Die Autoren bedanken sich bei Joe Owen in der biomedizinischen Instrumenten-und Machine Shop danken für seinen unermüdlichen Einsatz bei der Bearbeitung und Montage der Flusskammer Teile und Matt Maudsley von Leica Microsystems zur Unterstützung in Techniken zur Bild-Zellen durch Strömungskammern. Wir danken Kevin Collins von der Duke Perfusion Services und Dr. Steve Wallace in der Abteilung für Biomedizinische Technik für hilfreiche Anregungen fließen Schaltungsdesign. Wir möchten auch die National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program zur Unterstützung von Alexandra Jantzen und der NIH für die Unterstützung durch Grant &quot;Autologe EPC-Futter auf die Biokompatibilität von Herz-Kreislauf verbessern assist devices&quot; RC1HL099863-01 danken.

<ol>
	<li>Bhat, V. D., Truskey, G. A., Reichert, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+avidin-biotin+as+a+heterogeneous+ligand+system+for+enhanced+endothelial+cell+adhesion.">Fibronectin and avidin-biotin as a heterogeneous ligand system for enhanced endothelial cell adhesion.</a> J. Biomed. Mater. Res. 41, 377-385 (1998).</li><li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cord+blood+stem+and+progenitor+cells.">Cord blood stem and progenitor cells.</a> Methods Enzymol. 419, 439-473 (2006).</li><li>Achneck, H. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+adhesion+of+umbilical+cord+blood+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+shear+stress.">Dynamic adhesion of umbilical cord blood endothelial progenitor cells under laminar shear stress.</a> Biophys. J. 99, 3545-3554 (2010).</li><li>Baker, G. R., Sullam, P. M., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+fluorescent+method+to+internally+label+platelets+suitable+for+physiological+measurements.">A simple, fluorescent method to internally label platelets suitable for physiological measurements.</a> Am. J. Hematol. 56, 17-25 (1997).</li></ol>

