Siehe Abbildung 1 für eine Illustration der Zusammenfassung der folgenden Protokoll. Sicherheitshinweis: Alle Materialien, die in Kontakt mit montiertem viralen Partikel wurde muss mit Virkon Lösung oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel desinfiziert werden. 1. Herstellung von Plasmid-DNA Aktien (~ 2 Tage) <ol><li> Die folgenden Plasmide sind 1 erforderlich: <ul><li> PRV1 - mit dem AAV2 Rep und Cap-Sequenzen </li><li> PH21 - mit dem AAV1 Rep und Cap-Sequenzen </li><li> pFdelta6 - Adenovirus-Helfer-Plasmid </li><li> AAV-Plasmid enthaltend das rekombinante Expressionskassette AAV2 Verpackung Signale (inverted terminal repeats, ITR) flankiert </li></ul></li><li> Während pFdelta6 in Stbl2 kompetente Zellen gezüchtet werden sollten, um partielle Deletion zu verhindern, können PRV1 und PH21 in DH5alpha kompetente Zellen gezüchtet werden. AAV-Plasmiden können in Stbl2 Zellen gezüchtet werden, wenn partielle Deletionen in DH5alpha Zellen vorkommen. </li><li>Plasmid-DNA von hoher Qualität und frei von RNA Verunreinigungen sein. Plasmide können für Integrität mit folgenden Übersichten zu sehen sein: <ul><li> PRV1 - Verdau mit XbaI zu geben Bands von 7,5 kb und 3,8 kb </li><li> PH21 - Verdau mit EcoRI Bands von 4,5 kb, 2,8 kb und 0,2 kb geben </li><li> pFdelta6 - Verdau mit HindIII Bands von 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb und 1,5 kb geben </li></ul></li></ol> 2. Vorbereitung von humanen embryonalen Nierenzellen 293 (HEK293) Zellen zur Transfektion (2 bis 3 Tage) <ol><li> Platte zwei 80% konfluente 150 cm 2 Flaschen HEK293-Zellen in fünf 15 cm Durchmesser Nunc Gewebekulturschalen. Die Zellen sind 70 - 80% konfluent vor der Transfektion (etwa 48 Stunden nach dem Ausplattieren). Kultur-Zellen in Standard-Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit niedrigen Glukose mit 10% fötalem Kälberserum und 100 U / ml Penicillin / 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> 3 Stunden vor der Transfektion entfernen DMEM und ersetzen mit Iscove&#39;S modifiziertes Dulbecco Medium (IMDM) mit 5% fötalem Kälberserum. </li></ol> 3. Die Transfektion der viralen Plasmiden (~ 1 Stunde für die Transfektion, 3 Tage Inkubation) <ol><li> Bereiten Sie die folgenden für eine einzelne Charge (5 x 15 cm Zellkulturplatten) des Virus: <ul><li> 62,5 pg AAV-Plasmid </li><li> 125 &amp;mgr; g pFdelta6 </li><li> 31,25 pg PRV1 </li><li> 31,25 pg PH21 </li><li> 1650 ul 2,5 M CaCl 2 </li><li> 12 ml dH 2 O </li></ul></li><li> In der Klasse 2 Gewebekultur Haube Sterilfilter die Transfektion Mischung in eine 50 ml Tube. </li><li> Während Vortexen der Lösung schnell hinzufügen 13 ml 2 x HEPES-gepufferter Salzlösung (pH 7,05). Ersetzen Deckel 50 ml Tube und weiter Wirbel für 15 Sekunden. Lassen Sie für 1 Minute 45 Sekunden stehen, sollten sich ein feiner weißer Niederschlag bilden. </li><li> Vorsichtig mit 5 ml der Transfektion Lösung für jede 15 cm Gewebe Kulturschale. Swirl Platten zu mischen und zum Inkubator. </li><li> 16 Stunden nach der Transfektion entfernen IMDM-Medium und ersetzen mit DMEM. </li></ol> 4. Lyse der Zellen und die Ernte von rAAVs (2 Stunden) <ol><li> 72 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie Medien aus Zellkultur-Platten und entsorgen. Alle Abfälle sollten mit Virkon Lösung oder einem anderen geeigneten Desinfektionsmittel behandelt werden. </li><li> Vorsichtig waschen die Zellen in warmem 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4). </li><li> 25 ml warmem PBS zu jeder Platte und entfernen Sie vorsichtig Zellen mit einem Zellschaber. Sammeln Suspension in 50 ml Tuben. </li><li> Pellet-Zellen bei 800 xg für 10 Minuten. </li><li> Überstand