Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von einem American Cancer Society Research Scholar Award, (06 bis 024-01-CSM zu Charles J. Dimitroff) zur Verfügung gestellt, ein National Institutes of Health / National Cancer Institute gewähren (RO1CA118124 zu Charles J. Dimitroff) und eines Nationalen Institutes of Health / National Institute of Arthritis and Bewegungsapparates und Hautkrankheiten zu gewähren (P30 AR042689 zu Dr. Thomas S. Kupper, Brigham and Womens Hospital, Boston, MA).

1. Vorbereitung der HBMEC (HBMEC-60 Cell) Monolayer auf Petrischalen für Flusskammer <ol><li> Coat 35 x 10mm Gewebe-Kulturschalen mit 2 ml 20μg/ml Fibronektin (in PBS) über Nacht bei 4 ° C oder 3 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Saugen Sie Fibronektin-Lösung von Speisen und müssen 1,5 x10 5 HBMEC-60-Zellen [Medium 199 mit HEPES &amp; Glutamin, 10% FBS, 10% menschlichem Serum, 5 Einheiten / ml Heparin, 1ng/ml rekombinanten humanen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, 1% Penicillin- Streptomycin], um das Gericht und ihnen zu erlauben, um&gt; 90% Konfluenz wachsen. (Dies dauert 2 Tage) </li><li> Absaugen Wachstum Medien und auf bis zu regulieren E-Selektin-Expression, fügen Sie frisches Medium mit IL-1β 50ng/mL für 4-6 Stunden. Zellmonoschichten sind nun bereit für das Walzen-Assay. Um E-Selektin Funktionsblock, neutralisierende Anti-Human-E-Selektin moAk (Klon BBIG-E4 (5D11)) kann bei 20μg/ml für ~ 1 Stunde bei 37 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung von humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen KG1a Cells für Flusskammer <ol><li> Humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen KG1a Zellen bis zur Konfluenz gewachsen (1x10 6 Zellen / ml) in RPMI-1640 mit Glutamin und 10% FBS / 1% Penicillin-Streptomycin und werden direkt aus der Flasche für den Einsatz in Flusskammer Assay pipettiert. </li><li> Die Zellzahl wird mit Hilfe eines Hämozytometers und dann Zellen werden bei 1 x 10 6 Zellen / ml in HBSS mit 10 mM HEPES (H / H-Puffer) und 2 mM CaCl 2 resuspendiert </li><li> Die Zellen werden auf Eis bis zur Verwendung in Test gespeichert. </li></ol> 3. Vorbereitung der Microscope, Parallel-Plate Flusskammer und Spritzenpumpe (Abbildung 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="Abbildung 1" width="600" height="409" /> Abbildung 1. Illustration von Parallel-Plate Flusskammer Analysis. Inversen Mikroskop, Harvard Spritzenpumpe, Computer / Kamera-und Parallel-Platten-Flusskammer sind in eine optimale Anordnung für eine effiziente und reproduzierbare Zellanalyse platziert. <ol><li> Schalten Sie die Stromversorgung und Lichtquelle, um inverse Mikroskop und Macht Spritzenpumpe und wählen Sie den 10X-Objektiv am Mikroskop. </li><li> Legen Sie 50 mL konischen Rohr im Halter und füllen sich mit H / H und 2 mM CaCl 2. </li><li> Legen Sie 5ml Kunststoff Reagenzgläser in Reagenzglas Halter unterhalb der 50 mL konischen Rohr </li><li> Legen Sie 60 ml Spritze in Spritzenpumpe (Achten Sie darauf, dass sowohl die Kolben und Körper der Spritze sowohl gesichert sind). </li><li> Bringen Sie 3-Wege-Hahn an der 60 ml Spritze Ende und bringen 5ml-Spritze, um 3-Wege-Hahn. </li><li> Legen Parallel Flusskammer Geräten (GlycoTech, Inc.) auf Mikroskop-Bühne mit Eingang Rohr auf der rechten Seite, Endröhre nach links und Vakuumröhrenkollektoren auf dem Rücken. </li><li> Bringen Sie Vakuumschlauch auf Vakuum-und Open-Air-Ventil, damit parallel Plattenapparat auf die Bühne zu halten. (Diese Tests, wenn das Vakuum Rock auf der Flusskammer ist luftdicht.) Schalten