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Unsere Flow-Schaltung und Flusskammer es uns ermöglichen, adhärente Zellen, z. B. EPC, definiert Flüssigkeit Schubspannungen Thema. Da die Kammer oben und unten sind transparent, Zelladhäsion und Morphologie kann entweder in Echtzeit ausgewertet werden, durch die Kammer selbst, oder nach einer Flow Experiment und Demontage der Flusskammer. An diesem Punkt können die Zellen unter sterilen Bedingungen geerntet und entweder neu verchromt oder verwendet werden, um ihre DNA oder RNA, etc., zur weiteren Analyse zu sammeln. Um dies zu erreichen laminare Strömung, muss der Aufbau der Kammer sein, dass mehrere Bedingungen erfüllt sind. Erstens muss die Strömung laminar, die durch die Berechnung ihrer Reynolds-Zahl (Re), die das Verhältnis der Trägheitskräfte zu viskosen Kräften überprüft werden kann. (Wenn viskosen Kräfte dominieren, ist Re klein und die Strömung laminar oder &quot;voll entwickelt&quot; - in der Regel für Re &lt;2300.Wenn Trägheitskräfte überwiegen, die Strömung mehr und mehr zufällig wird, bis es turbulent wird, wie es der Fall für Re&gt; 4000). Wir berechnen Re nach Gleichung 3 8, <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq3.jpg" /> Wo ρ die Dichte der Flüssigkeit ist, Q die Flussrate, μ die Viskosität ist, werden w und h die Breite und die Höhe der Kammer, bzw., und D h ist der hydraulische Durchmesser, definiert nach Gleichung 4 8, <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq4.jpg" /> Die Reynolds-Zahl von unseren drei Strömungskammern, mit Höhen zwischen 166 bis 267 mu m, Reichweite von 13,9 bis 34,6 bei Flussraten cerechnet zu einer Schubspannung von 15 dyn / cm 2 zu erhalten. Bei Flussraten für eine Schubspannung von 100 dyn / cm 2 berechnet, lagen die Reynolds-Zahl der Kammern von 90,4 bis 234. Alle diese Reynolds-Zahlen sind viel niedriger als 2300 und das Kriterium für die laminare Strömung. Zweitens, für die Geschwindigkeit ein und Schubspannung werden unabhängig von der Entfernung entlang der Strömungskanal (dh voll entwickelten), der Abstand von der Fluideinlass zu rutschen muss länger sein als der Eingang Länge, L e. Dies kann durch die Berechnung der Eingang Länge zufrieden sein, nach Gleichung 5 9. <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/3349/3349eq5.jpg" /> Für die oben aufgeführten Werte liegt der Eingang Länge von 0,01 bis 0,25 cm. Drittens, um sicherzustellen, dass die Geschwindigkeit und Schubspannung in der seitlichen Richtung nicht ändernwesentlich von dem Wert für eindimensionale Gerinne (Δ Ph / 2L), muss das Verhältnis h / w sehr viel weniger als 1 ist. Für den durchschnittlichen Wandschubspannung unter zweidimensionalen Strömungsverhältnisse zu 95% der Wandschubspannung unter eindimensionale fließen kann, muss h / w gleich 0,10, und für die Wandschubspannung unter zweidimensionalen Strömungsverhältnisse zu sein 97,5% der Wandschubspannung unter eindimensionale fließen kann, muss h / w gleich 0,05. Mit den Dimensionen unserer konzipiert Flusskammer 1,7 cm in der Breite und 166 bis 267 mu m Höhe, sind diese Kriterien erfüllt. Der Druck wird nur unterschiedlich in der Fließrichtung, wenn es keine seitlichen Druckgradienten am Eingang sind. Dies kann unter Verwendung von Farbstoffen oder Partikel in den Strömungsweg werden. Weitere, für die stetigen Versuche, ist ein Pulsationsdämpfer in den Fluss Schaltung eingefügt. Die Pulsationsdämpfer nimmt den größten Teil der pulsgibt Auskunft über die durch die Rollenpumpe in der Schaltung, und ermöglicht es uns, etwa die Übernahme der stetigen Fluss. Zu beachten ist, sollte der Pulsationsdämpfer eingesetzt werden mit der Pumpe und Schlauch in der Schaltung verwendet, so dass es effektiv beseitigen können Pulsationen in den Förderstrom für die spezifischen Frequenzen der Rollenpumpe. In unserer Demonstration der Masterflex L / S Pulsationsdämpfer erreicht laminare Strömung, wenn auf der Druckleitung mit einem Masterflex L / S-Serie Pumpe (0 bis 600 RPMs) und I / P 26 Schläuche. Für pulsatilen Fluss kann eine programmierbare Pumpe verwendet, um verschiedene Wellenformen erzeugen. Für pulsatilen Fluss kann eine programmierbare Pumpe verwendet, um verschiedene Wellenformen erzeugen. Darüber hinaus ist die Schaltung so, dass Proben von Perfusat konzipiert leicht zu unterschiedlichen Zeitpunkten, ohne die Gefahr einer Verunreinigung der Zellen oder Flow Medium gesammelt werden. In unserem Beispiel ist die Konzentration von NO 2 - wurde durch Chemilumineszenz mit gemessenenein Ionics / Sievers Stickstoffoxid Analyzer (NOA 280, Sievers Instruments, Boulder, CO), wie zuvor 10 beschrieben. Das Reduktionsmittel für Nitrit-Analyse verwendet wurde Kaliumiodid in Essigsäure (14,5 M Essigsäure und 0,05 M KI), die das Reduktionspotenzial zu Nitrit zu NO konvertiert hat, aber nicht ausreicht, um einem höheren Stickstoffoxide wie Nitrat zu reduzieren und somit relativ spezifisch für Nitrit. Der Gesamtbetrag Nitrit produziert wurde als das Produkt der Konzentration produziert und das Gesamtvolumen der Schaltung berechnet während der Einstellung für die Lautstärke verloren während der Einnahme von Proben 6. Die folgenden Schritte sind entscheidend für die erfolgreiche Durchführung von Flow-Experimente: <ol class="lroman"><li> Es ist wünschenswert, um eine Blasenbildung während des Durchflusses Set-up zu vermeiden, da Blasen das Potenzial zum Abreißen Zellen von ihrer Oberfläche besitzen. Dies kann durch die Betreuung bei der Platzierung im oberen Teil der Flusskammer auf das Unterteil, das am besten vermieden werdenerreicht, indem sie beide parallel zueinander und Senken der Spitze