This work was supported by the Alzheimer&#8217;s Association (NIRG-10-171721; to U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; to U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; to C.M.T.), and pilot study awards from the National Institute on Aging-funded Alzheimer&#8217;s Disease Research Center at Columbia University (AG008702; to J.B. and Y.Y.J.) that also supports the New York Brain Bank. We thank members of the Hengst laboratory for comments and discussions

Alle tierischen Verfahren wurden durch die IACUC der Columbia University und der geltenden Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt wurden befolgt. Hinweis: Bereiten Sie alle für die ISH Verfahren in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser verwendeten Puffer. Diese Empfehlung ist nicht unbedingt notwendig, nachdem ISH abgeschlossen ist, aber es wird vorgeschlagen, dass Puffer noch in autoklaviertem bidestilliertem Wasser hergestellt und / oder durch Filtern sterilisiert. 1. Nachweis der ATF4 mRNA lokalisiert Cholinerge Axone im Gehirn erwachsener Mäuse mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) durch Immunhistochemie Gefolgt <ol><li> Probenvorbereitung für die Para fixierten gefrorenen Hirnschnitten <ol><li> Für das folgende Beispiel, bereiten Scheiben von festen gefrorenen Gehirn der Maus. <ol><li> Kurz gesagt, zu opfern, 9 Monate alten Mäusen durch Anästhesie mit Ketamin (100 mg kg -1 Körpergewicht) und Xylazin (10 mg kg -1 Körper weigHT) von transkardialer Infusion von 4% Paraformaldehyd in PBS (pH 7,4) folgte. </li><li> Gehirne und post-fix in 4% Paraformaldehyd zu entfernen für 24 Stunden bei 4 o C </li><li> Nach der Fixierung, Waschen Proben dreimal in PBS und in 30% cryoprotect Saccharose in PBS (pH 7,4) für 24 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Betten Sie Gehirne in OCT Einfrieren Verbindung, seriell Schnitt bei 20 &amp; mgr; m auf einem Kryostaten und montieren auf Poly-D-Lysin behandelten Objektträgern. Halten Hirnschnitten bei -20 o C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Entfernen Parafesthirnschnitten aus dem Gefrierschrank und der Luft trocknen für 30 min bei RT. </li><li> Dreimal mit 1x PBS waschen. </li><li> In einer Abzugshaube, Re-fix Hirnschnitten 20 min mit 4% Paraformaldehyd bei RT. HINWEIS: ACHTUNG: 4% Paraformaldehyd ist giftig und muss behandelt und entsorgt werden entsprechend folgenden Sicherheitsprotokolle. </li><li> Dreimal mit 1x PBS waschen. </li><li> Entwässern Hirnschnitten. <ol><li> Vorbereitung 50%, 75% und 100%Ethanollösungen. </li><li> Einzutauchen Folien in 50% Ethanol für 5 Minuten bei RT. </li><li> Einzutauchen Folien in 75% Ethanol für 5 Minuten bei RT. </li><li> Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT. </li><li> Einzutauchen Folien in frischem 100% Ethanol für 5 Minuten bei RT. Hinweis: Alternativ können Folien in 100% Ethanol bei -20 ° C bis zu 1 Monat gelagert werden. </li></ol></li></ol></li><li> FISH-Test, gefolgt von Immunhistochemie unter Verwendung von Hitze-induzierte Antigen / RNA Demaskierung <ol><li> Vor dem Start bereiten alle erforderlichen Material: <ol><li> Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und legen Sie eine Schale mit destilliertem Wasser in den Ofen, um eine feuchte Umgebung schaffen. </li><li> Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen. </li><li> Sonden (sowohl negative als auch Zielsonden) Entfernen von Kühlschrank und erwärmen diese im Hybridisierungsofen für 10 min. Lassen Sie die Proben abkühlen down bei RT. </li><li> Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-4 (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) bei RT. </li><li> Bereiten Antigen-Retrieval-Lösung: 10 mM Natriumcitrat (pH 6), 0,05% Tween 20 Hinweis: Lösung kann bei RT auf unbestimmte Zeit gespeichert und für zukünftige Färbung verwendet werden. </li><li> Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der Leuchtstoff Multiplex-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser. HINWEIS: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden. 50x Waschpuffer könnte auszufällen. Wenn ja, Wärme 50x Waschpuffer bei 