Sie das Luftventil. </li><li> Bringen Ausgang Rohrleitung (links von Mikroskop) zu 3-Wege-Hahn. Gerät ist jetzt für die Platzierung auf HBMEC-60 Monoschicht Platte vorbereitet. </li><li> Legen Sie HBMEC-60 Monoschicht Platte und am Zentrum von Mikroskop. </li><li> Schalten Sie Vakuum und die Position der Flusskammer Apparat oberhalb der Platte, so dass die Monoschicht Platte in der Mitte ist. </li><li> Senken Sie die Flusskammer Apparat auf die HBMEC-60 Monoschicht Platte und lassen Flusskammer Gerät zum Absaugen unten. (Es sollte keine Geräusche der Luft entweicht und an diesem Punkt müssen Sie möglicherweise den Druck an die Kammer wenden, um die Gummidichtung zu komprimieren.) </li><li> Sobald Vakuum hergestellt wurde, statt Input Rohr (rechts) in der 50ml konische Röhrchen mit H / H mit 2 mM CaCl 2. </li><li> Offene 3-Wege-Hahn fließen in die 60 ml Spritze und Ort Pumpe in allow &quot;Pumpe-Modus.&quot; </li><li> Um Luft aus Input / Output-Linien, ohne den Zellen auf der Platte, verwenden Sie die Spritzenpumpe auf 2mL/minute Satz an das Ansaugrohr zu füllen, dann schnell auf 0,5 ml / Minute, kurz bevor die Flüssigkeit das Gerät gelangt. Es ist zwingend notwendig, um prime dieser Einrichtung sorgfältig und vermeiden Sie Luftblasen, die die Monoschicht von der Platte heben. </li><li> Sobald Flüssigkeit gesehen, in der 60ml Spritze, die Strömungskammer und Spritzenpumpe bewegen wurden grundiert und der Flow Kammer ist einsatzbereit. Dieser Aufbau wird für jede Zelle Eingang laufen und für jede neue Platte benötigt wiederholt werden. </li></ol> 4. Capturing Leukocyte Rollende Events mit NIS Elements <ol><li> Öffnen Sie NIS Elements auf dem Desktop. </li><li> Drücken Sie &quot;Play&quot;-Symbol für Live-Bild. Automatische Belichtung können Sie sehen, die Platte leichter ab und ist für die Fokussierung wichtig. </li><li> Seien Sie sicher, dass Mikroskop ordnungsgemäß auf dem Zellmonolayer konzentriert. </li><li> Einmal konzentriert, neu eingestellt Exposition gegenüber 1 Bild / s und stellen Sie Licht am Mikroskop. Das Bild sollte auf dem Computer angezeigt und nicht mehr im Mikroskop sichtbaren Sucher aufgrund der geringen Lichtstärke. Licht-Histogramm können dann ad werdenjusted zu Hintergrundbelastung zu entfernen oder zu verbessern Zelle Klarheit. </li><li> Klicken Sie auf 2X2 bin oder Live Bin auf Bild, das sich ideal für Filmaufnahmen zu erhalten </li><li> Klicken Sie auf &quot;Makro&quot; in der Menüleiste und wählen Sie &quot;write to port&quot;; wählen port &quot;COM3&quot; und &quot;offen&quot;. (Dies öffnet den Port mit der Spritzenpumpe zu koordinieren. </li><li> Pipette 1ml von KG1a Zellsuspension in die 5ml Reagenzglas in der Nähe des Eingangs Rohrleitung und setzen Sie dann Eingabe Schlauchleitung auf den Boden des Röhrchens. </li><li> Zum Menüleiste auf &quot;Capture&quot; klicken, &quot;Zeitraffer-Akquisition.&quot; </li><li> Ein neues Menü erscheint. Wählen Sie das Protokoll dauerhaften 210 Sekunden, das ist die Länge des Programms für das Abrollen auf HBMEC-60-Zellen. (Jede Phase ist so programmiert, dass ein Bild pro Sekunde für die Dauer der Pumpe-Protokoll. Es ist auch bis zu einem Befehl über die COM3-Port, um die Pumpe zu starten senden eingestellt.) Wenn Zeitraffer unterbrochen wird, wird die Pumpe nicht zu stoppen auf eigene und müssen zurückgesetzt werden. Drücken Sie auf Abbrechen, um zurück zur Bilder-leben. </li><li> Stellen Sie die Spritzenpumpe auf &quot;Program Mode&quot; nach Anleitung. (Programm-Modus ermöglicht die manuelle Programmierung von spezifischen