verwerfen und Pellet in 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, verwenden Sie 10 ml pro Gewebekulturplatte. Aufgeteilt in zwei 50 ml-Tuben. </li><li> Bereiten Sie eine frische Lösung von 10% Natriumdeoxycholat in dH 2 O. Add 1,25 ml dieser zu jedem Röhrchen für eine Endkonzentration von 0,5%. Add Benzonase Nuklease um eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro Milliliter. Mix Rohr gründlich. </li><li&gt; bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Entfernen Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 3000 xg für 15 Minuten. Transfer zum frischen 50 ml Tube, sicherzustellen, dass alle Zelltrümmer entfernt wurde, um zu verhindern Sperrung von Heparin-Säulen (siehe Schritt 5). In diesem Stadium können die Proben bei -20 ° C, bevor Sie fortfahren werden. Wir haben Proben für mehrere Wochen bei -20 ° C ohne eine Reduktion der Infektiosität gespeichert. </li></ol> 5. Heparin Säule Reinigung von rAAVs (2 bis 3 Stunden) <ol><li> Setup-HiTrap Heparin-Spalten mit einer Schlauchpumpe, so dass Lösungen fließen durch die Säule mit 1 ml pro Minute für Schritte von 5,2 bis 5,4. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Heparin-Säule eingeführt werden. </li><li> Äquilibrieren der Säule mit 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Übernehmen 50 ml Virus-Lösung in die Spalte und lassen ungehindert durchfließen. </li><li> Wash Säule mit 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Mit einem 5-ml-Spritze weiterhin die Spalte w waschenit 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, mit 1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, gefolgt. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. </li><li> Mit 5 ml Spritzen und sanften Druck eluieren das Virus aus der Säule durch die Anwendung: <ul><li> 1,5 ml 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 1,5 ml 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> Sammeln Sie diese in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li></ul></li></ol> 6. Konzentration und Sterilfiltration von rAAVs (1 Stunde) <ol><li> Konzentrieren Vektor mit Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Einheiten mit einem 100.000 Molekulargewichtsschnitt. Legen Sie 4 ml Eluat in den Konzentrator und Zentrifuge bei 2000 xg für 2 Minuten (bei Raumtemperatur). Discard Durchfluss und reload-Konzentrator mit den restlichen Virus-Lösung und wiederholen Zentrifugation. Die konzentrierte Volumen sollte ca. 250 ul werden. Wenn konzentrierte Volumen ist deutlich mehr als diese, verwerfen den Fluss turch und weiterhin in 1 Minute Schritte Zentrifuge bis beläuft sich auf rund 250 ul. </li><li> Add 250 ul PBS, um Viren zu einem Endvolumen von 500 ul und entfernen von Konzentrator. </li><li> Filter-Vektor durch eine 13 mm Durchmesser 0,2 &amp;mgr; Spritzenfilter. Vector sollten aliquotiert und bei -80 ° C gelagert werden, bis sie benötigt. </li></ol> 7. Titrierung von viralen Aktien (3 Tage) Dies erfordert ein Promotor, der aktiv in HEK293-Zellen Fahren ein Reporter-Gen oder ein immuncytochemisch nachweisbar Genprodukt ist. Bei der Herstellung eines Vektors, die nicht kompatibel mit HEK293-Zellen anderer Zelllinien oder primäre Zellkulturen verwendet werden kann. <ol><li> Bereiten 18 Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen oder 18 Vertiefungen Nunc Kammer gleitet durch Impfen HEK293-Zellen, so dass sie 40 sind - 50% konfluent. Für die Titration von Cre-abhängigen rAAVs Verwendung HEK293-Zellen, die stabil exprimieren die Cre-Rekombinase 2. </li><li> Infect jede Vertiefung mit serieller dilutions des AAV-Vektors (Abb. 2A). Verwenden Sie 3 Vertiefungen pro Verdünnung. Wir routinemäßig add Virus direkt in jede Vertiefung. </li><li> Nach 72 Stunden fix HEK293-Zellen durch Zugabe des gleichen Volumens von 4% Paraformaldehyd (PFA) bis mittel (was eine Endkonzentration von 2% PFA) für 10 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wash Zelle dreimal in PBS, in dH 2 O und Deckglas spülen. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der transduzierten Zellen aus den drei Brunnen, die den höchsten Verdünnungsfaktor haben, aber immer noch enthalten infizierten Zellen, den Durchschnitt dieser und multiplizieren mit dem Verdünnungsfaktor, um die Anzahl der infektiösen Einheiten pro Mikroliter (Abb. 2B) zu geben. </li></ol> 8. Erwartete Ergebnisse HEK293-Zellen transduziert mit einem Virus kodiert Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) in Abbildung 2B dargestellt sind. Wir in der Regel eine konsistente Titer von etwa 6 x 10 6 infektiöse Partikel pro Mikroliter. Wir verwenden routinemäßig diese Vektoren für stereotaktische injektion in die Erwachsenenwelt Nagetier Gehirn. Dies bietet eine leistungsstarke Technik für Region-spezifische Genexpression 2. Um diese Region Spezifität mit Zell-Typ selektive Genexpression spritzen wir die Rekombinase Cre-abhängigen rAAVs in Zielregionen der Cre-transgenen Mäusen 2 kombinieren. Abbildung 2C-E zeigt Beispiele für stereotaktische Injektion von Cre-abhängigen rAAVs Kodierung eGFP in verschiedenen Hirnregionen der Erwachsenenbildung Parvalbumin-Cre transgenen Mäusen 3. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Protokolls für rAAV Produktion. . 1) HEK293-Zellen sind vernickelt und wuchs auf 70 bis 80% Konfluenz. 2). AAV und Helferplasmide sind bereit und in HEK293-Zellen transfiziert. 3). Medium ist wieder DMEM 16 Stunden nach der Transfektion verändert und HEK293-Zellen sind für weitere 56 Stunden kultiviert. 4). HEK293-Zellen werden geerntet und lysiert. rAAV-Vektoren sind aus Zelltrümmer durch c getrenntentrifugation. 5). Virale Partikel werden durch Heparin Spalten vor Konzentration und Sterilisation gereinigt. 6). HEK293-Zellen werden auf 24-Well-Platten gewachsen und infizieren mit seriellen Verdünnungen des AAV-Vektors auf die Anzahl der infektiösen Einheiten zu bestimmen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> Abbildung 2. Titrierung und in vivo Anwendung der rAAV1 / 2. (A) Setup von HEK293-Zellen für die Messung virale Titer. HEK293-Zellen mit seriellen Verdünnungen von rAAVs transduziert. C, nicht infizierten Kontrolle; N, 1 ul unverdünnter virale Lager. (B) HEK293-Zellen mit rAAVs Ausdruck eGFP infiziert. (CE) Viral eGFP-Expression beschränkt sich auf Cre-exprimierenden Neuronen in verschiedenen Zielregionen Parvalbumin-Cre transgenen Mäusen nach stereotaktische Injektion von Cre-activated rAAVs. Beispiele Bilder zeigen GFP-Immunreaktivität in (C) der retikulären Thalamus und Globus pallidus (D) Gyrus dentatus und (E) der CA1 Region des Hippocampus. DG, dentate Gyrus; RT, retikuläre Thalamuskern; GP, globus pallidus. Maßstabsbalken: B, 500 pm, C, 100 pm, D, 100 pm, E, 500 um.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