40 ° C für 10 Minuten vor der Herstellung der Lösung, 1x. </li></ol></li><li> Folien aus 100% Ethanol und Luft trocknen entfernen 5 min bei RT. </li><li> Bereiten Sie eine Coplin-Gefäß mit 50 ml Antigen-Retrieval-Lösung. Tauchen Sie Folien in Antigen-Retrieval-Lösung und kochen Sie sie für 10 Minuten in einem Mikrowellenofen. HINWEIS: Alternativ Ort horizontal gleitet in einer 100 mmDurchmesser runde Glasschale, die 100 ml Retrieval-Lösung. <ol><li> Füllen Sie ein 1 L Becherglas mit destilliertem Wasser und legen Sie sie in der Mikrowelle. HINWEIS: Das Wasser wird &quot;Puffer&quot; die Hitze bei der Durchführung Entlarvung. </li><li> Objektträger in Antigen-Retrieval-Lösung in der Mikrowelle. Boil gleitet bei hoher Leistung für 5 Minuten. Unmittelbar nach Proben gestoppt Kochen, gleitet Wärme wieder bei hoher Leistung für zusätzliche 5 min. </li><li> Cool down Folien bei RT. HINWEIS: kritischer Schritt: siedendem Dauer und Verfahren ist vom Anwender festgelegt werden, abhängig von den Mikrowelleneigenschaften. Je schneller das Kochen beginnt desto höher die Chancen der Lösung Verdunstung. In diesem Fall empfiehlt es sich, dass die Proben für kürzere Zeiträume mehr als zweimal, um eine Gesamt Demaskierung von 10 min abgeschlossen gekocht. Im Gegenteil, wenn der Heizbetrieb mit mittlerer oder niedriger Leistung durchgeführt wird, Demaskierung kann einmal für 10 min durchgeführt werden. Allerdings, wenn Proben nicht kochen continuously für eine Gesamtmenge von etwa 10 min wird diese in Teil Demaskierung sowohl der Ziel-RNA und Protein führen zu detektieren. </li></ol></li><li> Wash gleitet dreimal mit 1x PBS. </li><li> In 2 - 3 Tropfen (~ 100 &amp; mgr; l) des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt. Hinweis: Das dapB Sondensatz richtet sich an ein bakterielles Gen und sollte keine Säugetier-RNA zu erkennen. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen der Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt. Hinweis: ein Sondensatz Targeting-Reste 20 - 1381 der Maus ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet. </li><li> Deckgläser mit Parafilm zu Sonde Verdunstung zu vermeiden, legen Sie sie in der befeuchteten Objektträger Box in der Hybridisierungsofen inkubieren sie bei 40 ° C für 2 Stunden. HINWEIS: Optional: zusätzliche Hirnschnitten mit einem Sondensatz Targeting Maus Polr2A hybridisiert und als positive Kontrollen verwendet werden. </li><li> Wash slides zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 1-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 2-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 3-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Fügen Sie 2-3 Tropfen Amplifikationsreagens AMP 4-FL zu jedem Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in dieDia-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und zweimal mit 1 × PBS. </li><li> Hinzuzufügen 100-200 ul (oder genügend Volumen, um vollständig zu bedecken Slices) einer Blockierlösung, die 3 mg / ml BSA, 100 mM Glycin und 0,25% Triton X-100 in PBS (pH 7,4) auf die Objektträger, bedecken sie mit Parafilm und Inkubation für 30 min bei RT. </li><li> In 100 bis 200 &amp; mgr; l Anti-ChAT-Antikörper in Blockierungslösung (1/100) auf die Objektträger verdünnt, decken Sie sie mit Parafilm und Inkubation für 2 Tage bei 4 o C Stellen Sie sicher, dass Hirnschnitten nicht austrocknen. Falls erforderlich, erneut bewerben anti-ChAT-Antikörperlösung zu Hirnschnitten von 24 Stunden nach der Inkubation. </li><li> Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT. </li><li> In 100 bis 200 &amp; mgr; l der geeigneten Alexa-konjugierten Sekundärantikörper (. ZB Alexa-594 Esel anti-Ziege für dieses spezielle Beispiel) auf die Objektträger, Deckel mit Parafilm und Incubaß für 1 h bei RT. </li><li> Wasch gleitet dreimal in 1x PBS für 5 min bei RT. </li><li> Wash gleitet einmal mit destilliertem Wasser. </li><li> Berg Träger mit DAPI haltigen Eindeckmedium. </li><li> Visualisieren Hirnschnitten unter dem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol> 2. Nachweis von ATF4 mRNA lokalisiert, um Axone in Human Brain Proben unter