Wir danken dem Team des DKFZ Virus Produktion und Entwicklung ausgeben, insbesondere Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, und Mandy Roscher. Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) und der Helmholtz-Gemeinschaft im Rahmen des Deutschen Krebsforschungszentrums / Cancéropôle du Grand-Est gemeinsamen Programm in Applied Tumorvirologie unterstützt.

Beachten Sie, dass ein Labor mit Sicherheitsstufe 2 für die Produktion rekombinanter Parvoviren (recPV) ist erforderlich. Das Protokoll ist in zwei Hauptteile gegliedert. Der erste Teil (Herstellung von recPV durch Transfektion) benötigt, um die minimale Menge an recPVs, die als Inokulum dient im zweiten Teil des Protokolls (Herstellung von recPVs durch Infektion) zu erzeugen. Sobald eine kleine Menge von recPVs erzeugt wird, der erste Teil des Protokolls weggelassen werden kann, und die rekombinanten Parvovirus kann nur durch Infektion Bereitstellen des Gens, das für die Parvovirus-Kapsidproteine ​​durch die Adenovirus-Helferfunktionen (siehe unten) amplifiziert werden. 1. Herstellung von recPVs über Transfektion 1,1 Virale DNA-Transfektion Es ist möglich, jede produzierte DNA-Transfektionsverfahren in diesem Abschnitt des Protokolls entweder auf kationischen Lipiden oder Calciumphosphat basieren. Wir verwenden in der Regel Fugene HD Transfektionsreagenz. Um die Transfektionseffizienz kontrollieren, empfehlen wir die zusätzliche Transfektion Platte mit einem Plasmid, das Enhanced Green Fluorescent Protein (zB pEGFP-N1, Clontech). Die Transfektion wird als effizient und optimal für Virusproduktion, wenn mindestens 50% der Zellpopulation führt EGFP-positive 24 Stunden nach der Transfektion. <ol><li> 1 Tag vor der Transfektion Saatgut 2.000.000 HEK293T-Zellen in einer 10 cm-Platte, zu 50% Konfluenz zellulären am Tag der Transfektion erhalten. Kultivieren von Zellen in 10 ml Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit Zusatz von 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U pro ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> Bereiten Sie Virus-Making-Gemisch (Molverhältnis 01.02.01) in einem 1,5 ml-Tube: <ol class="lalpha"><li> 3 ug recPV Vektor, der das Transgen von Interesse (ei PhH-1-GFP-6). </li><li> 6 ug Vektor pCMV / VP 5 beherbergt die Parvoviruskapsid Gen-Einheit </li><li> 8 ug of Adenovirus-Helferplasmid abgeleiteten pXX6 7. </li></ol></li><li> Verdünnen Sie die Plasmide Mix mit serumfreiem Medium bis zu 850 ul (Endkonzentration von 20 ng / ul). </li><li> In 42,5 ul Fugene HD (2,5:1 Verhältnis ul Fugene: ug DNA). Berühren Sie nicht die Seite der Röhre beim Hinzufügen Fugene auf das Medium. </li><li> Vorsichtig vortexen für 5-10 Sekunden. </li><li> Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten. </li><li> Fügen Sie die Transfektion Mischungen zu den Zellen tropfenweise. Schütteln Sie die Platte vorsichtig zur gleichmäßigen Verteilung der gesamten Mischung. </li></ol> 1,2 Virusproduktion <ol><li> Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C mit 92% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 für 72 Stunden vor der Ernte. Während dieser Zeit Nachkommen Parvovirus Teilchen von den Parvovirus Plasmide gebildet ist. </li></ol> 1,3 Virusernte <ol><li> In einer Gewebekultur Kapuze, kratzen die Zellen in ihrem Medium absaugen und überführt die Suspension von der Platte in einen 15ml Kunststoffröhrchen. </li><li> Das Röhrchen bei 250 × g für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen 95% des Überstandes. </li><li> Vortex das Rohr leicht, um das Pellet in dem verbleibenden Überstand (etwa 0,5 ml) resuspendiert. </li><li> Frieren Sie das Rohr bei -80 ° C Es ist möglich, die Produktionskosten zu diesem Zeitpunkt zu stoppen oder mit dem Protokoll weiter. </li><li> Tauen Sie das Fahrwerk und bringen Sie es bei Raumtemperatur. </li><li> Frieren Sie die