rAAV-Vektoren sind immer wertvoller für in vivo Studien an Tieren. Hier haben wir ein einfaches und kostengünstiges Protokoll zur Herstellung rAAVs beschrieben, die möglicherweise die breite Anwendung dieses nützlichen Vektor durch die Vermeidung von teuren Outsourcing-Virus-Produktion für Unternehmen zu erleichtern. Das Protokoll (basiert auf Referenz 1) beschreibt die Herstellung von Chimären rAAV1 / 2 Vektoren, die Kapsidproteine ​​von beiden Eltern-Serotypen bei gleicher Übersetzungen 4. Die Reinigung der rAAV-Vektoren durch die Bindung an Heparin Säulen stützt sich auf die Expression von AAV2 Kapsidproteine, kann aber mit den Serotypen außer AAV1 hier skizzierten kombiniert werden. Darüber hinaus hat AAV6 wurde berichtet, dass an Heparin zu binden, allerdings mit einem geringeren Affinität, und könnte mit Heparin Spalten mit diesem Verfahren 5,6 gereinigt werden. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass auch andere Serotypen werden verschiedene Konzentrationen von NaCl für Heparin Säulenelution 5,7 erfordern. Packaging rAAV Genome konnte gezeigt werden, zwischen 4,1 und 4,9 kb optimal mit einem deutlichen Rückgang in der Verpackung Wirkungsgrad von bis zu 5,2 kb 8. Diese Verpackung Grenze kann als der größte Nachteil des rAAV-System, da Zelltyp-spezifische Regulation der Transgenexpression ist in der Regel von großen cis wirkende Elemente, die nicht in den kleinen AAV-Partikeln untergebracht erreicht werden kann. Zur Überwindung niedrige Titer Chargen, wie jene, die sich aus dem Versuch, Paket Gene, die in der Nähe des AAV Verpackung beschränken wir die Kombination von getrennten viralen Chargen konzentriert, um 250 ul in eine 500 ul Charge werden, anstatt das Hinzufügen PBS wie in Schritt 6.3 beschrieben werden. Zuverlässige Zelltyp-spezifische Transduktion durch die Kombination Cre-Fahrer Mäusen und bedingte rAAV-Kassetten (siehe unten) zu vermeiden, Dehnen der Verpackung Grenze erreicht werden. Zu beachten ist, während dieses Protokoll versucht, easy-to-folgen Sie den Anweisungen auf der Produktion von qualitativ t lieferniter rAAV, bedarf es der Anwesenheit von AAV2 Kapsidprotein-Reste für die Reinigung von Heparin-Affinitätschromatographie. Serotypen außer AAV2 muss gereinigt mit alternativen Verfahren 9 sein. Ein Vorteil des Heparin-Säule Reinigung ist es geglaubt wird, um AAV-Vektoren, die größer Infektiosität als diejenigen unter Verwendung eines Cäsiumchloridgradienten 10 haben zu produzieren. Es gibt jedoch auch einige Nachteile dieser Methode. Zum Beispiel können andere Proteine, die Heparin-Bindung auch in der gereinigten viralen Lager. Während des Tropismus von Heparin-gereinigten Vektoren, die durch den Vektor-Titer 10, unser Ansatz, gezielt entweder erregend 20 oder hemmende Neuronen (Abb. 2) beeinflusst werden kann beschäftigt Cre-induzierte Aktivierung von AAV-vermittelte Transgenexpression und Titer-unabhängig. Eine Alternative zu Heparin-Säule Reinigung ist die Verwendung eines Iodixanol Dichtegradienten, die eine höhere Virustiter und reiner Vorbereitung als die Verwendung von produzierteinen Cäsiumchloridgradienten 10. Diese Methode kann auch mit Heparin-Säule Reinigung kombiniert werden, um einen Vektor, der größer als 99% reinem 11 ist zu produzieren. Daher erfordert sorgfältige Abwägung von den einzelnen Gruppen, welche virale Reinigungsverfahren ist am besten für ihre jeweilige nachgeschaltete Antrag. Das häufigste Problem mit diesem Protokoll ist gering virale Titer. Nach unserer Erfahrung kann dies in der Regel zu geringe Transfektionseffizienz oder die Elution des Virus aus dem Heparin-Säulen zurückgeführt werden. Alle Transfektion Materialien sollten bei Raumtemperatur vor der Transfektion werden, und testen Transfektionen durchgeführt werden, um die optimalen Bedingungen in jedem Labor zu finden. Andere Methoden der Transfektion, wie Lipofektamin sind hocheffiziente, kann aber teuer werden. Darüber hinaus ist die Konzentration und pH-Wert des Heparin-Säule Elutionslösungen von entscheidender Bedeutung für eine vollständige Elution der Virionen von Heparin Spalten ohne C.ut Schaden. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Verpackung Zellen müssen gut haften an der Oberfläche des Gewebes Kulturschalen. Wenn die Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt zu lösen während des Verfahrens ist es ratsam, das Experiment und Abtauung eine neue Flasche von Zellen zu beenden. Räumlich-zeitliche Kontrolle der Transgenexpression in Nagetieren ist leicht durch genaue anatomische Ausrichtung und das Entwicklungsstadium der Tiere erreicht. Effiziente AAV-vermittelte Gentransfer in utero 12,13 gezeigt. Im erwachsenen Gehirn, kann die Fläche mit rAAV-Partikel nach stereotaktische Injektion infiziert von sehr kleinen Zielregionen, um viel größere Gebiete, die nicht nur durch Änderungen in der virale Titer, sondern auch durch die Veränderung der Injektion Parameter eingestellt werden. Dazu gehören das Volumen und die Geschwindigkeit der Injektionen und die Einbeziehung der Polyol-Mannit mit der Virussuspension 14. Mannitol kann auch zur Infektion von einer Vielzahl von Geweben nach systemischer rAAV Injektion 15 erhöhen &lt;/ Sup&gt;. Die Verpackung Kapazität von rAAV (ca. 4,7 kb) ist wahrscheinlich der limitierende Faktor in Bezug auf die Gene, die aus dieser viralen Vektoren ausgedrückt werden kann. Allerdings haben neuere Studien gezeigt, dass diese teilweise durch Spaltung größere Gene oder Expressionskassetten werden in separate rAAV-Vektoren zu überwinden und die Einführung eines Bridging-Sequenz, die Einleitung der Genexpression bei Virionen der gleichen Zelle 16 zu infizieren. Expression von Genen durch rAAV-Vektoren durchgeführt können auch stark mit sich selbst kostenlos rAAV-Vektoren 17 erhöht werden. Stereotaktische Injektion von rAAV-Vektoren bietet eine schnelle, kostengünstige und leistungsfähige Methode zur Induktion der Genexpression in einer Region spezifische Art und Weise. In Kombination mit der 2. Generation der RNA-Interferenz-Strategien 18 rAAVs können auch für regional spezifische Gen-knock down verwendet werden. rAAVs mit Cre-transgenen Mäusen oder Zelltyp-spezifische Promotoren kombiniert werden, um Leistungs-und Zell-Typ zu erreichen-Spezifische Gen-Expression, erlauben genetische Manipulationen mit hoher räumlicher Auflösung 2,19-21, während Montage rAAVs z. B. mit der Tet-System fügt zeitliche Kontrolle über Virus-vermittelten Genexpression 22,23. Diese Beispiele zeigen die enorme kombinatorische Potential dieser Vektoren und sagen eine rasche Zunahme der rAAV-basierte Studien über die Jahre zu kommen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Amicon Ultra Filterzentrifugen </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100.000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase-Nuclease </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco s modifiziertem Eagle Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> Supplement mit 10% FCS und 10 Einheiten / ml penicillin/100 ug / ml Streptomycin </td></tr><tr><td> HEK293-Zellen </td><td> American Type Culture Collection </td><td> CRL-1573 </td><td> Verwenden Sie bei dem Durchgang weniger als 30 </td></tr><tr><td> HEPES gepufferte Salzlösung </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap Heparin Patrone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove-modifiziertes Dulbecco-Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> Supplement mit 5% FCS </td></tr><tr><td> Natriumdesoxycholat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Machen Sie frische Lösung für jede Charge </td></tr><tr><td> 15 cm Tissue Kulturschalen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 kompetenten Zellen </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon Lösung </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Lassen Sie zu desinfizieren Nacht vor der Entsorgung zu entwässern </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifischen Reagenzien für Protokoll erforderlich