Verwendung chromogener in situ Hybridisierung (CISH) von Luxol Fast Blue und Kresylviolett Gegenfärbung Gefolgt <ol><li> Probenvorbereitung für die Formalin-fixierten, in Paraffin eingebettete menschliche Gehirnproben <ol><li> Bake Scheiben in einem Trockenofen bei 60 ° C für 1 Stunde. </li><li> Entparaffinieren Hirnschnitten in einem Abzug. HINWEIS: ACHTUNG: Reagenzien sind giftig und müssen behandelt werden und verworfen folgenden die entsprechenden Sicherheitsrichtlinien <ol><li> Tauchen Sie Folien in Xylol alternativen Clearingstelle, zweimal für 10 min. </li><li> Einzutauchen gleitet in 100% Ethanol zweimal für 1 min. </li><li> EINir-trockenen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ können Proben bei Raumtemperatur getrocknet werden, O / N, sondern muss innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. </li></ol></li></ol></li><li> Diaminobenzidin (DAB) -basierte chromogenen ISH Assay gefolgt von Luxol schnell blau und Kresylviolett Fleck mit wärmeinduzierten und Protease-induzierte RNA Demaskierung <ol><li> Vor Beginn der Vorbereitung benötigte Materialien: <ol><li> Erhitzen Sie das Hybridisierungsofen bis 40 o C und setzen Sie ein Fach destilliertes Wasser, das um eine feuchte Umgebung schaffen. </li><li> Nehmen Sie eine Dia-Box und stellen Sie Papierhandtücher in destilliertem Wasser eingeweicht den Schiebekasten innen zu befeuchten. Legen Sie das Dia-Box in der Hybridisierungsofen. </li><li> Bereiten 1x vorbehandeln 2 durch Verdünnen der 10x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in RNase-freiem oder DEPC-behandeltem Wasser. Wenn Vorbehandlung auf einer heißen Platte durchgeführt wird, werden 100 ml Vorbehandlung Lösung zu einem Durchmesser von 100 mm Glasschale, um die Kontaktfläche zwischen der Schüssel und der heißen Platte zu erhöhen (falls Vorbehandlungin der Mikrowelle durchgeführt wird, kann ein Coplin-Gefäß statt dessen verwendet werden, wie in 1.2.3 angegeben). Wärme Lösung auf 100 o C und halten Sie sie koch nicht länger als 30 Minuten vor dem Untertauchen Proben. </li><li> Wärme negativen und positiven Proben 10 min bei 40 ° C und Abkühlen auf RT. </li><li> Äquilibrieren Amplifikationsreagenzien AMP 1-6 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) bei RT. </li><li> Bereiten 1x Waschpuffer Verdünnen der 50x-Stammlösung (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) in destilliertem Wasser. Hinweis: 1x Waschpuffer kann bei RT für 1 Monat gelagert werden und für zukünftige Färbung verwendet werden. </li></ol></li><li> In ~ 4 Tropfen (~ 120 &amp; mgr; l) von 1 vorbehandeln zu jeder Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser waschen. </li><li> Führen wärmeinduzierten Demaskierung: <ol><li> Objektträger, um heiße vorbehandeln 2 (in der CISH-Reagenz-Kit enthalten) Lösung und kochen für 15 Minuten. Hinweis: Boiling können auf einer heißen Platte Gewährleistung durchgeführt werdenkontinuierliche Kochen oder in der Mikrowelle folgenden kritischen Schritte in 1.2.3 angegeben). </li></ol></li><li> Dias zu destilliertem Wasser sofort übertragen und waschen 3 bis 5 mal. </li><li> Wasch gleitet 3 bis 5 mal mit frischem 100% Ethanol. </li><li> Luft trocknen Scheiben 5 min bei RT. Hinweis: Alternativ Scheiben getrocknet werden O / N. </li><li> Führen Sie Protease-induzierte Demaskierung: <ol><li> 4 Tropfen vorbehandeln 3 (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), Deckel mit Parafilm und Inkubation 30 min bei 40 o C im Hybridisierungsofen. </li></ol></li><li> Wash gleitet 3 bis 5 mal in frischem destilliertem Wasser. </li><li> 4 Tropfen des dapB-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet werden, um Hintergrundfärbung zu bewerten gesetzt. </li><li> 4 Tropfen des Targeting-Sonde auf jene Hirnschnitten verwendet, um die RNA von Interesse erkennen gesetzt. Hinweis: eine Sondensatz Targeting-Reste 15 - 1256 des menschlichen ATF4 mRNA wird in diesem Beispiel verwendet. OPTIONAL: zusätzliche Hirnschnitten können hyb seinmit einer Sonde, Satz gegen Menschen PPIB ridized und als positive Kontrollen verwendet. </li><li> Die Objektträger in der Folie Box und Inkubation für 2 Stunden. bei 40 o C im Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 1 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 2 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 3 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 30 min in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x warH-Puffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 4 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm, legen Sie sie in der Diashow-Box und Inkubation bei 40 ° C für 15 Minuten in der Hybridisierungsofen. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 5 Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 30 min bei RT. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> 4 Tropfen AMP 6-Reagenz auf jede Hirnschnitt, decken Folien mit Parafilm und Inkubation 15 min bei RT. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT. </li><li> Mix gleichen Volumen BROWN BROWN-1 und-2-Reagenzien (in der CISH-Reagenz-Kit im Lieferumfang enthalten), fügen ~ 120 &amp; mgr; l-Lösung in jede Hirnschnitt, Deckel mit Parafilm und Inkubation 10 min bei RT. </li><li> Wash gleitet zweimal mit 1x Waschpuffer für 2 min bei RT und einmal in destilliertem Wasser spülen. HINWEIS: kritische Schritte: die folgenden Schritte sind entscheidend für dieeine optimale axonalen Gegenfärbung zu erhalten, ohne Maskierung der Anwesenheit von RNA-Granulat. </li><li> Vor der Durchführung Gegenfärbung das Vorhandensein von mRNA von Interesse unter einem Hellfeldmikroskop überprüfen. Bestimmung von Referenzflächen in den Gehirnproben, in denen das Vorhandensein von puncta gesamten Kontrastfärbungsverfahren zu überwachen. </li><li> Vorheizen Luxol schnelle Blau-Lösung bei 60 o C. </li><li> Die Objektträger in Luxol schnell blau und Inkubation 30 min bei 60 o C. </li><li> Spülen Sie mehrmals in destilliertem Wasser. </li><li> Dip Slides mehrfach in 0,05% Lithiumcarbonat-Lösung, um die Differenzierung zu starten. </li><li> Dip Slides zweimal in frischem 75% Ethanol. </li><li> Spülen in destilliertem Wasser. </li><li> Überprüfen Hirnschnitten unter einem Hellfeldmikroskop. Beachten Sie, dass grauer und weißer Substanz beginnen sollte, zu unterscheiden und RNA-Granulat noch als dunkelblau / schwarz puncta sichtbar sein. Überprüfen Sie, dass Axone beginnen, wie hellblau Fasern erscheinen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.28 bis 2.2.32. Perform Inkubationen mit Luxol Fast Blue-Lösung in 10 bis 20 min Schritten sorgfältige Überwachung der Gegenfärbung und die Anwesenheit von RNA Granulate. Hinweis: In der Regel wird eine optimale Gegenfärbung in 60 erworben - 90 min (Gesamt Inkubationszeit), aber die Zeit kann verkürzt werden, wenn der Verdacht besteht, dass RNA-Granulat kann durch die Luxol schnell Bläue (siehe Abbildung 2 für Beispiele) maskiert werden kann. </li><li> Folien Kresylviolett Lösung inkubieren für 10 min bei RT. </li><li> Spülen Sie gleitet in destilliertem Wasser. </li><li> Dip Schlitten 5 bis 10 mal in 70% Ethanol. </li><li> Entwässern Hirnschnitten bis 3 schnelle Änderungen von 100% Ethanol. </li><li> In einer Abzugshaube, klar Hirnschnitten durch Inkubation zweimal in Xylol alternative Clearingstelle für 2 min und ein drittes Mal für 5 Minuten bei RT. </li><li> Berg Hirnschnitten in Xylol-basierte permanentes Fixiermittel. </li><li> Analysieren Sie die Proben unter einem Hellfeldmikroskop. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+localization+and+local+protein+synthesis+in+nervous+system+assembly,+maintenance+and+repair.">Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).</li><li>Campbell, D. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotropic+responses+of+retinal+growth+cones+mediated+by+rapid+local+protein+synthesis+and+degradation.">Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation.</a> Neuron. 32, 1013-1026 (2001).</li><li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+RhoA+regulates+growth+cone+collapse.">Local translation of RhoA regulates growth cone collapse.</a> Nature. 436, 1020-1024 (2005).</li><li>Piper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+underlying+Slit2-induced+collapse+of+Xenopus+retinal+growth+cones.">Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones.</a> Neuron. 49, 215-228 (2006).</li><li>Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+&#946;-actin+mRNA+localization+and+translation+in+Ca2+-dependent+growth+cone+guidance.">An essential role for &#946;-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance.</a> Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).</li><li>Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+elongation+triggered+by+stimulus-induced+local+translation+of+a+polarity+complex+protein.">Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).</li><li>Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+TC10+is+required+for+membrane+expansion+during+axon+outgrowth.">Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth.</a> Nat. Commun. 5, 3506 (2014).</li><li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+Is+an+RNA-Binding+Protein,+and+Its+Interactome+Provides+a+Link+to+Neural+Development+and+Microtubule+Assembly.">APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly.</a> Cell. 158, 368-382 (2014).</li><li>Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110, 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141, 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153, 1252-1265 (2013).</li><li>Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+and+retrograde+trafficking+of+CREB+promotes+neuronal+survival.">Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival.</a> Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).</li><li>Ji, S. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-axonal+translation+of+SMAD1/5/8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification.">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li><li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+poly(A)+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons.">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li><li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture.">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li><li>Hengst, U., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+translational+regulation+of+mRNA+in+developing+axons.">Function and translational regulation of mRNA in developing axons.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).</li><li>Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+roles+of+local+translation+from+the+axonal+transcriptome.">Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome.</a> Open Biology. 2, 120079 (2012).</li><li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonally+synthesized+ATF4+transmits+a+neurodegenerative+signal+across+brain+regions.">Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions.</a> Cell. 158, 1159-1172 (2014).</li><li>Gumy, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization.">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance.">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li><li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons.">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li><li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons.">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li><li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse.">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li><li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique.">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope.">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histotechnology. , (1987).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55 (2014).</li><li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation.">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung eines hochauflösenden ISH Technologie bei der Erkennung von axonally lokalisiert ATF4 mRNA. Diese und frühere veröffentlichte Studien zeigen, dass diese Technik mit Antikörper-basierte Proteinnachweis in Geweben oder sogar ganzen Embryonen 33 kompatibel. Wichtiger ist, es wurde kürzlich zur Detektion von mRNA im Arc Dendriten der hippocampalen Neuronen 34 eingesetzt. Es kann auch mit histologischen Farbstoffe zur Gewebefärbung...