Durchflussraten (dh Schubspannung Ebenen) innerhalb der Kammer mitgeteilt werden und diktieren KG1a Zell-Interaktionen über die HBMEC-60 Zellmonolayer.) Einstellungen für KG1a Zellrollen auf HBMEC Die Zellen wurden wie folgt 4,2 Dyn / cm 2 für 45 s, 0,3 Dyn / cm 2 für 60 s, und schrittweise erhöht alle 15 s eine maximale von 4,2 dyn / cm 2 </li><li> Wandschubspannung (W st) in der Kammer wurde nach folgender Formel berechnet: W st = 6μQ / a 2 b, wo μ die geschätzte Viskosität der Medien (0,0076 P) ist, Q den Volumenstrom in ml / ist s, ist eine der Kanalhöhe (Dichtungsdicke) in cm (0,03 cm), und b ist die Kanalbreite in cm (0,5 cm). Volumenströme geregelt waren mit dem Programm-Modus der Spritzenpumpe. </li><li> Mikroskop und Computer sind nun bereit, Zeitraffer-Fotografie zu erfassen. Drücken Sie auf &quot;Start Ausführen&quot; auf dem Computer zu beginnen Erfassung von Daten. Während der Ausführung des Programms darauf, dass die Medien in das Reagenzglas mit KG1a Zellen hinzufügen, um immer die Input / Output-Schlauch voller Medium (Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen). </li></ol> 5. Die Abhängigkeit von Terminal Sialylierung und Oberflächenglykoprotein für E-Selektin-vermittelte KG1a Cell 5. Rolling (Abbildung 2; Videos Clips von 5,1 bis 5,5) <ol><li> Testen von KG1a Zellrollen auf nicht-stimulierten HBMEC-60-Zellen. (Negative Kontrolle) KG1a Zellen wurden hergestellt und infundiert in die Strömungskammer über Live-nicht-IL-1β-stimulierten HBMEC-60 wie oben beschrieben. </li><li> Testen von KG1a Zellrollen auf HBMEC-60-Zellen mit IL-1β vorbehandelt. (E-Selektin-Abhängigkeit control) KG1a-Zellen hergestellt wurden und in die Strömungskammer über infundiert leben IL-1β-stimulierten HBMEC-60 wie oben beschrieben. </li><li> Testen von KG1a Zellrollen auf HBMEC-60-Zellen mit IL-1β und dann neutralisieren Anti-Human-E-Selektin Moab. (E-Selektin-Abhängigkeit control) KG1a Zellen wurden hergestellt und in die Strömungskammer über Live infundiert IL-vorbehandelten 1β-stimulierten HBMEC-60 vorbehandelt mit neutralisierenden Anti-Human-E-Selektin moAk wie oben beschrieben. </li><li> Testen von Sialidase-verdaut KG1a Zellrollen auf IL-1β-stimulierten HBMEC-60. KG1a Zellen vorbehandelt mit 0.1U/ml Vibrio cholerae Neuraminidase für 1 Stunde bei 37 ° C wurden vorbereitet und in die Strömungskammer über infundiert leben IL-1β-stimulierten HBMEC-60 wie oben beschrieben. </li><li> Testen von Protease-verdauten KG1a Zellrollen auf IL-1β-stimulierten HBMEC-60. KG1a Zellen vorbehandelt mit Protease wurden 0.2U/ml Bromelain für 1 Stunde bei 37 ° C, vorbereitet und in die Strömungskammer über infundiert leben IL-1β-stimulierten HBMEC-60 wie oben beschrieben. </li></ol> 6. Die Analyse der NIS-Elements-Captured KG1a Cells und grafische Darstellung von KG1a Zellrollen Daten <ol><li> Nach Zeitablauf erworben wird, die Daten zu speichern. </li><li> Gehe zu &quot;messen&quot; Lasche auf Menüleiste und wählen Sie &quot;define Schwelle.&quot; Bewegen Sie Bars, so dass gewünschten Zellen sind rot gefärbt. Wählen Sie &quot;alle Bilder&quot;, dann &quot;Okay&quot;. Die gesamte Zeitraffer-Sequenz sollte nun mit sichtbaren roten rollenden Zellen modifiziert werden. </li><li> Zum &quot;Messen&quot; und wählen Sie &quot;Einschränkungen&quot;. (Einschränkungen erlauben dem Benutzer, Schwellenwert Objekte, die nicht repräsentieren rollenden Zellen auszuschließen. Dies ist in erster Linie Hintergrund der HBMEC-60 Monoschicht erstellt.) Wählen Sie &quot;Bereich&quot; und geben Sie Minimal-und Maximalwerte für den Bereich für das