Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health, NIH Stipendium Nr. / NCRR P41-RR 016292 (für ACERT) unterstützt.

1. Materialien Alle Lösungsmittel in dieser Arbeit verwendet wurden analysenrein. Der Spin-Trap, einschließlich N-tert-Butyl-α-phenylnitron (PBN) und die Standard-Spin-Label 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperinyoxyl (TEMPO) wurden von Sigma bezogen und verwendet wurden wie geliefert. Die Anlage Antioxidantien wurden kommerziell von Swanson, Inc. USA erhalten. 2. Vorbereitung von Zigarettenrauch und Analyse von freien Radikalen <ol><li> Zur Einführung Antioxidantien in den Filter, wurden die Antioxidantien Pycnogenol und Traubenkernextrakt zunächst in 95% Ethanol gelöst, während Lycopin in Aceton gelöst wurde. Das Lösungsmittel Bände unterscheiden sich je nach Antioxidans Löslichkeit. </li><li> Die Menge der Antioxidantien von 0,4 mg / Filter verwendet wurde. Sie wurden dann mit 10 mg Aktivkohle beschichtet. Zu diesem Zweck Aktivkohle wurde für ~ 12 Std mit dem Antioxidans Lösung unter anaeroben Bedingungen, filtriert und getrocknet unter Vakuum gerührt. </li&gt; <li> Antioxidantien wurden dann in die herkömmlichen Acetat-Filter (CA-Filter) eingeführt. Zu diesem Zweck wurde der Filter in zwei Teile geschnitten. Die beschichteten Werk Antioxidantien wurden zwischen zwei Stücken des Filters und umwickelt es mit einem Stück Klebeband eingesetzt, um einen Filter zu bilden - Antioxidans-Filter-Sandwich (Abb. 1A). Dieser kombinierte Filter wurde anschließend Zigarettensträngen Tabak enthaltend befestigt. Die Steuerung der Filter in der gleichen Weise wie die antioxidative Filter außer kein Antioxidans gemacht wurde aufgenommen. </li><li> Vor dem Rauchen Simulation wurden die Forschungs-Zigaretten ausgepackt und in einer konstanten Luftfeuchtigkeit (20 ° C, 60% relative Feuchte) mit einer gesättigten NaBr-Lösung für ein Minimum von 2 Tagen. </li><li> Smoking-Simulation für die Routineanalytik bei Raumtemperatur wurde mit einem Single-Port-Gerät, das Rauchen, wie in Abb. 1 dargestellt, besteht aus einer Wasserstrahlpumpe oder GAST DOA-P104-BN Vakuumpumpe / Kompressor (Benton Harbor, Mich) verbunden der Spin-TrappingMontage durch eine T-Kreuzung mit einem Ende offen. Puffs wurden, indem Sie das offene Ende, das offen zwischen den Zügen blieb durchgeführt. Der Gasstrom wurde durch Durchflussmesser kontrolliert und eingestellt auf ~ 2,2 SCFH = 17,5 ml / s durch Verstellen eines Ventils zwischen der Pumpe und der Entlüftung installiert. </li><li> Die Forschungs-Zigaretten wurden unter der Bedingung, puff Volumen von 35 ml für eine Dauer von 2 Sekunden geraucht wiederholt sich alle 60 Sekunden, ähnlich wie bei 1. Smoking-Simulation für die quantitative Abschätzung der Gasphase freie Radikale wurde in Zusammenarbeit mit der Spin-Trapping-System wie in Abb. durchgeführt. 1. </li><li> Zehn intensive Puffs (35 ml / Hub) wurden für jede Zigarette genommen. Gas-Phase freien Radikalen wurden durch das Bestehen der MCS durch eine Cambridge Filter gesammelt und dann in die Spin Trapping-Lösung (0,05 M PBN in Benzol, 2,0 ml) eingeführt. </li><li> Nach dem letzten Zug, war das Blasen Überfüllungslösung wieder auf sein ursprüngliches Volumen (2,0 ml) mit der gleichen Benzol. Ein Aliquot wurde in einem ~ 25 übertragen0 mm lang, 3 mm ID Glasrohr an einem Ende verschlossen. </li><li> Die Trapping-Lösung wurde sauerstoffarmes mit einem Gefrier-Pump-Auftau-Prozedur. Es wurde unter flüssigem Stickstoff eingefroren und ein Vakuum angelegt. Dann war es unter Argon-Atmosphäre aufgetaut, so dass eingeschlossene Gasblasen zu entkommen, und wieder eingefroren. Nach diesem Zyklus dreimal wiederholt wurde, wurde das Rohr zugeschmolzen unter Vakuum und in weitere ESR-Messungen. Dieser Schritt ist erforderlich, da Sauerstoff, der gut löslich in Benzol, erweitert ESR-Linien von organischen Resten. Desoxygenierung dramatisch verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis. </li><li> X-Band ESR-Spektren wurden auf einem Bruker EMX-Spektrometer bei einer Frequenz von 9,34 GHz unter Standard-Bedingungen aufgezeichnet. Das Spektrometer-Einstellungen in den meisten Experimenten verwendet wurden: Center-Bereich 3312.5G, Scanbreite 80G, Modulationsamplitude 0.5G, Zeitkonstante 82 Mikrosekunden Zykluszeit 40 sec. </li><li> Der Spin-Trap-Addukte sind relativ stabil bei dem Experiment Bedingungen, die in einigen Fällen required 25-Ansammlungen, die in der Regel dauerte ca. 20 min. Doch nach 12 Stunden die Intensität der ESR-Signale in Benzol-Losung ging um einen Faktor von ~ 5. </li><li> Zur Quantifizierung der Konzentration des Trapping-Addukt, war seine anfängliche ersten Ableitung ESR-Spektrum integriert. Die daraus resultierende Absorptionsspektrum zeigt ein breites Singulett Hintergrund, wahrscheinlich aufgrund Ruß / Teer-Produkte in den Rauch enthalten sind. Nach Abzug von diesem Hintergrund getrennt Triplett des Trapping-Addukt wurde ein weiteres Mal (Abb. 2) integriert. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse Die meisten der freien Radikale in brennende Zigarette produzierten Rauch (Gasphase) sind sofort und instabil. Um diese Reste zu beobachten Spin-Trap-Technik eingesetzt wird. Es fängt in der Gasphase freie Radikale durch die Umwandlung in ein Spin-Addukt, das stabiler ist und von ESR (Abb. 1) festgestellt werden. In der vorliegenden Studie, die Spin-Trap-Lösung von 0,05M PBN wurde verwendet, um Rauch Gasphase freie Radikale, die ein Gemisch aus Sauerstoff-und Kohlenstoff-zentrierte Radikale, die schwer zu 15 separate, sind zu sammeln. In unserem Fall ist aber die beobachteten Hyperfeinaufspaltung Konstanten a N = 13.7G und H = 1.95g sind sehr ähnlich zu den entsprechenden Werten für Trapping-Addukte von Alkoxyl freie Radikale (Ro.) 2, was darauf hindeutet, dass sie das Hauptprodukt sind. Wir zeigten, dass schwache ESR-Signale und geringen Reproduzierbarkeit in unseren ersten Messungen beobachtet werden (Abb. 2) wurden aufgrund der Feuchtigkeit in den Rauch fließen. Um dieses Problem zu lösen, haben wir einen flüssigen Stickstoff (LN2) trap zwischen dem Cambridge-Filter und der Spin-Trap-Lösung. Die LN 2-Falle entfernt Wasser aus der MCS Flow durch schnelles Einfrieren und eroberte es auf der Innenwand der Glasröhre. Diese stark ESR-Signale verbessert und erlaubt für hoch reproduzierbare Ergebnisse (Abb. 3). Die Menge der eingeschlossenen freien Radikalen wurde mit einemReferenzprobe. Für Kontrollproben ohne Antioxidantien, war die typische Addukt-Konzentration in Benzol durch Vergleich seiner Doppelintegral Spektrum mit einem Doppel-Integral-Spektrum für bekannte Konzentration des TEMPO schätzungsweise 1,24 pM (Abb.2). Da die Menge an Luft ging durch jede Zigarette beim Rauchen war ~ 350 ml, gibt dieser eine Schätzung für das freie Radikal-Konzentration in der Gasphase von MCS von ~ 7.1X10 -9 M und einer Gesamtzahl von Radikalen aus der Gasphase gefangen einer ganzen Zigarette ~ 1.5x10 15. Eine Schätzung für die gesamte Menge an freien Radikalen im Rauch einer Zigarette ganzen, darunter Gas-und partikulären Phase, war ~ 10 16 freie Radikale 9. Verschiedene Ebenen des Spüleffekt von pflanzlichen Antioxidantien auf Gasphase freie Radikale in main stream Zigarettenrauch beobachtet. Deren Aufräumen Raten wurden in Abb. dargestellt. 4. Lycopin und Traubenkernextrakt zeigten die höchsten Raten bei niedrigener betrug für Pycnogenol (Abb. 4) beobachtet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ein Diagramm der verbesserten Rauchen Simulation Design für das Sammeln der Gasphase freie Radikale in den Mainstream-Zigarette zu rauchen (MCS) mit Spin-Trap. MCS wurde durch eine Wasserstrahlpumpe durch CA-Filter, dann Cambridge-Filter (Gelbfilter) gezogen und durch ein Flüssigstickstofffalle zu H 2 O. entfernen Die Gasphasen-Produkten ging schließlich zu fangen Spin und sprudelte durch die Spin-Trap-Lösung. Pflanze Antioxidans wurde zwischen zwei Stücken von herkömmlichen Acetat-Filter gesetzt (Vergrößerte in Kreis A) an Zigaretten, freie Radikale im MCS abzufangen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig2.jpg" /> Abbildung 2. Eine quantitative Schätzung für die Spin-Trapping-Addukt-Konzentration in Benzol erfordert Subtrahieren einer breiten Hintergrund Signal von der ersten Integrationl Spektrums. Die Hyperfeinstruktur-Parameter für die Spin-Trapping-Addukt sind H = 1,95 G, ein N = 13.7G. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig3.jpg" /> Abbildung 3. Passing durch LN2 Falle wesentlich verbessert die Qualität der ESR-Signale durch Spin-Trapping von MCS erhalten. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig4.jpg" /> Abbildung 4. Wirkung von natürlichen Antioxidantien auf die Konzentration an freien Radikalen in MCS. Die relativen Signalintensitäten sind: Kontrolle - 100%, Pycnogenol - 55%, Traubenkernextrakt - 12%, Lycopin - 10%.