auf den Boden in einer Bewegung ohne Anpassungen. Dabei kleinen Luftbläschen, die vorhanden sein und / oder variabel in den Strömungskanal kann, wird in den Blasenfallen an jedem Ende des Aluminium-Gehäuse abgeleitet werden. </li><li> Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass der Abfluss-Schlauch in den Behälter nach unten reicht, um das Reservoir der Unterseite. Andernfalls kann Luft in den Schlauch, die aus dem Reservoir in die Kammer führt, wenn das Perfusat sinkt leicht unter dem Schlauchende angesaugt werden. </li><li> Die Forscher sollten mit der Leitung von der Pumpe fließen, so dass die Pumpe nicht versehentlich in die entgegengesetzte Richtung mit Beginn der Strömung, die würden in Luft in den Kreislauf und gesaugt Ergebnis führen. </li><li> Zur Vermeidung der Bildung von Schaum (wegen denaturierter Proteine ​​im Serum enthalten sind), raten wir Absenken der Rohre, die von der Kammer zum Reservoir führt zu etwa einem Zentimeter über dem perfusate Ebene innerhalb des Reservoirs. Allerdings halten sie über den Fluss mittlerer Ebene können Sie fließen in das Reservoir während des Experiments zu überprüfen. </li><li> Beim Einschrauben der Kammer Teile zusammen, ist es wichtig, fest zu ergreifen das Gehäuse mit einer Hand während des Betriebs der elektrischen Schraubenzieher mit der anderen Hand. Beachten Sie, dass die Bewegung der elektrischen Schraubendreher in Drehmoment, welches das Potenzial zu &quot;werfen die Kammer rund &#39;, wenn die Schraube angezogen hat, wird übersetzt werden. </li><li> Zur Vermeidung von Druckwellen die Bildung von in der Schaltung und heben Zellen aus ihrer Oberfläche, sicherzustellen, dass alle Hähne offen vor Beginn der Strömung sind. </li><li> Besonders für längerfristige Flow-Studien (&gt; 48 Stunden) empfehlen wir die Verwendung der härter und widerstandsfähiger Schlauch in den Pumpenkopf eingesetzt werden, um zu verhindern Bruch der Rohre. </li><li> Es ist möglich, dass der Schlauch &quot;wandert&quot; im Innern der Pumpe Kopf durch schlecht eingestellten Pumpenkopf Zähne. Deshalb empfehlen wir, mit Aufmerksamkeit, wie die WanneIng. ist in den Pumpenkopf gesichert und Kennzeichnung jedes Ende des Schlauches mit einem Filzstift, so dass Sie leicht feststellen, ob der Schlauch &quot;eingezogen&quot; oder verdrängt während des Experiments. </li><li> Immer sorgfältig prüfen jeden einzelnen Anschluss der Schaltung und Kammer vor Beginn der Perfusion, um Austreten von Perfusat während eines Experiments durch eine fehlerhafte Verbindung zu verhindern. Dies ist besonders wichtig für die Zu-und Abfluss-Anschlüsse der Pulsationsdämpfer! </li><li> Denken Sie daran, Belichtung Limit, wenn Sie Fluoreszenzmarkierungen verwenden. </li></ol> Eine mögliche Einschränkung unserer Flusskammer ist, dass die Höhe von der Höhe des Kanals maschinell in die Aluminium befestigt ist. Dies hat jedoch den Vorteil, nicht zu überprüfen, und stellen Sie die Höhe des Kanals vor jedem Experiment und vereinfacht somit die Schubspannung Berechnungen lediglich die Anpassung der Pumpenleistung auf den gewünschten Wert. Abhängig von Ihrer Forschungsziele, kann es wünschenswert sein,Erhöhung der Schubspannung ohne Erhöhung Pumpendrehzahl. In diesem Fall werden wir die Erhöhung der Perfusat die Viskosität zu empfehlen, indem z. B. Dextran, um das Medium 11. Eine mögliche Einschränkung der Strömung Schaltung ist die große Menge des verwendeten Mediums, was problematisch sein kann, wenn versucht wird, um sehr kleine Konzentrationen von Zelle Metaboliten zu quantifizieren. Obwohl hier nicht gezeigt, ist es möglich, eine deutliche Senkung der Schaltung Volumen durch einen kleineren Behälter und Pulsationsdämpfer und Abnahme Schlauch Länge und Durchmesser. Darüber hinaus gibt es mehrere andere kommerziell erhältliche Systeme, die verwendet werden, um Flüssigkeit Schubspannung an Zellen in Kultur gelten kann. Mikrofluidik-basierten Systemen, wie zB die BIOFLUX System von Fluxion, ermöglichen die gleichzeitige Analyse von Zellen in verschiedenen mikrofluidischen Strömungskanäle mit Lösung in Well-Platten, die als Input-und Output Reservoirs für diese Kanäle 12,13,14 geladen. Doch diese und andere Mikro-Fluidik-Systeme sind nicht kompatibel mit Standard-Mikroskop-Objektträger und nicht für die Wiederherstellung einer ausreichend großen Anzahl von Zellen für weitere Experimente, wie z. B. RT-PCR oder Western Blot zu ermöglichen. Außerdem sind sie weniger benutzerfreundlich, kostengünstig ein Minimum von $ 40.000 und kann insgesamt mehr als $ 100.000 zu erreichen, abhängig von Zusatzgeräten. Zwei macrofluidic Systeme aus der Flexcell International Corporation, die Flexcell Streamer und die FlexFlow Systeme wurden erfolgreich eingesetzt, um Endothelzellen 15,16,17, menschliche Zellen Ringraum 18 und Fibroblasten 19 unter Strömung Bedingungen zu studieren. Ein drittes System, erhältlich durch GlycoTech, wurde verwendet, um Tumorzelladhäsion 20 und Leukozytenadhäsion 21 bis endothelialen Monolayer zu studieren. Die Streamer-System ermöglicht mehrere Seiten unter den gleichen Schubspannung Bedingungen auf einmal ausgeführt werden, aber es fehlt ein Sichtfenster und - im Gegensatz zu unserenDesign - nicht für Echtzeit-Visualisierung von Zellen unter fließen zu lassen. Die FlexFlow System hat ein Sichtfenster, sondern erfordert eine aufrechte Mikroskop, das nicht dem Standard-Mikroskop in den meisten Labors verwendet werden könnte. Weiterhin erfordert die FlexFlow System einer Zelle beschichtete Deckglas invertiert, wenn in die Strömungskammer platziert werden. Dies schließt Visualisierung von fluoreszierenden Zellen auf einer