rollende Zellen. Wiederholen Sie diesen Schritt für &quot;Dehnung&quot; und &quot;Rundheit&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Messen&quot; und wählen Sie &quot;erstellen binäre mit Einschränkungen&quot;, und stellen Sie die Einschränkung Werte NIS-Elements-Software Anerkennung des rollenden Zellen auf Monolage HBMEC-60-Zellen zu optimieren. </li><li> Gehen Sie zurück zu &quot;messen&quot;, wählen Sie &quot;Felddaten&quot;, und wählen Sie dann &quot;Daten zurücksetzen&quot;. Dieses Menü schließen. </li><li> Zurück zu &quot;Measure&quot; und seSelect &quot;Scan-Feld&quot;. </li><li> Öffnen Sie &quot;Messen&quot;, &quot;Field-Daten&quot;, wählen Sie &quot;Nummer oder Objekte&quot; und wählen Sie dann &quot;alle Felder&quot; und Export von Daten in Microsoft Excel. </li><li> Wählen Sie &quot;Löschen von Daten&quot; auf NIS-Elements Zelle Übernahme für die nächste Datenerhebung vorzubereiten. </li></ol> Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="Abbildung 3" width="600" height="382" /> Abbildung 3. Parallel-Plate Flusskammer Analyse von E-Selektin-bindenden Aktivität auf KG1a Cells. KG1a Zellen mit Sialidase oder Protease behandelt wurden Rollwiderstand auf Monoschichten von HBMEC-60-Zellen mit IL-1β vorbehandelten analysiert. Negative Kontrolle rollenden Experimente wurden auch durch die Analyse KG1a Zellrollen auf nicht-IL-1β-stimulierten HBMEC -60 Zellen oder IL-1β durchgeführt stimulierten HBMEC-60-Zellen mit neutralisierenden Anti-Human-E-Selektin moAk (5D11) behandelt. Zellrollen Frequenzen wurden dreifach durchgeführt und analysiert mit NIS-Elements-Software. (* Statistische Signifikanz: p &lt;0,001) In diesem Video-basierten Bericht, sofern wir eine visuelle Darstellung, wie Leukozyten-Analyse - endothelialen Zell-Wechselwirkungen unter physiologischen Schubspannung Bedingungen. Insbesondere untersuchten wir die Rolle von E-Selektin - E-Selektin-Liganden bei der Vermittlung von Leukozyten Tethering und Rollen, einen Kleber Verhalten notwendig Engagement der sekundären stabilere Bindung Aktivitäten durch Rezeptoren, wie Integrine und Hyaluronsäure-Rezeptoren. Mit dem Parallel-Platten-Flusskammer für die Verwendung mit einem inversen Mikroskop, Harvard Spritzenpumpe, Videokamera und Computer / Zelle Erwerb Hardware angepasst, führten wir Experimente, bei E-Selektin-Ligand + KG1a Zellen wurden als unsere Leukozyten-Modell und HBMEC Zellen verwendet (HBMEC- 60) mit pro-inflammatorischen Zytokinen, IL-1β stimuliert wurden, wie unsere E-Selektin + humaner Endothelzellen-Modell (1-6) verwendet. Wie bereits berichtet, beobachteten wir robust KG1a Zellrollen auf IL-1β-stimulierten HBMEC-60-Zellen über einen Bereich von Schubspannung Ebenen in einer E-Selektin-abhängigen Weise (Abbildung 3) (statistisch signifikanter Unterschied, wenn sie mit KG1a Zellrollen auf Vergleich Nicht-IL-1β stimulierten HBMEC-60-Zellen). Negative Kontrollen, die von KG1a Zellrollen auf nicht-IL-1β-stimulierten HBMEC-60-Zellen oder aus IL-1β-stimulierten HBEMC-60-Zellen vorbehandelt mit Anti-Human-E-Selektin mAb, wurden parallel durchgeführt, um die Abhängigkeit zu demonstrieren von Zytokin-Stimulation und E-Selektin-Expression für das rollende Aktivität (Abbildung 3). Darüber hinaus rollt Analyse KG1a Zellen vorbehandelt mit Vibrio cholerae Neuraminidase (Sialidase) oder mit Bromelain, ein nicht-spezifische Protease für die Verdauung Oberfläche E-Selektin-Glycoprotein-Liganden bekannt, hob die Bedeutung der terminalen Sialinsäure-Reste und Oberflächenglykoprotein für E-Selektin-Liganden Aktivität (2,3).