<ol>
	<li>Baum, S. L., Anderson, I. G. M., Baker, R. R., Murphy, D. M., Rowlands, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spin+resonance+and+spin+trap+investigation+of+free+radicals+in+cigarette+smoke:+development+of+a+quantification+procedure.">Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure.</a> Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).</li><li>Bluhm, A. L., Weinstein, J., Sousa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+in+tobacco+smoke.">Free radicals in tobacco smoke.</a> Nature. 229, 500-500 (1971).</li><li>Church, D. F., Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free-radical+chemistry+of+cigarette+smoke+and+its+toxicological+implications.">Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications.</a> Environ. Health. Perspect. 64, 111-126 (1985).</li><li>Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenging+effects+of+hemoglobin+and+related+heme+containing+compounds+on+nitric+oxide,+reactive+oxidants+and+carcinogenic+volatile+nitrosocompounds+of+cigarette+smoke.+a+new+method+for+protection+against+the+dangerous+cigarette+constituents.">Scavenging effects of hemoglobin and related heme containing compounds on nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke. a new method for protection against the dangerous cigarette constituents.</a> Anticancer. Res. 14, 2717-2726 (1994).</li><li>Hecht, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke+carcinogens+and+lung+cancer.">Tobacco smoke carcinogens and lung cancer.</a> Journal of the National Cancer Institute. 91, 1194-1210 (1999).</li><li>Kodama, M., Kaneko, M., Aida, M., Inoue, F., Nakayama, T., Akimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radical+chemistry+of+cigarette+smoke+and+its+implication+in+human+cancer.">Free radical chemistry of cigarette smoke and its implication in human cancer.</a> Anticancer. Res. 17, 433-437 (1997).</li><li>Nair, A. K., Brandt, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+smoking+on+health+care+costs.">Effects of smoking on health care costs.</a> Journal of Oklahoma State Medical Association. 93, 245-250 (2000).</li><li>Nishizawa, M., Kohno, M., Nishimura, M., Kitagawa, A., Niwano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Peroxyradicals+in+Cigarette+Smoke+and+the+Scavenging+Effect+of+Shikonin,+a+Naphthoquinone+Pigment.">Presence of Peroxyradicals in Cigarette Smoke and the Scavenging Effect of Shikonin, a Naphthoquinone Pigment.</a> Chem. Pharm. Bull. 53, 796-799 (2005).</li><li>Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+and+the+involvement+of+free+radical+reactions+in+chemical+carcinogenesis.">Cigarette smoke and the involvement of free radical reactions in chemical carcinogenesis.</a> Br. J. Cancer. 8, 19-23 (1987).</li><li>Pryor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+radicals+and+the+role+of+free+radicals+in+chemical+carcinogenicity.">Cigarette smoke radicals and the role of free radicals in chemical carcinogenicity.</a> Environ. Health. Perspect. 105, 875-882 (1997).</li><li>Rozzi, N. I., Singh, R. K., Vierling, R. A., Watkins, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercritical+fluid+extraction+of+lycopene+from+tomato+processing+byproducts.">Supercritical fluid extraction of lycopene from tomato processing byproducts.</a> J. Agric. Food. Chem. 50, 2638-2643 (2002).