Axonalen mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung ermöglichen Axone auf extrazelluläre Reize in einem zeitlich und räumlich akuten Weise 1 reagieren. Intra-axonale Proteinsynthese wird am besten im Zusammenhang mit der Entwicklung des Nervensystems, wo sie eine entscheidende Rolle bei Wachstumskegel Verhalten 2-8 spielt verstanden Axon Pathfinding 9-11 und retrograde Signalisierungs 12,13. Aber weit weniger ist über die funktionelle Bedeutung der axonalen Proteinsynthese in post-Entwicklungs Neuronen bekannt sind, wenn axonalen mRNA und Ribosom Niveaus stark verringert 14,15. Mature Wirbel Axone haben lange geglaubt, translational inaktiv 16 zu sein. Die jüngsten Studien zeigen, dass lokale Übersetzung wird in reifen Axone unter pathologischen Bedingungen reaktiviert. Zum Beispiel wird eine Untergruppe von mRNAs zu regenerierenden Axonen nach einer Nervenverletzung und intra axonalen Proteinsynthese ist für die korrekte Regeneration dieser Axone 17 erforderlich rekrutiert. Darüber hinaus unsere Gruppe has gezeigt, dass bestimmte mRNAs sind Axone rekrutiert, nachdem lokale Engagement in der Alzheimer-Krankheit Aß-Peptid 1-42, und lokale Übersetzung des Transkriptionsfaktors ATF4 ist verpflichtet, die neurodegenerative Effekte von Aß 1-42 von Axonen zu der neuronalen Soma 18 propagieren. Schließlich Hochdurchsatz-Analysen haben ergeben, dass reife Axone haben ein komplexer und dynamischer als erwartet Transkriptom 18-21, vor allem unter pathologischen Bedingungen. Im Lichte dieser Untersuchungen wurde ein hochempfindliche und spezifische Methode zum Nachweis axonally lokalisierte mRNAs im adulten Nervensystem erforderlich ist. Ein Großteil der Arbeit an mRNA Rekrutierung und lokale Übersetzung in reifen Axone wurde an kultivierten Neuronen durchgeführt. Dies gilt vor allem für die Transkriptom-Analysen, da spezialisierte Kultivierungsverfahren bestehen, dass die Isolierung der Axone von der somato-dendritischen Raum 18-20 ermöglichen. Obwohl solche Studien haben wertvolle Ins gegebenight in die Rolle des lokalen Übersetzung in reifen Axone, die Frage, ob kultivierten Neuronen glaubwürdig die Situation in vivo oder mRNA Rekrutierung ist eine adaptive Reaktion von Axonen zu Kultivierungsbedingungen ist noch offen. Nur wenige Studien haben Hinweise auf mRNA Anwerbung für den Axonen in vivo fällig gestellt. Zum Beispiel hat das Transkript der olfaktorischen Markerprotein in Axonen bei erwachsenen sensorischen Neuronen 22 erfasst wurde. Ein Transgen, das die 3&#39;-UTR von β-Actin mRNA Axonen in den peripheren und zentralen Nervensystems Neuronen in Mäusen transportiert und vor Ort nach dem Entwicklungsperioden 23 übersetzt. Lamin B2 mRNA an retinalen Axonen lokalisiert in Xenopues laevis Kaulquappen und seine Erschöpfung wirkt Axon Wartung nach axonalen Entwicklung 21. Störung des axonalen Transport der mRNA-Codierung für Cytochrom C Oxidase IV verändert Mausverhalten 24. Schließlich wird ATF4 mRNA in ein erwachsener gefundenXON-Fluß von Mäusen und menschlichen Gehirnen im Rahmen von Aß 1-42 induzierte Neurodegeneration 18. Hochdurchsatz-Transkriptom Analysen haben sich als nützlich zu sein, um mRNA-Profilen in isolierten Axone in vitro zu identifizieren, sondern haben ihre Grenzen für die in-vivo-Studien, da im ganzen Gewebe Axone sind nie isoliert gefunden, aber mit neuronalen Zellkörpern, Gliazellen und anderen Zelltypen vermischt. Folglich müssen derartige Analysen mit bildgebenden Verfahren, die die subzelluläre Lokalisation von mRNAs bestätigen kombiniert werden. RNA in situ-Hybridisierung (RNA-ISH) erlaubt die Detektion und Darstellung von spezifischen RNA-Sequenzen, die in Zellen und Geweben. Jedoch waren ursprünglichen RNA ISH Assays nur für die Identifizierung von zahlreicheren RNAs 25, was selten der Fall axonally lokalisierten mRNAs geeignet. In den letzten Jahrzehnten zunehmenden Bemühungen in die Entwicklung neuer Technologien, die den Nachweis der mRNAs ermöglichen an der Einzelmolekülebene gesetzt <sup&gt; 25,26. Zum Beispiel haben Singer und Kollegen ISH Sonden entwickelt, um mRNAs in Einzelzellen zu erfassen, die aus in 5 nicht überlappenden Fluoreszenz-markierten 50-mers (Details siehe 27). Der Hauptunterschied zwischen den oben genannten Techniken und das hier beschrieben wird, ist, daß die später verwendet 20 Doppel Z-Struktur (nicht linear) Sonden, die typischerweise Ziel ~ 1 kb Region der RNA von Interesse sicherzustellen Spezifität und geringem Hintergrundniveaus. Sonden werden dann mit Vorverstärker und Verstärker-Sequenzen, die schließlich fluoreszenzmarkierte oder mit Enzymen, die chromogene Reaktionen ermöglichen konjugiert hybridisiert. Diese Amplifikationsschritte Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu anderen Technologien ISH 28. Hier beschreiben wir zwei Protokolle mit RNAscope kombiniert entweder mit Fluoreszenz Immunzytochemie oder histologische Farbstoffe ermöglicht axonalen Gegenfärbung. Beide Protokolle sind geeignet zur axonalen Lokalisierung ATF4 mRNA in der Erwachsenen mo visualisierenverwenden und das menschliche Gehirn.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 20-1381 of the mouse Atf4 mRNA (NM_009716)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>custom probe targeting residues 15-1256 of the human ATF4 mRNA (NM_001675.2)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>-</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative control probe-DapB</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310043</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-mouse Polr2A (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">312471</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>positive control probe-human PPIB (optional)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">313901</td>
			<td>probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit (for fluorescence detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">320850</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - BROWN (for chromogenic detection)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td align="right">310035</td>
			<td>In situ hybridization kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-ChAT antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB144P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>KTLFB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clearify clearing agent (xylene substitute)</td>
			<td>American MasterTech</td>
			<td>CACLEGAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold mounting&#160; medium with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of axonally localized mrnas in brain sections using high-resolution in situ hybridization