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen.">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .</li><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands,+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1,+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells.">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li><li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine:+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand.">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li><li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis.">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li><li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells:+characterisation+of+new+cell+lines.">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder Angaben.

Parallel-Platten-Flusskammer Analyse ist eine spezielle In-vitro-Testsystem für die Untersuchung Leukozyten verwendet - endothelial adhäsive Wechselwirkungen unter Scherbeanspruchung ähnlichen Bedingungen wie denen auf der Oberfläche eines post-kapillaren venule vermittelt. Wie dargestellt hier in unserem visuellen Präsentation zeigen wir, den Wert dieses Systems für die Untersuchung der Rolle von E-Selektin - E-Selektin-Liganden bei der Vermittlung von Leukozyten Tethering und Rollen auf der Oberfläche von aktivierten mikrovaskulären Endothel. Wir zeigen auch die Anwendung von Protease, Glycosidase und blockierenden Antikörper-Behandlungen für die Aufklärung der Rolle von E-Selektin und seine Liganden in diesem System. Diese Analysen sind sehr gut reproduzierbar und helfen Form einer experimentellen Grundlage für die Untersuchung von E-Selectin - E-Selektin-Ligand-Funktion in vivo. Neben dem Studium der Zelladhäsion mit Monoschichten von Zytokin-aktivierten mikrovaskulären Endothelzellen (HBMEC oder menschlichen Nabelvene oder dermalen mikrovaskulären Endothelzellen), können Tests durchgeführt unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem humanem E-Selectin oder E-Selektin-Ig chimäre Moleküle als Substrat werden für die Zelladhäsion. Andere adhäsive Wechselwirkungen durch Leukozyten (L-)-Selektin und Thrombozyten (P)-Selektin kann auch untersucht unter Verwendung von parallelen Platten Flusskammer Technologie vermittelt. Durch Variation der Art der Zellmonolayer / Protein-Substrat oder der Eingang Leukozyten / Selektin-transfizierten Zelle Modellen, können die Ermittler die Rolle dieser Wechselwirkungen unter physiologischen Schubspannung Bedingungen zu studieren.