</li><li>Shopland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+use+and+its+contribution+to+early+cancer+mortality+with+a+special+emphesis+on+cigarette+smoking.">Tobacco use and its contribution to early cancer mortality with a special emphesis on cigarette smoking.</a> Environmental. Health. Perspectives. 103, 131-142 (1995).</li><li>Shrikhandle, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wine+products+with+health+benefits.">Wine products with health benefits.</a> Food Res. Int. 33, 469-474 (2000).</li><li>Valavanidis, A., Haralambous, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+by+electron+paramagnetic+resonance+of+free+radical+species+in+the+mainstream+and+sidestream+smoke+of+cigarettes+with+conventional+acetate+filters+and+'bio-filters'.">A comparative study by electron paramagnetic resonance of free radical species in the mainstream and sidestream smoke of cigarettes with conventional acetate filters and 'bio-filters'.</a> Redox. Rep. 6, 161-171 (2001).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+smoke:+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+stable+free+radicals+in+mechanisms+of+oxidative+damage,+carcinogenesis+and+synergistic+effects+with+other+respirable+particles.">Tobacco smoke: involvement of reactive oxygen species and stable free radicals in mechanisms of oxidative damage, carcinogenesis and synergistic effects with other respirable particles.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 6, 445-462 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine zuverlässige Schätzung der Wirkung verschiedener Radikalfänger in Tabakrauch erfordert eine reproduzierbare Methode zur quantitativen Bestimmung der freien Radikale. Zuvor 1, hat es sich gezeigt, dass kleine Mengen von höherer Konzentration Spin-Trap-Lösungen in nicht-polaren Lösungsmitteln am effektivsten Trapping freie Radikale aus dem Tabakrauch werden. Zigarettenrauch enthält immer Wasserdampf aus der Verbrennung von organischen Verbindungen und die Restfeuchte in Tabak, der am Ende in den Fang Lösungsmittel. Diese Beimischung von Wasser in die PBN-Spin-Trap-Lösung deutlich verringert die Lebensdauer der Spin Trapping-Addukte und die Intensität ihrer ESR-Signale. Das Entfernen dieser Feuchtigkeit durch einfache Weitergabe MCS durch eine U-förmige Röhre mit flüssigem Stickstoff gekühlt dramatisch verbessert die Qualität der ESR-Spektren in unseren Experimenten, obwohl einige Bruchteil der Gasphase Radikale können auch auf der gefrorenen Oberfläche aufgefangen werden. Mit tseine Technik, die wir relative Effizienz verschiedener Radikalfängereigenschaften natürlichen Verbindungen in Zigarettenfilter eingeführt verglichen. Wir fanden, dass Lycopin und Traubenkernöl-Extrakt sofort nach dem Aufnehmen in Zigarettenfilter der Lage sind, abzufangen bis zu 90% von freien Radikalen aus der Gasphase MSC. Solch hohe Bindungskapazität Reihen dieser billigen leicht verfügbaren natürlichen Verbindungen zu den effizientesten berichtet freie Radikale Protektoren wie Hämoglobin und shikonine 8,14. Doch in unseren Experimenten Zigarettenfilter mit studierte natürlichen Antioxidantien geladen verloren einen spürbaren Teil ihrer Bindungskapazität nach einer Woche Lagerung bei Raumtemperatur. Die Lösung dieses Problems kann stimulieren die künftige Anwendung von Lycopin und Traubenkernextrakt in kommerziellen Zigarettenfilter.