undurchsichtigen Oberfläche, wie Titan-beschichteten Gläsern, die wir zeigen in unserer Studie. Schließlich müssen die spezialisierten Deckgläser speziell für den FlexFlow System, das in der multi-Tausend-Dollar-Preisklasse ist, ähnlich wie die Flexcell Streamer-System erworben werden. GlycoTech bietet runden und rechteckigen Platte-Platte Strömungskammern, die deutlich weniger teuer, aber gefertigt aus Acryl, die nicht bequem Stammzellen wie unsere Kammer autoklaviert werden. Zu beachten ist, an andere Strömungskammern, die beschrieben worden sind autoklavierbarerscheinen nicht praktikabel, weil sie spezielle mikroskopische Linsen 22,23 erfordern. Die GlycoTech System nutzt Silizium Gummidichtungen zwischen oberen und unteren Platten dazwischen, die in der Dicke bei wiederholter Anwendung zu ändern und wird sich daher ändern Kammer Höhe im Laufe der Zeit (der Hersteller empfiehlt den Kauf neuer, nachdem alle zehn verwendet). Unsere Aluminium-Kammer mit integriertem O-Ringe ermöglicht eine vollständige Gegenüberstellung von oberen und unteren Platten und sorgt für eine konstante Kammer Höhe zwischen den Experimenten. Schließlich sind Vakuumpumpen erforderlich sind, um eine auslaufsichere Dichtung in vielen Flusskammer Designs, einschließlich der GlycoTech Kammern, die nicht in unser Design notwendig zu erreichen. Während hier nicht gezeigt, kann die Flusskammer unter einem Mikroskop während des gesamten Flow Experiment zur Echtzeit-Bildgebung von Zell-Adhäsion und / oder Verhalten gehalten werden. Wenn dies gewünscht ist, empfehlen wir die Verwendung einer Wärmelampe oder ein Heizkissen unter die Kammer zu dem Perfusat Temperatur bei 37 ° C zu halten Pelzdort können die Rollenpumpe mit einer Spritze Pumpe ersetzt werden, wenn keine &quot;Rückführung&quot; von Zellen oder Metaboliten oder Prüfpräparate oder Agenten 24 gewünscht wird. Es ist auch möglich, unterschiedlich markierter Zellen über adhärente Zellen, z. B. fluoreszierende Thrombozyten über eine Schicht von konfluenten EPCs (mit Hilfe der Thrombozyten-Assay durch Achneck et al. 6,25) fließen, um Zell-zu-Zell-Interaktion unter Schubspannung bewerten. Unsere Flusskammer kombiniert wertvolle Funktionen von anderen verfügbaren Strömungskammern, wie ein Perfusat Probenahme-Port und ein Sichtfenster und hat den wichtigen Vorteil der Kompatibilität mit einer umgekehrten oder aufrechten Mikroskop. Es ist voll autoklavierbar und ermöglicht wiederholten Versuchen bei konstanter Kammer Höhe und ohne die Notwendigkeit von Vakuumpumpen, um eine dichte Abdichtung zu erreichen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Produkte / Reagenzien </td><td> Firma </td><td> Product # </td></tr><tr><td> 10 ml Spritze </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07940-12 </td></tr><tr><td> 1-Way Stopcoks </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-00 </td></tr><tr><td> 30 ml Spritze </td><td> BD Medical </td><td> 309650 </td></tr><tr><td> 4-Way Hähne </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 30600-04 </td></tr><tr><td> Aluminum Alloy </td><td> N / A </td><td> 6061 </td></tr><tr><td> Cell-Culture Dishes (4-gut, rechteckig) </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 267061 </td></tr><tr><td> Zell-Tracker orange </td><td> Invitrogen </td><td> C34551 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Research Organics </td><td> 2162D </td></tr><tr><td> DPBS (-/-)</td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td></tr><tr><td> EGM-2 Singlequots </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Female Luer-Adapter </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> SI-45500-04 </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> Sigma </td><td> F0895-2MG </td></tr><tr><td> Glasflasche (250ml) mit Cap </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 34594-24 </td></tr><tr><td> Harte Tubing </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06508-16 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Sigma </td><td> H8264-500ML </td></tr><tr><td> Histopaque </td><td> Sigma </td><td> H8889-500ML </td></tr><tr><td> Hoechst Färbelösung </td><td> Sigma </td><td> H6024 </td></tr><tr><td> Hyclone FBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30071.01 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Lonza </td><td> 17-605E </td></tr><tr><td> Luer-Adapter </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> EW-45505-04 </td></tr><tr><td> MCDB-131, 1x Medium </td><td> CellGro </td><td> 15 bis 100-CV </td></tr><tr><td> Barbed Polypropylen Fittings </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 06365-90 </td></tr><tr><td> O-Ringe </td><td> N / A </td><td> AS568A </td></tr><tr><td> Pulse-Dämpfer </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07596-20 </td></tr><tr><td> Pump-Drive (Masterflex L / S mit variabler Drehzahl Sparkurs) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 7524-40 </td></tr><tr><td> Pump-Head (Masterflex Easy Load Pumpenkopf) </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 07518-60 </td></tr><tr><td> Rutsche </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 48500-00 </td></tr><tr><td> Soft-Tubing </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 96400-16 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Spritzenfilter </td><td> Cole Parmer Instrument Co. </td><td> 02915-12 </td></tr><tr><td> Sytox orange Nucleic Acid Stain </td><td> Invitrogen </td><td> S-11368 </td></tr><tr><td> Trypsin EDTA </td><td> Lonza </td><td> CC-5012 </td></tr><tr><td> Trypsin neutralisierende Lösung </td><td> Lonza </td><td> CC-5002 </td></tr></tbody></table>

parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, eine Technik, um anhaftenden Zellen zu Laminar-Flow-Bedingungen unterliegen und bewerten ihre Reaktion auf gut quantifizierbar Flüssigkeit Schubspannungen 1 beschreiben. Unsere Flow-Design und Flow-Schaltung (Bild 1) enthält eine transparente Anzeige Region, die Erprobung von Zell-Adhäsion und Bildgebung von Zell-Morphologie ermöglicht unmittelbar vor Strömung (Abb. 11A, B), zu verschiedenen Zeitpunkten während der Strömung (Abb. 11C) und nach Strömung (Abb. 11D). Diese Experimente sind mit humanen Nabelschnur dargestellt Blut gewonnene endothelialen Vorläuferzellen (EPC) und Schweinen EPCs 2,3. Diese Methode ist auch anwendbar auf andere Anhänger Zelltypen, wie zB glatten Muskelzellen (SMC) oder Fibroblasten. Die Kammer und alle Teile der Schaltung sind leicht mit Dampf Autoklavieren sterilisiert. Im Gegensatz zu anderenKammern, kann z. B. Mikrofluid Kammern, eine große Anzahl von Zellen (&gt; 1 Mio. je nach Größe der Zellen) nach dem Flow Experiment unter sterilen Bedingungen für die Zellkultur oder andere Experimente, zB DNA-oder RNA-Extraktion oder Immunhistochemie (Abb. 11E) wiederhergestellt werden, oder Rasterelektronenmikroskopie 5. Die Schubspannung kann durch Variation der Strömungsgeschwindigkeit des Perfusat, der Viskosität der Flüssigkeit oder des Kanals in Höhe und Breite angepasst werden. Letzteres kann zu reduzieren Flüssigkeitsvolumen oder Zelle muss gleichzeitig sicherstellen, dass eindimensionale Tempo beibehalten wird. Es ist nicht notwendig, Kammer Höhe zwischen den Experimenten zu messen, da die Kammer Höhe nicht auf die Verwendung von Dichtungen, das erhöht die Leichtigkeit von mehreren Experimenten ab. Darüber hinaus das Schaltungsdesign leicht ermöglicht die Sammlung von Perfusat Proben für die Analyse und / oder Quantifizierung von Stoffwechselprodukten von Zellen unter Schubspannung Exposition ausgeschieden, z. B. Stickstoffmonoxid (Abb. 12) 6 </sup&gt;.