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15575-038</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parallel-Plate Flow Chamber Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GlycoTech</td>
<td>31-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHD2000 Programmable Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35x10mm Tissue Culture Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD FALCON</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin , from human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>86088-83-7 F2006-2MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Interleukin-1_, Human; Recombinant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>I9401-5UG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medium 199 w/ HEPES & Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12320-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Innovative Research, Inc.</td>
<td>IPLA-SER1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abraxis Pharmaceutical Products</td>
<td>504011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Test tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems	</td>
<td>BBA16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromelain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>B-4882</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
				 	
	

		</div>

analysis of physiologic e-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium

E-Selektin ist ein Typ-1-Protein auf mikrovaskuläre Endothelzellen, initiieren Rekrutierung von zirkulierenden Leukozyten an Haut-, Knochen-und entzündetem Gewebe hilft. E-Selektin-Expression ist konstitutiv für die Haut und Knochen Mikrogefäßen und induzierbar ist durch pro-inflammatorische Zytokine wie IL-1α / und TNF-α, auf Mikrogefäßen in entzündetem Gewebe. Das Lektin Rezeptor vermittelt schwache bindende Wechselwirkungen mit Kohlenhydrat-Zähler-Rezeptor-Liganden auf zirkulierenden Leukozyten, die in einem charakteristischen Abrollverhalten führt. Da diese Wechselwirkungen stabiler Kleber Veranstaltungen und Diapedese Aktivität, Charakterisierung von Leukozyten-Rolling-Aktivität und Identifizierung von Leukozyten E-Selektin-Liganden voraus haben große Ziele in Studien von Leukozyten Menschenhandel und Entzündungen sowie bei der Entwicklung von entzündungshemmenden Therapien (1-5) wurden . Die Absicht dieses Berichts ist es, ein visuelles, umfassende Beschreibung der am häufigsten eingesetzte Technologie für das Studium von E-Selectin E-Selektin-Ligand-Wechselwirkungen unter physiologischen Blutfluss Bedingungen zu gewährleisten. Unser Labor in Verbindung mit der Harvard Skin Disease Research Center nutzt eine state-of-the-art parallel-plate Flusskammer Apparat durch digitale Visualisierung und neue Recording-Software, NIS-Elements begleitet. Diese Technologie ermöglicht es uns, Haftung Ereignisse in Echtzeit auf dem Bildschirm für die Visualisierung sowie Rekord rollenden Tätigkeit in einem Video-Format zu analysieren. Zelladhäsion Parameter, wie z. B. Walzen Frequenz, Scherfestigkeit und Bindung / Anbindehaltung Effizienz, mit NIS-Elements Software berechnet, exportiert nach einer Excel-Tabelle und einer statistischen Analyse. In der Demonstration hier vorgestellten beschäftigten wir die Parallel-Platten-Flusskammer an E-Selektin-abhängigen Leukozyten-Rolling Aktivität auf lebenden menschlichen Knochenmark Endothelzellen (HBMEC) zu untersuchen. Humanen hämatopoetischen Vorläuferzellen KG1a Zellen, die ein hohes Maß an E-Selektin-Liganden exprimieren, wurden wie unsere Leukozyten-Modell verwendet, während einer immortalisierten HBMEC Zelllinie, HBMEC-60-Zellen, wie unsere Endothelzellen-Modell (6) verwendet wurde. Zu induzieren und zu simulieren nativen E-Selektin-Expression in der Strömungskammer, HBMEC-60-Zellen wurden zunächst mit IL-1 aktiviert. Unsere Video-Präsentation zeigte, dass Parallel-Platten-Flow-Analyse ist eine geeignete Methode zur Untersuchung von physiologischen E-Selektin-vermittelte Leukozyten-Rolling-Aktivitäten und die funktionelle Charakterisierung von Leukozyten-E-Selektin Ligand (en) in der Strömungskammer kann festgestellt werden, durch die Umsetzung Protease oder Glycosidase Aufschlüsse.

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Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

Dieser Bericht liefert eine visuelle Darstellung der parallelen Platten Flusskammer Analyse für das Studium Leukozyten Endothel-Interaktionen unter physiologischen Schubspannung. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung der Rolle der endothelialen (E)-Selektin und Leukozyten-E-Selektin-Liganden, die Trigger-Leukozyten-Rollen auf Endothelzellen Oberflächen.

Die Analyse der physiologischen E-Selectin-vermittelte Leukozyten-Rolling auf mikrovaskuläre Endothel

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

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Research

JoVE Journal

Biology

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Serie: Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

Ausdruck von fluoreszierenden Fusionsproteinen in murinen Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen und Makrophagen

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.