Suspension in einem Bad aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in warmes Wasser bei 37 ° C Beide Röhrchen kräftig für 15 Sekunden und wiederholen Sie die Frost-Tau-Zyklus noch zweimal. </li><li> Zentrifugieren bei 16.000 × g für 15 min bei 4 ° C </li><li> Sammeln Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Das Rohr in diesem Stadium enthält das rohe Virus-Präparat. </li><li> Fahren Sie mit dem Virus-Titration (siehe unten). Für die Durchführung recPV das GFP-Gen, sollte eine typische Produktion zu geben 1-3 × 10 7 viralen infektiösen Einheiten entsprechend etwa 1 -3 x 10 10 viralen Genoms, die Teilchen. </li></ol> 1,4 Virus Lagerung <ol><li> Für eine langfristige Lagerung einfrieren das Röhrchen mit dem rohen Extrakt Virus bei -80 ° C Es ist möglich, rohen Viruspräparation Extrakte als Inokulum in den zweiten Teil des Protokolls verwendet. </li></ol> 2. Herstellung von recPVs über Infektion Vor Beginn der Produktion über recPV Infektion, zu produzieren und zu reinigen Adenovirus 5 Tragen des Parvovirus VP-Gen (Ad-VP-Helfer, beschrieben in 5) nach Standard-Protokoll 8. Es ist auch notwendig, eine minimale Menge an recPVs das Transgen trägt von Interesse (zB, hergestellt durch Transfektion wie oben beschrieben) aufweisen. Im Folgenden beschreiben wir die Produktion in recPV 175 cm 2-Kolben (T175)-Format. Die weitere Verstärkung des Virusstocks auf diese Weise hergestellt werden in 10 mehrschichtigen CellSTACK Kulturkammern (Corning) durchgeführt werdenmit geringfügigen Anpassungen des Protokolls vorgeschlagen. 2,1 Infektion <ol><li> 1 Tag vor der Infektion, Platte 10 Millionen Zellen in einem NB324K T175-Kolben auf 60-80% Konfluenz zellulären am Tag der Infektion erhalten. Planen einen zweiten Kolben mit der gleichen Anzahl von Zellen als Kontrolle (nicht-infizierten Zellen). Jede T175 sollte 20 ml Minimum Essential Medium (MEM) als Endvolumen, mit 5% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100U pro ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin ergänzt wurden. </li><li> Am nächsten Morgen vorzubereiten Virus Gemisch in einem 2 ml-Kunststoffröhrchen Röhre, bestehend aus: <ol class="lalpha"><li> Ad-VP-Helfer-5 bei Multiplizität der Infektion (MOI, infektiösen Einheiten / Zelle) = 10 (entsprechend 1 × 10 8 infektiösen Einheiten); </li><li> recPVs bei MOI = 0,5 (entsprechend 5 x 10 6 infektiösen Einheiten). Füllen bis 1,5 ml mit MEM. </li></ol></li><li> Wenden Sie das gesamte Virus Mischung in einem der T175 Kolben. </li><li> Inkubieren Sie dieKolben für 2 Stunden bei 37 ° C, 92% Luftfeuchtigkeit, 5% CO 2 leichtem Schütteln alle 15 min. </li><li> Inkubieren für weitere 20-24 Stunden bei 37 ° C, 92% Luftfeuchtigkeit, 5% CO 2. </li><li> Ersetzen Sie das kulturelle Medium durch frisches Medium. </li></ol> 2,2 Virusproduktion Inkubieren Sie die Kolben bei 37 ° C bei 92% Luftfeuchtigkeit und 5% CO 2 für 48 Stunden. Als Hinweis auf eine effiziente virale Produktion, klare Anzeichen von Zytotoxizität in den Kolben mit viral infizierte Zellen beobachtet werden, beginnend von 36-48 Stunden nach der Infektion. 2,3 Virusernte <ol><li> In einer Gewebekultur Kapuze, absaugen und überweisen Sie den Mediumüberstand aus dem Kolben in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1,5 ml PBS. </li><li> Trypsinieren die Zellen mit 1,5 ml 0,25% EDTA-Trysin. Fügen Sie die Zellsuspension zum Medium entfernt. </li><li> Zentrifugation der Zellen und der Überstand bei 5.000 × g für 5 min bei Raumtemperaturtur. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> 1 ml TE-Puffer (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,7) auf das Zellpellet und vorsichtig vortexen das Rohr, um die Zellen zu resuspendieren. </li><li> Frieren Sie die Zellsuspension in einem Bad aus flüssigem Stickstoff und Auftauen in warmes Wasser bei 37 ° C Vortex das Rohr kräftig für 15 Sekunden und wiederholen Sie den Frost-Tau-Zyklus dreimal. </li><li> Behandeln der Zellsuspension mit 50 U / ml Benzonase Nuclease für 30 min bei 37 ° C, um die Zelle genomische und nicht-viraler DNAs verpackten verdauen. </li><li> Das Röhrchen bei 5.000 × g für 20 min bei 4 ° C </li><li> Sammeln Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Der Überstand auf dieser Stufe enthält das rohe Virus-Präparat. Typische Ausbeuten von recPV-GFP hergestellt nach diesem Protokoll sollte im Bereich von 1-10 x 10 8 viralen infektiösen Einheiten sein. </li></ol> 2,4 Virus Lagerung <ol><li> Bei kurzfristiger Lagerung (maximal 2 Monate), Store-Virus bei 4 ° C </li><li> Für LONg Langzeitlagerung (länger als 2 Monate), Filiale Virus bei -80 ° C </li></ol> 3. RecPV Reinigung <ol><li> Für die Reinigung von recPVs aus den Rohlysaten, empfehlen wir, einen diskontinuierlichen Gradienten Iodixanol nach Zolotukhin et al laufen. 9. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 5 ml rohe virale Extrakt (gewonnen aus der Produktion in fünf T175-Flaschen) für eine effiziente Reinigung Virus. </li></ol> 4. Rekombinanten Parvovirus-Titration <ol><li> Führen recPV Titration wie in El-Andaloussi et al. 5 </li></ol> 5. Qualitätskontrollen <ol><li> Verwendung des Protokolls in El-Andaloussi et al. 5 beschrieben auf das Vorhandensein von unerwünschten replikationskompetenten Viren (NA) für die Durchführung Parvovirus Plaque-Assay in NB324K Indikator-Zellen zu überprüfen. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für recPVs production durch Transfektion in Gegenwart oder Abwesenheit von Adenovirus genomische Elemente in 3 gezeigt. Die Zellen wurden mit pCMV / VP (Plasmid, welches das Gen für den VP-Parvovirus-Kapsidproteine) zusammen mit PhH-1-GFP (a recPV beherbergen das GFP-Gen) oder PHH-1-Luciferase (a recPV beherbergen die Glühwürmchen-Luciferase-Gen) transfiziert , mit (+ pXX6) oder ohne (-pXX6) die pXX6 Plasmid (welche das Adenovirus-E2A-, E4 (orf6) und VA-RNA-Gene). Gleiche Volumen von Zellextrakten wurden verwendet, um Zellen und NB324K GFP-Transduktion oder Luciferase-Assays durchgeführt wurden wie in El-Andaloussi et al. 5. Eine deutliche Zunahme der recPVs Produktion wurde in Gegenwart von pXX6 mit zunehmender Produktion von 0,3 GFP transductional Einheiten (TU) / Zelle, erhalten nach herkömmlichen Protokollen auf ca. 5 TU / Zelle erhalten nach unserer Methode (Abb. 3a, b). Ein signifikanter Anstieg (etwa 24-fach) recPV Produktiam wurde auch im Falle von PHH-1-Luciferase (3C) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass das genetische Material in pXX6 enthalten können Parvovirus Produktion zu steigern ist. Ein repräsentatives Beispiel für recPVs Produktion über Infektion wird in Abbildung 4 dargestellt. NB324K Zellen wurden mit verschiedenen recPVs (wie in der Abbildung angegeben) und Ad-VP-Helfer (beherbergt das Gen, das für die PV-VP Kapsidproteine) co-infiziert. Ad-VP-Helfer weiter verbessert recPV Erzeugung bis zu&gt; 70 TU pro ausgesäte Zelle (4A), ohne das Auftreten von unerwünschten replikationsfähige virale Partikel (4B). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> Abbildung 1. Vektoren auf Basis von autonomen Parvoviren. (A) Oben: Das Transgen ersetzt einen Teil der VP-kodierenden Gene und steht unter der Kontrolle der viralen Promotor P38. Die Gene für NS1 / 2 sind neugewartet und die Expression durch den viralen Promotor gesteuert P4. Die Vektor-Genom durch die parvoviralen ITRs, die cis-wirkende Elemente, die für die Replikation und Verpackung des rekombinanten Genom benötigt werden, enthalten flankiert. Unten: Ein Plasmid, das die VP-Gen unter entweder einem heterologen (zB CMV.) Oder autologe (zB P38.) Promotor (Px), wird in trans während der rekombinanten Produktion Parvovirus zugeführt, um für die Unterbrechung der strukturellen Gene ausgleichen in dem rekombinanten Genom. ITR, Inverted Terminal Repeat. Abbildung aus 4 angepasst. (B) Schematische Darstellung des klassischen Protokoll für die Herstellung von recPVs verwendet. HEK293T-Zellen transient mit viraler DNA (Vektor und Helferplasmiden) und nach drei Tagen transfiziert werden die Zellen gesammelt und Viren geerntet. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> Abbildung 2. Herstellung von mit der recPVsHilfe des Ad-VP. (A) Schematische Karten von recPV und Ad-VP Genome. Die recPV enthält eine heterologe Transgen, die in der VP Region ersetzt. Die Ad-VP birgt das Parvovirus VP-Gen. (B) Schematische Darstellung des Protokolls in diesem Manuskript beschrieben. NB324K Zellen werden mit recPV und Ad-VP-Viren infiziert. Nach drei Tagen werden die Zellen geerntet und recPV Teilchen aus dem Zellysat gewonnen. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Stimulation der Produktion von recPV Adenovirus-basierte Plasmide pXX6. HEK293T-Zellen in 10-cm-Schalen ausgesät wurden mit pCMV / VP in Kombination mit PhH-1-GFP (A und B) oder PHH-1-Luciferase (C) transfiziert, um recPVs erzeugen. Gleichzeitig wurden die Zellen mit den Adenovirus-abgeleiteten Helferplasmiden pXX6 oder nicht, wie angegeben co-transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und durch drei Gefrier-und Auftau-Zyklen lysiert. Gleiche Volumina von CRUDE-Virus Extrakte wurden angewandt, um Indikatorzellen NBK, und Transduktion Assays wurden durchgeführt. (A) Repräsentative Aufnahmen, welche GFP-positiven Zellen im konfluenten Monolayer NB324K. (B) Quantifizierung der GFP-Transduktion Transduktion in Assays (TE) pro seeded Zelle exprimiert . (C) Quantifizierung der Luciferase-Aktivität als die relativen Luciferase-Einheiten (RLU) ausgedrückt. Die Luciferase-Assay wurde wie in El-Andaloussi et al. 5. Säulen repräsentieren Mittelwerte aus drei Wiederholungen mit Standardabweichung Bars. Anzahl auf der + pXX6 Spalte in (B und C) zeigt die fachen Anstieg der recPV Virustiter, in Gegenwart von pXX6 versus ohne erhalten. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Stimulation der Produktion recPV mittels rekombinanter Ad-VP Helfervirus. (A) NB324K Zellen waren InfektionenTed mit gereinigtem Ad-VP Helfer-Virus bei einer MOI von 10 (Ad-X-Einheit / Zelle, titriert mit Adeno-X Rapid-Titer Kit), und dann Superinfektion mit einer der folgenden rekombinanten Parvovirus-Chi-HH-1-EGFP 11 (0,1 TU / cell) oder H-1-GFP (0,5 TU / cell) 5. Einen Tag nach der Infektion wurde das Medium gewechselt und zwei Tage später wurden die Zellen gesammelt und lysiert über drei Gefrier-und-Tau-Zyklen. Rohzellextrakte wurden verwendet, um Virustiter durch Transduktion Assay zu bestimmen nach El-Andaloussi et al. 5. TU, Transduktion Einheit. (B) virale Chargen in der Gegenwart oder Abwesenheit von Ad-VP hergestellt wurden auf ihren Gehalt von Replikations-kompetenten Viruspartikel (NA) durch Plaque-Assay auf NB324K Indikator-Zellen analysiert.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Wir haben gezeigt, dass recPV Produktion durch die Anwesenheit von adenoviralen Genom-Elemente erhöht werden kann. Wir haben die recPV Ausbeuten von mehr als 10-fach (0,3 bis 5 TU / Zelle) erhöht, indem Adenovirus genomische Element über Transfektion und durch mehr als 100-fach Co-Infizieren der Zellen mit Ad-VP-Helfer in Kombination mit dem in recPV Vergleich zu herkömmlichen Protokollen. Die hier beschriebene Protokoll kann durch die Bestimmung der am besten geeigneten Zeitpunkt für die Lieferung der Adenovirus-G...