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

In den letzten Jahren rekombinante Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) sind zunehmend wertvoll für in vivo Studien an Tieren und sind auch derzeit in klinischen Studien am Menschen getestet. Wildtyp-AAV ist ein nicht-pathogenen Mitglied der Parvoviridae Familie und Natur replikationsdefizient. Die breite Transduktion Profil, geringe Immunantwort sowie die starke und anhaltende Transgenexpression mit diesen Vektoren erzielt hat sie ein beliebtes und vielseitiges Werkzeug für die in vitro und in vivo Gentransfer. rAAVs können einfach und billig im Labor hergestellt und auf ihre günstige Sicherheitsprofil basieren, sind in der Regel eine geringe Sicherheit Klassifizierung gegeben. Hier beschreiben wir eine Methode für die Produktion und Titrierung von chimären rAAVs mit dem Kapsid-Proteine ​​sowohl AAV1 und AAV2. Der Einsatz dieser sogenannten Chimären-Vektoren kombiniert die Vorteile beider Eltern Serotypen wie hohe Titer Aktien (AAV1) und Reinigungdurch Affinitätschromatographie (AAV2). Diese AAV-Serotypen sind die besten von allen AAV-Serotypen untersucht und individuell über ein breites Infektiosität Muster. Die chimären Vektoren hier beschriebene sollte die infektiösen Eigenschaften der AAV1 und AAV2 und kann somit erwartet, dass eine Vielzahl von Geweben, einschließlich Neuronen, Skelettmuskel, Bauchspeicheldrüse, Nieren ua zu infizieren. Die hier beschriebene Methode nutzt Heparin-Säule Reinigung, glaubte eine Methode, um eine höhere Virustiter und sauberer Viruspräparats als andere Reinigungsmethoden, wie Zentrifugation durch ein Cäsiumchloridgradienten geben. Zusätzlich beschreiben wir, wie diese Vektoren schnell und einfach titriert werden, um genaue Lektüre der Anzahl der infektiösen Partikel produziert zu geben.

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Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAVs) Vektoren sind immer wertvoll für<em&gt; In vivo</em&gt; Studien an Tieren. Wir beschreiben, wie rAAVs im Labor hergestellt werden können und wie diese Vektoren können titriert, um eine genaue Ablesung der Anzahl der infektiösen Partikel produziert zu geben.

Produktion und Titrierung von rekombinanten Adeno-assoziierte virale Vektoren

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.4K Aufrufe.  University of Aberdeen. Rekombinante Adeno-assoziierte Virus (rAAVs) Vektoren sind immer wertvoll für In vivo Studien an Tieren. Wir beschreiben, wie rAAVs im Labor hergestellt werden können und wie diese Vektoren können titriert, um eine genaue Ablesung der Anzahl der infektiösen Partikel produziert zu geben.

Serie: Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolierung von Fidelity Varianten von RNA-Viren und Charakterisierung von Virus-Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Herstellung viraler DNA aus Nukleokapside

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Effiziente rekombinanten Parvovirus Produktion mit Hilfe von Adenovirus-abgeleiteten Systemen

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Zergliedern Angeborene Immunsystem Signaling in Viral Evasion von Zytokin-Produktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Die Entwicklung der Lyophilisierte Loop-mediated Isothermal Amplification Reagenzien zum Nachweis von<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Sampling Verfahren zum Nachweis von humanem Norovirus auf Oberflächen

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...