mRNAs werden häufig Wirbel Axonen lokalisiert und ihre lokalen Übersetzung für Axon Wegfindung oder Verzweigung während der Entwicklung und für die Wartung, Reparatur oder Neurodegeneration in postdevelopmental Zeiten erforderlich. Hochdurchsatz-Analysen haben kürzlich ergeben, dass Axone haben ein dynamischer und komplexer Transkriptom als bisher erwartet. Diese Analyse jedoch wurde meist in kultivierten Neuronen, wo Axone aus den somato-dendritischen Fächern isoliert werden getan. Es ist praktisch unmöglich, eine solche Isolation in ganze Gewebe in vivo zu erreichen. So um die Rekrutierung von mRNAs und ihre funktionelle Relevanz in einem ganzen Tier überprüfen, Transkriptom Analysen sollten im Idealfall mit Techniken, die die Visualisierung von mRNAs in situ ermöglichen kombiniert werden. In jüngster Zeit neuartige ISH Technologien, die RNAs in einer Einzelmolekülebene zu erfassen, wurden entwickelt. Dies ist besonders wichtig bei der Analyse der subzellulären Lokalisierung von mRNADa lokalisierten RNAs werden in der Regel in geringen Mengen gefunden. Hier beschreiben wir zwei Protokolle zur Detektion axonally lokalisierte mRNAs unter Verwendung eines neuen hochempfindlichen RNA ISH Technologie. Wir haben RNAscope ISH mit axonalen Gegenfärbung in Kombination mit Fluoreszenz Immunhistochemie oder histologische Farbstoffe, um die Rekrutierung von ATF4 mRNA um Axone in vivo in der reifen Maus und menschliche Gehirne zu überprüfen.