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Wir beschreiben eine Methode, um unter adhärenten Zellen eine laminare Strömung Schubspannung in einem sterilen kontinuierlichen Kreislauf. Die Zellen &quot;Haftung kann Morphologie durch die transparente Kammer untersucht werden, Proben aus der Schaltung für Metabolit-Analyse und-Zellen nach Scher-Belastung für zukünftige Experimente oder Kultur geerntet wurden.

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

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Differential Analysis of Fluid Flow

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43.2K Aufrufe.  Duke University Medical Center. Wir beschreiben eine Methode, um unter adhärenten Zellen eine laminare Strömung Schubspannung in einem sterilen kontinuierlichen Kreislauf. Die Zellen "Haftung kann Morphologie durch die transparente Kammer untersucht werden, Proben aus der Schaltung für Metabolit-Analyse und-Zellen nach Scher-Belastung für zukünftige Experimente oder Kultur geerntet wurden.

Serie: Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

Forschung

Biotechnik

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell phenotype after printing, poor organization and distribution of desired cells, and the inability to deliver drugs and/or nutrients to targeted areas in the array. Our 3D microfluidic printing technology is uniquely capable of sealing and printing arrays of cells onto submerged surfaces in an automated and multiplexed manner. The design of the microfluidic cell array (MFCA) 3D fluidics enables the printhead tip to be lowered into a liquid-filled well or dish and compressed against a surface to form a seal. The soft silicone tip of the printhead behaves like a gasket and is able to form a reversible seal by applying pressure or backing away. Other cells printing technologies such as pin or ink-jet printers are unable to print in submerged applications. Submerged surface printing is essential to maintain phenotypes of cells and to monitor these cells on a surface without disturbing the material surface characteristics. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays are produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas including cancer, diabetes, inflammation, infections, and cardiovascular disease.

This 3D microfluidic printing technology prints arrays of cells onto submerged surfaces. We describe how arrays of cells are delivered microfluidically in 3D flow cells onto submerged surfaces. By printing onto submerged surfaces, cell microarrays were produced that allow for drug screening and cytotoxicity assessment in a multitude of areas.

Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolierung von primären murinen Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) durch Durchflusszytometrie

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

Asymmetrische Durchflussfeld-Flow-Fraktionierung zur Dimensionierung von Gold-Nanopartikeln in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

Blutfluss-Bildgebung mit ultraschnellem Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...