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Fötale Rinderserum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X Schnelle Titer Kit </td><td> Clontech </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Nagetier-Parvoviren (PV) wie Ratten H-1PV und MVM, sind kleine ikosaedrische, einzelsträngige, DNA-Viren. Das Genom enthält zwei Promotoren P4 und P38, die die Expression von nicht-strukturellen (NS1 und NS2) und Kapsid-Proteine ​​(VP1 und VP2), die jeweils 1 zu regulieren. Sie ziehen hohe Zinsen als Antikrebsmittel für ihre onkolytischen und oncosuppressive Fähigkeiten, aber dabei nicht-pathogen für den Menschen 2. NS1 ist das zentrale viraler Cytotoxizität 3. Zur weiteren Verbesserung ihrer natürlichen antineoplastischen Aktivitäten wurden Derivate von diesen Vektoren durch Ersetzen des Gens, das für die Kapsidproteine ​​mit einem therapeutischen Transgens (zB ein zytotoxisches Polypeptid, Cytokin, Chemokin, Tumorsuppressor-Gen usw.) 4 erzeugt wurde. Die rekombinanten Parvoviren (recPVs) Vektor behält die NS1 / 2 kodierenden Sequenzen und die PV-Genom Telomere, die notwendig für die virale DNA-Amplifikation und Verpackung sind. Herstellung vonrecPVs nur, wenn die Produzentenzellen (in der Regel HEK293T), durch Co-Transfektion der Zellen mit einem zweiten Vektor (pCMV-VP) Exprimieren des Gens, das für die VP-Proteine ​​(Abb. 1) 4. Die recPV Vektoren auf diese Weise erzeugt werden, sind Replikation defekt. Obwohl recPVs erwies sich verbesserte oncotoxic Aktivitäten in Bezug auf die elterliche Viren, von denen sie erzeugt worden sein besitzen, bleibt ihre Produktion eine große Herausforderung und stark behindert die Verwendung dieser Mittel im Anti-Krebs-klinische Anwendungen. Wir fanden, dass die Einführung eines Ad-5-abgeleiteten Vektor, der das E2a, E4 (orf6) und die VA-RNA-Gene (zB pXX6 Plasmid) in HEK293T verbessert die Herstellung von recPVs um mehr als 10-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet. Basierend auf dieser Erkenntnis, haben wir eine neue Ad-VP-Helfer, dass die genomische adenoviralen Elemente notwendig, recPVs Produktion zu verbessern sowie die parvovir enthält gebautuns VP-Einheit 5-Gen. Die Verwendung von Ad-VP-Helfer-, ermöglicht die Herstellung von rec-PV unter Verwendung eines Protokolls, die vollständig von den viralen Infektion Schritte (im Gegensatz zu Plasmid-Transfektion gegenüberliegenden), die Ermöglichung der Verwendung von Zelllinien, die schwer zu transfizieren (zB NB324K) ( Abb.. 2). Wir stellen eine Methode verbessert das groß die Menge des produzierten rekombinanten Virus, wodurch sowohl die Produktionszeiten und-kosten, ohne dass die Qualität des Endproduktes 5. Darüber hinaus ist die großtechnische Herstellung von recPV (in Suspension Zellen und Bioreaktoren) nun denkbar.

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Hier beschreiben wir ein Protokoll nur auf Zellinfektion, was die Effizienz von rekombinanten Parvovirus-Produktion um mehr als 100-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet verbessert bezogen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung einer neuartigen Adenovirus-5-basiertes Hilfsprogramm mit dem Parvovirus VP Transkriptionseinheit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K Aufrufe.  German Cancer Research Center (DKFZ). Hier beschreiben wir ein Protokoll nur auf Zellinfektion, was die Effizienz von rekombinanten Parvovirus-Produktion um mehr als 100-fach im Vergleich zu anderen Protokolle verwendet verbessert bezogen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung einer neuartigen Adenovirus-5-basiertes Hilfsprogramm mit dem Parvovirus VP Transkriptionseinheit (Ad-VP).

Serie: Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

Die Schätzung Virus Produktionsraten in aquatischen Systemen

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

Erzeugung von rekombinanten Arenavirus für die Impfstoffentwicklung in FDA-zugelassenen Vero-Zellen

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Erkennung und Entfernung von Nuklease Kontamination während der Reinigung von rekombinanten Prototyp schaumig Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.