a protocol for detecting and scavenging gas-phase free radicals in mainstream cigarette smoke

Zigarettenrauchen ist mit der menschlichen Krebsarten. Es wurde berichtet, dass die meisten der Todesfälle infolge von Lungenkrebs durch Zigarettenrauchen 5,6,7,12 verursacht werden. Obwohl Tabak Teer und verwandten Produkten in der Partikelphase von Zigarettenrauch Hauptursachen für krebserzeugende und erbgutverändernde Krankheiten sind, enthält Zigarettenrauch erhebliche Mengen an freien Radikalen, die auch als eine wichtige Gruppe von Karzinogenen 9,10 berücksichtigt. Freie Radikale greifen Zellbestandteile durch Schädigung Proteinstruktur, Lipide und DNA-Sequenzen und erhöhen die Risiken der Entwicklung verschiedener Krebsarten. Inhalative Radikale Addukte, dass viele der negativen gesundheitlichen Auswirkungen von Tabakrauch in der Lunge 3 beitragen. Es wurden Studien durchgeführt, um freie Radikale im Zigarettenrauch zu reduzieren, um die Risiken der durch Tabakkonsum verursachten Schäden zu verringern. Es wurde berichtet, dass Hämoglobin und Häm-haltigen Verbindungen konnten teilweise abzufangen Stickoxid-, Blind-Oxidantien und krebserregende flüchtige Nitrosoverbindungen von Zigarettenrauch 4. Ein &quot;bio-filter &#39;bestand aus Hämoglobin und Aktivkohle wurde verwendet, um die freien Radikale abzufangen und zu entfernen bis zu 90% der freien Radikale aus dem Zigarettenrauch 14. Doch aufgrund der Kosten-Ineffizienz, war es nicht erfolgreich vermarktet. Eine andere Studie zeigte eine gute Spülung Effizienz von Shikonin, eine Komponente der chinesischen Kräutermedizin 8. In der vorliegenden Studie berichten wir über ein Protokoll zur Einführung der gemeinsamen natürliches Antioxidans Extrakten in den Zigarettenfilter zum Abfangen Gasphase freie Radikale im Zigarettenrauch und Messung der abzufangen Wirkung auf Gasphase freie Radikale in den Mainstream-Zigarette zu rauchen (MCS) mit Spin-Trapping Elektronen-Spin-Resonanz (ESR)-Spektroskopie 1,2,14. Wir zeigten eine hohe Bindungskapazität von Lycopin und Traubenkernextrakt, die ihre zukünftige Anwendung in Zigarettenfilter Punkt könnte. Ein wichtiger Vorteil dieser Vor-pective Aasfresser ist, dass sie in großen Mengen von Nebenprodukten der Tomaten-oder Wein-Industrie bzw. 11,13 erhältlich

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke at JoVE.com

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Spin-Trapping-ESR-Spektroskopie wurde verwendet, um die Wirkung von pflanzlichen Antioxidantien Lycopin, Pycnogenol und Traubenkernextrakt auf Spülgas-Phase freien Radikale im Zigarettenrauch zu studieren.

Ein Protokoll zur Erkennung und Scavenging Gas-Phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

a-protocol-for-detecting-scavenging-gas-phase-free-radicals

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.2K Aufrufe.  CDCF-AOX Lab. Spin-Trapping-ESR-Spektroskopie wurde verwendet, um die Wirkung von pflanzlichen Antioxidantien Lycopin, Pycnogenol und Traubenkernextrakt auf Spülgas-Phase freien Radikale im Zigarettenrauch zu studieren.

Serie: A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Forschung

Biotechnik

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.

The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.

Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

Applications such as sensors, batteries, and fuel cells have been improved through the use of highly porous aerogels when functional compounds are encapsulated within the aerogels. However, few reports on encapsulating proteins within sol&#8211;gels that are processed to form aerogels exist. A procedure for encapsulating cytochrome c (cyt. c) in silica (SiO2) sol-gels that are supercritically processed to form bioaerogels with gas-phase activity for nitric oxide (NO) is presented. Cyt. c is added to a mixed silica sol under controlled protein concentration and buffer strength conditions. The sol mixture is then gelled and the liquid filling the gel pores is replaced through a series of solvent exchanges with liquid carbon dioxide. The carbon dioxide is brought to its critical point and vented off to form dry aerogels with cyt. c encapsulated inside. These bioaerogels are characterized with UV-visible spectroscopy and circular dichroism spectroscopy and can be used to detect the presence of gas-phase nitric oxide. The success of this procedure depends on regulating the cyt. c concentration and the buffer concentration and does not require other components such as metal nanoparticles. It may be possible to encapsulate other proteins using a similar approach making this procedure important for potential future bioanalytical device development.

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

This procedure describes how to encapsulate cytochrome c (cyt. c) in silica (SiO2) sol-gels, process these gels to form bioaerogels, and use these bioaerogels to rapidly recognize nitric oxide (NO) through a gas-phase reaction. This type of protocol may aid in the future development of biosensors or other bioanalytical devices.

Einkapseln Cytochrome<em&gt; c</em&gt; In Silica Aerogel-Nanoarchitekturen ohne Metallnanopartikel unter Beibehaltung der Gasphase Bioaktivität

Applications such as sensors, batteries, and fuel cells have been improved through the use of highly porous aerogels when functional compounds are ...

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among adults. High quality, reproducible research on the consequences of electronic cigarette use is essential for understanding emerging public health concerns and crafting evidence based regulatory policy. While a growing number of papers discuss electronic cigarettes, there is little consistency in methods across groups and very little consensus on results. Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This protocol details instructions for the assembly and operation of said device, and demonstrates the use of the generated extract in two sample applications: an in vitro cell viability assay and gas-chromatography mass-spectrometry. This method provides a tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This method provides a useful tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Ein Mikrocontroller betrieben Gerät zur Erzeugung von flüssige Extrakte aus herkömmlichen Zigarette Rauch und elektronische Zigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

Katalytische Spülung der Anlage reaktive Sauerstoff Spezies In Vivo von anionischen Cerium-oxid-Nanopartikel

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes all liposomes of the ensemble to be identical. However, new experimental platforms able to observe liposomes at the single-particle level have made it possible to perform highly sophisticated and quantitative studies on protein-membrane interactions or drug carrier properties on individual liposomes, thus avoiding errors from ensemble averaging. Here we present a protocol for preparing, detecting, and analyzing single liposomes using a fluorescence-based microscopy assay, facilitating such single-particle measurements. The setup allows for imaging individual liposomes in a massive parallel manner and is employed to reveal intra-sample size and compositional inhomogeneities. Additionally, the protocol describes the advantages of studying liposomes at the single liposome level, the limitations of the assay, and the important features to be considered when modifying it to study other research questions.

This protocol describes the fabrication of liposomes and how these can be immobilized on a surface and imaged individually in a massive parallel manner using fluorescence microscopy. This allows for the quantification of the size and compositional inhomogeneity between single liposomes of the population.

Ein quantitativer Fluoreszenzmikroskopie-basierter Single Liposome-Assay zum Nachweis der kompositorischen Inhomogenität zwischen einzelnen Liposomen

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built high viscous injector, Lipidico, as part of the macromolecular crystallography (MX2) beamline to measure large numbers of small crystals at room temperature. The goal of this technique is to enable crystals to be grown/transferred to&#160;glass syringes to be used directly in the injector for serial crystallography data collection. The advantages of this injector include the ability to respond rapidly&#160;to changes in the flow rate without interruption of the stream. Several limitations for this high viscosity injector (HVI) exist which include a restriction on the allowed sample viscosities to &#62;10 Pa.s. Stream stability can also potentially be an issue depending on the specific properties of the sample. A detailed protocol for how to set up samples and operate the injector for serial crystallography measurements at the Australian synchrotron is presented here. The method demonstrates preparation of the sample, including the transfer of lysozyme crystals into a high viscous media (silicone grease), and the operation of the injector for data collection at MX2.

The goal of this protocol is to demonstrate how to prepare serial crystallography samples for data collection on a high viscous injector, Lipidico, recently commissioned at the Australian synchrotron.

Lipidico Injektionsprotokoll für serielle Kristallographiemessungen am australischen Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...