Eine kurze Zusammenfassung der oben beschriebenen Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Optimale Erkennung von ATF4 mRNA Granulat in cholinergischen Axonen mit wärmeinduzierten Demaskierung Bei der Beurteilung axonale Lokalisation mRNAs ist es kritisch, in der Lage, die Axone zu identifizieren und um niedrige reichlich RNAs zu visualisieren. Die hier beschriebene RNA ISH Technologie ermöglicht die Erkennung von RNAs in einer Einzel...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization at JoVE.com

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

11.7K Aufrufe.  Columbia University. RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Serie: Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh frozen brain sections. Our group has successfully used this approach to study gene co-regulation. More specifically, we have used this dFISH method to explore the anatomical organization, neurochemical properties, and the impact of sensory experience in central sensory circuits, at single cell resolution. This protocol has been validated in brain tissue from mice, rats and songbirds but is expected to be easily adaptable to other vertebrate species, as well as to an array of non-neural tissues. In this film we provide a detailed demonstration of the main steps of this procedure.

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

This protocol involves a non-radioactive in-situ hybridization procedure that enables the simultaneous identification of two transcript species, at a single cell resolution, in thin sections of the vertebrate brain.

Doppel-Fluoreszenz- In situ Hybridisierung in Fresh Hirnschnitten

Here we describe a modified version of a double fluorescence in situ hybridization (dFISH) method optimized for detecting two mRNAs of interest in fresh ...

Forschung

Neurowissenschaften

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal. Such analysis of two or more genes needs to be complemented with in situ hybridization of other genes, or immunohistochemistry of their proteins, both in whole mounted developing organs or sections for detailed resolution of the cellular and tissue expression alterations. Combining multiple gene alterations requires the use of cre or flipase to conditionally delete genes and avoid embryonic lethality. Required breeding schemes dramatically enhance effort and cost proportional to the number of genes mutated, with an outcome of very few animals with the full repertoire of genetic modifications desired. Amortizing the vast amount of effort and time to obtain these few precious specimens that are carrying multiple mutations necessitates tissue optimization. Moreover, investigating a single animal with multiple techniques makes it easier to correlate gene deletion defects with expression profiles. We have developed a technique to obtain a more thorough analysis of a given animal; with the ability to analyze several different histologically recognizable structures as well as gene and protein expression all from the same specimen in both whole mounted organs and sections. Although mice have been utilized to demonstrate the effectiveness of this technique it can be applied to a wide array of animals. To do this we combine lipophilic dye tracing, whole mount in situ hybridization, immunohistochemistry, and histology to extract the maximal possible amount of data.

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

A combination of different techniques to maximize data collection from mouse tissue is presented.

Die Kombination lipophiler Farbstoff, In situ Hybridisierung, Immunhistochemie und Histologie

Going beyond single gene function to cut deeper into gene regulatory networks requires multiple mutations combined in a single animal.  Such analysis of ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Nachweis der Transkripte von Genom und einem Persistent DNA-Virus in einem neuronalen Gewebe Fluorescent In situ Hybridisierung Kombination mit Immunfärbung

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Komplette Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protokoll für spätere Wholemount<em&gt; In-situ</em&gt; Hybridisierung in Larven Seeneunauge

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

Hohe Auflösung<em&gt; In-vivo-</em&gt; Manuelle Segmentierung Protokoll für Menschen Hippocampus Teilfelder Verwenden von 3T Kernspintomographie

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

Schnelle<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung unter Verwendung von Oligonukleotidsonden auf Paraformaldehyd-Präfix Gehirn von Ratten mit Serotonin-Syndrom

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in regulating neuronal growth and development. However, the mechanisms underlying Drd1&#945; receptor abnormalities mediating behavioral responses and modulating working memory function are still unclear. Using a novel RNA in situ hybridization assay, the current study identified dopamine Drd1&#945; receptor and tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression from DA-related circuitry in the nucleus accumbens (NAc) area and substantia nigra region (SNR), respectively. Drd1&#945; expression in the NAc shows a &#34;discrete dot&#34; staining pattern. Clear sex differences in Drd1&#945; expression were observed. In contrast, TH shows a &#34;clustered&#34; staining pattern. Regarding TH expression, female rats displayed a higher signal expression per cell relative to male animals. The methods presented here provide a novel in situ hybridization technique for investigating changes in dopamine system dysfunction during the progression of central nervous system diseases.

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of dopamine D1-alpha receptor in the nucleus accumbens is critical for clarifying D1 receptor dysfunction during a central nervous system disease. We performed a novel RNA in situ hybridization assay to visualize single RNA molecules in a specific brain area.

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Hochauflösende 3D-Bildgebung der Tollwut-Virusinfektion im lösungsmittelfreien Hirngewebe

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Methods Article

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender