter Verwendung herkömmlicher Grafikkarten und analogen Monitoren ermöglichen. Es kann auch Triggersignale das zur Kennzeichnung verwendet werden könnenStimulus Onset, macht es einfach, visuelle Displays mit physiologischer Aufnahmen oder Ansprechzeit Messungen zu synchronisieren. Obwohl der Computer Tastaturen und Mäuse häufig bei der Messung Reaktionszeiten (RT) verwendet werden, ist die Genauigkeit der Messungen sehr gering. Die RTbox ist eine spezialisierte Hardware-und Softwarelösung für genaue Messungen RT. Verbunden mit dem Host-Computer über eine USB-Verbindung, ist der Fahrer des RTbox kompatibel zu allen gängigen Betriebssystemen. Es verfügt über einen Mikroprozessor und hochauflösende Uhr, um die Identität und den Zeitpunkt der Taste Ereignisse, die zwischengespeichert werden, bis der Host-Computer ruft sie werden, erfassen. Die aufgezeichneten Ereignisse Button sind nicht durch mögliche zeitliche Unsicherheiten oder spannt mit Datenübertragung und-verarbeitung in den Host-Computer verbunden betroffen. Der asynchrone Lagerung vereinfacht das Design von Anwenderprogrammen. Mehrere Methoden stehen zur Verfügung, um die Uhren der RTbox und den Host-Compu synchronisierenER. Die RTbox können sich auch externe Trigger und RT verwendet werden, um in Bezug auf externe Ereignisse zu messen. Sowohl Videoumschalter und RTbox stehen zur Verfügung für Benutzer zum Kauf. Die relevanten Informationen und viele Demonstration finden Sie unter <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a> .

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Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

Herkömmliche Computer-Hardware kann keine visuelle Reize mit ausreichend hoher Graustufenauflösung Antwortzeiten zu messen und mit ausreichender Genauigkeit. Wir beschreiben, wie die Videoumschalter, um hochauflösende monochrome Displays zu produzieren, und die Reaktionszeiten zu RTbox mit hoher Genauigkeit zu messen herkömmlichen Computer-Hardware zu verwenden.

Enabling High Graustufen auflösende Displays und präzise Antwort Zeitmessungen auf herkömmlichen Computern

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

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9.3K Aufrufe.  The Ohio State University. Herkömmliche Computer-Hardware kann keine visuelle Reize mit ausreichend hoher Graustufenauflösung Antwortzeiten zu messen und mit ausreichender Genauigkeit. Wir beschreiben, wie die Videoumschalter, um hochauflösende monochrome Displays zu produzieren, und die Reaktionszeiten zu RTbox mit hoher Genauigkeit zu messen herkömmlichen Computer-Hardware zu verwenden.

Serie: Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

In-vivo-Elektrophysiologische Messungen an Maus Ischiasnerven

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

Hochauflösende Strukturkernspintomographie des menschlichen Subcortex<I&gt; In-vivo-</I&gt; Und Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Hochauflösende Quantitative Immungold-Analyse von Membranrezeptoren auf der Netzhaut Ribbon Synapsen

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

Das Auslösen Zellstress und Tod unter Verwendung von herkömmlichen UV-Laser konfokale Mikroskopie

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...