Diese Studie wurde von einem NSF Career Grant (MCB0954016) und DOE Bioenergy Research Grant (DEFG0208ER64694) unterstützt.

1. Zellkultur (Abbildung 1) <ol><li> Wachsen Zellen in Minimalmedium mit Spurenelemente, Salze, Vitamine und spezifisch markierten Kohlenstoffsubstrate die am besten für Weges Untersuchung. Verwenden Sie entweder Schüttelkolben oder Bioreaktoren für die Zellkultur. Organische Nährstoffe, wie Hefeextrakt, kann mit der Messung von Aminosäure-Kennzeichnung beeinträchtigen und somit nicht anwesend sein kann in dem Kulturmedium. </li><li> Monitor Zellwachstum durch die optische Dichte der Kultur bei einer optimalen Wellenlänge (z. B. OD 730 für Cyanothece 51142) mit einem UV / Vis-Spektralphotometer. </li><li> Die Zellen können zunächst in einem nicht-markierten Medium kultiviert werden. Die Mitte-log Wachstumsphase Zellen werden bevorzugt, um für die Impfung (3% (v / v) Vol. Impfung ratio) der markierten Medium verwendet werden. Die markierten Kultur sollte subkultiviert (3% v / v Impfung ratio) in der gleichen Bezeichnung Medium, um die Einführung von nicht-markierten Kohlenstoffs aus dem ersten Impfstoff zu vermeiden. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Aminosäure-Extraktion <ol><li> Ernte-sub-kultivierten Zellen (10 mL) in der Mitte-log Wachstumsphase durch Zentrifugation (10 min, 8000 × g). </li><li> Das Pellet in 1,5 ml 6M HCl und überträgt es auf ein klares Glas, Schraubverschluss GC Fläschchen. Verschließen Sie die Fläschchen und legen Sie sie in einem 100 ° C im Ofen für 24 Stunden, um die Biomasse Proteine ​​in Aminosäuren hydrolysieren. Die Hydrolyse von Biomasse-Pellets können Ausbeute 16 der 20 Standard-Aminosäuren (Abbildung 2) 5. Cystein und Tryptophan abgebaut werden, und Glutamin und Asparagin umgewandelt werden, um Glutamat und Aspartat, bzw.. </li><li> Centrifuge die Aminosäure-Lösung bei 20.000 × g für 5 min mit 2 ml Eppendorf-Röhrchen, und übertragen Sie die Überstände an neue GC-Vials. Dieser Schritt entfernt festen Teilchen in der Hydrolyse-Lösung. </li><li> Entfernen Sie die GC-Vial Deckel und trocknen die Proben vollständig unter einem Luftstrom mit einer Thermo Scientific Reacti-Vap Verdampfer (Anmerkung: einen Gefriertrockner kann auch t verwendet werdeno trockene Proben). Dieser Schritt kann über Nacht geschehen. </li></ol> 3. Aminosäure Derivatisierung und GC-MS-Bedingungen Die Analyse der Aminosäuren oder geladenen / polaren Metaboliten via GC setzt voraus, dass diese Metaboliten derivatisiert werden, so dass die Aminosäuren flüchtig sind und kann mittels Gaschromatographie 2 getrennt werden. <ol><li> Lösen Sie die getrockneten Proben mit 150 ul von Tetrahydrofuran (THF) und 150 ul N-(tert-Butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide Derivatisierungsreagenz. </li><li> Inkubieren Sie alle Proben in einem Ofen oder einem Wasserbad zwischen 65 und 80 ° C für 1 Stunde. Vortex gelegentlich um sicherzustellen, dass die Metaboliten in der Durchstechflasche gelöst sind. </li><li> Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 xg für 10 min und dann den Überstand in neue GC-Vials. Der Überstand sollte eine klare und gelbliche Lösung sein. Aufgrund der Sättigung der Detektoren kann GC-MS Messgenauigkeit durch die hohe conce betroffen seinntration der injizierten TBDMS derivatisierten Aminosäuren (diese Proben zeigt oft dunkelbraun), daher sollten wir verdünnen diese Proben unter Verwendung von THF vor der GC-MS Messung 6. </li><li> Analysieren Sie die Proben durch GC-MS (mit einem 1:5 oder 1:10 Split-Verhältnis, Injektionsvolumen = 1 ul, Trägergas Helium = 1,2 mL / min). Verwenden Sie die folgenden GC Temperaturprogramm: Halten bei 150 ° C für 2 Minuten, erhöhen bei 3 ° C pro min auf 280 ° C, erhöht bei 20 ° C pro min auf 300 ° C und dann 5 Minuten lang zu halten. Solvent Delay kann als ~ 5 min (bei einem 30-Meter-GC-Säule) eingestellt werden. Die Reichweite der Masse-Verhältnis (m / z) in MS Ladung kann zwischen 60 und 500 eingestellt werden. </li></ol> 4. GC-MS-Daten-Analyse <ol><li> TBDMS derivatisierten Aminosäure Messung kann auch durch Isotopen-Diskriminierung in GC-Trennung betroffen sein. Leichte Isotope bewegen etwas schneller als hieven Isotope in GC-Säule. Zur Reduzierung der potentiellen Messfehlern, können wir durchschnittlich Massenspektrum des gesamtenAminosäure Peak-Bereich 6 </li><li> Die GC-und MS-Spektren von TBDMS derivatisierten Metaboliten vor 7 berichtet. Die GC-Retentionszeit und die einzigartige m / z Peaks für jede Aminosäure sind in Abbildung 3 dargestellt. </li><li> Derivatisierung von Aminosäuren oder zentralen Metaboliten führt erhebliche Mengen von natürlich-markierten Isotope, darunter 13 C (1,13%), 18 O (0,20%), 29 Si (4,70%) und 30 Si (3,09%). Das Messrauschen aus natürlichen Isotope in der Rohmasse Isotopomer Spektrum kann durch die Verwendung veröffentlichte Software 5, 8 korrigiert werden. Die endgültige Isotopenmarkierung Daten sind als Massenanteile, z. B. M 0, M 1, M 2, M 3 und M 4 gemeldet (die Fragmente mit null bis vier 13 C markierten C-Atome). </li><li> 2-oxo-Glutaraldehyd: Messung von Aminosäuren kann Isotopenmarkierung Informationen rund acht entscheidende Vorstufe Metaboliten bietenaß, 3-P-Glycerat, Acetyl-CoA, Erythrose-4-P, Oxalacetat, Phosphoenolpyruvat, Pyruvat und Ribose-5-P. Die Kennzeichnung Muster in diesen Metaboliten genutzt, um mehrere zentrale Stoffwechselwege (Abbildung 2) 9 zu identifizieren. Das Ergebnis der Kennzeichnung Experimente können weiter bestätigt werden durch andere biochemische Methoden (z. B. RT-PCR). </li></ol> 5. Pathway-Analyse unter Verwendung von markierten Aminosäure Daten Durch die Untersuchung nur ein paar wichtige Aminosäuren aus gut gestalteten 13 C Tracer-Experimenten produziert, können wir einige einzigartige Wege oder Enzymaktivitäten, ohne eine ausgefeilte 13 C-Stoffwechselflusses Analyse der gesamten zentralen Stoffwechsel zu offenbaren. <ol><li> Entner-Doudoroff Weg: [1 bis 13 C] Glucose als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, wird Serin Kennzeichnung deutlich geringer ausfallen als Kennzeichnung in Alanin 10. </li><li> Verzweigte TCA-Zyklus: [1 bis 13 C]Pyruvat kann als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der TCA-Zyklus unterbrochen ist, kann Aspartat durch zwei Kohlenstoffatome bezeichnet werden, während Glutamat mit nur einer Kohlenstoff 11, 12 gekennzeichnet ist. </li><li> CO 2-Fixierung von Calvin-Benson-Zyklus in einem Bassham mixotrophen Stoffwechsel: Non-markiertem CO 2 und beschriftet Kohlenstoffsubstrate sind sowohl als Kohlenstoff-Quellen verwendet. Wenn Calvin-Zyklus funktioniert, wird Serin und Histidin Kennzeichnung deutlich verdünnt werden, im Vergleich zu anderen Aminosäuren. Ein solches Verfahren kann die relative CO 2-Fixierung, wenn organische Kohlenstoffquellen im Medium 13 sind. </li><li> Oxidativer Pentosephosphatweges: [1 bis 13 C] Glucose als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, wird nicht-markierten Alanin&gt; 50% 12 sein. </li><li> Anaplerotische Weg (zB PEP + CO 2 à Oxalacetat): 13 CO 2 und nicht-markierten Kohlenstoff Substrate (z. B. Glycerin oder pyruvate) kann als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, wird Aspartat Kennzeichnung deutlich angereichert, im Vergleich zu Alanin und Serin 13. </li><li> Re-Citrat-Synthase: [1 bis 13 C] Pyruvat kann als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Ist das Enzym aktiv ist, wird Glutamat in β-Carboxylgruppe 3, 4 gekennzeichnet. </li><li> Citramalate Weg: [1 bis 13 C] Pyruvat, [2 bis 13 C] Glycerin, oder [1 bis 13 C] Acetat als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, sind Leucin und Isoleucin Kennzeichnung Mengen identisch 14. </li><li> Serin-Isocitratlyase Zyklus: [1 bis 13 C] Pyruvat oder [1 bis 13 C] Laktat kann als Kohlenstoffquelle genutzt werden. Wenn der Pfad aktiv ist, wird die dritte Position Kohlenstoff in Serin 15 zu kennzeichnen. </li><li> Verwertung der Nährstoffe (dh exogene Aminosäuren): ein Kulturmedium mit vollständig beschriftet Kohlenstoffsubstrate und nicht-markierten Aminosäurenverwendet werden kann. Wenn die Zellen selektiv diese ergänzt nicht-markierten Nährstoffen zu nutzen, werden wir sehen deutliche Kennzeichnung Verdünnung dieser Aminosäuren in der Biomasse. Diese Methode kann verwendet werden, um zu untersuchen, welche Nahrungsergänzungsmittel von der Zelle 16 sind bevorzugt werden. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Aktuelle Studien haben Bioenergie Interessen bei der Nutzung neuartiger phototrophen Mikroorganismen für die Erzeugung von Bioenergie wiederbelebt und CO 2-Abscheidung. In den letzten Jahren haben etliche 13C-Stoffwechsel-Analysen, einschließlich der erweiterten 13C-Metabolic Flux Analysen (13C-MFA), angewendet worden, um zentrale Stoffwechsel in phototrophen Bakterien zu untersuchen, weil biochemische Kenntnisse der zentralen Stoffwechselwege ist nicht begründet in diesen nicht-Modellorganismen 10, 11, 17-20. Hier präsentieren wir ein Beispiel für die Entdeckung eines alternativen Isoleucin Weg in Cyanothece 51142 21. Cyanothece 51142 enthält nicht die Enzym (EC 4.3.1.19, Threonin-Ammoniak-Lyase), die Umwandlung von Threonin katalysiert 2-Ketobutyrat in den typischen Isoleucin Syntheseweg. Zur Behebung des Isoleucin-Weg, wachsen wir Cyanothece 51142 (20 mL) in ASP2 Medium 22 mit 54 mM Glycerin (2-13C,&gt; 98%). Cyanothece 51142 nutzt 2. Position gekennzeichnet Glycerin als Haupt-C-Quelle. Wir beobachten, dass Threonin und Alanin haben ein Kohlenstoffatom markiert, während Isoleucin mit drei Kohlenstoffatomen gekennzeichnet ist. Deshalb kann die Synthese in Cyanothece 51142 nicht aus dem Threonin Route von den meisten Organismen (Abbildung 4) beschäftigt abgeleitet werden. Auf der anderen Seite haben Leucin und Isoleucin identisch Kennzeichnung Muster auf Fragments (M-15) + und Fragment (M-159) +. Zum Beispiel die Isotopomer Daten aus [M-15] + (mit unfragmentierte Aminosäuren) zeigen identische Kennzeichnung für Leucin (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,21, M3 = 00,69) und Isoleucin (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,24, M3 = 0,67). So Leucin und Isoleucin müssen aus dem gleichen Vorläufer (dh, Pyruvat und Acetyl-CoA) synthetisiert werden. Diese Beobachtung steht im Einklang mit den markierten Kohlenstoff Übergang in die citramalate Weg für Isoleucin-Synthese. Um dies zu bestätigen Weg, suchen wir das Joint Genome Institute Datenbank und finden Sie die Anwesenheit eines citramalate Synthase Cima (cce_0248) in Cyanothece. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Die 13 C-assisted Pathway-Analyse vor. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Aminosäuren für den Erwerb der Kennzeichnung Muster ihrer metabolischen Vorstufen verwendet. ACoA, Acetyl-CoA, AKG, α-Ketoglutarat; C5P, Ribose-5-Phosphat; CIT, Citrat, E4P, Erythrose-4-Phosphat; G6P, Glucose-6-Phosphat; OAA,<html> Oxalacetat, PEP, Phosphoenolpyruvat, PGA, 3-Phosphoglycerat; PYR, Pyruvat. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. GC-Peaks für 16 Aminosäuren. TBDMS derivatisierten Aminosäuren werden durch MS in zwei Fragmente geknackt: (M-57) +, welches den gesamten Aminosäure und (M-159) +, die nicht über die α Carboxylgruppe der Aminosäure. Für Leucin und Isoleucin, die (M-57) + wurde von anderen Massenpeaks überschnitten. Wir empfehlen die Verwendung Fragment (M-15) + den gesamten Aminosäure Kennzeichnung zu analysieren. Die (F302) + Gruppe ist in den meisten Aminosäuren entdeckt, die nur die erste (α-Carboxylgruppe) und dem zweiten Kohlen in eine Aminosäure-Backbone. Da dieses MS Gipfel hat oft hohe Rausch-Signal-Verhältnis, (F302) + ist nicht für die quantitative Analyse der metabolischen Flüsse 7 empfohlen. BBILDUNG 4 &quot;/&gt; Abbildung 4. Labeling Übergänge in Isoleucin Wege in Cyanothece 51142 (modifiziert nach unseren bisherigen Papier) 21.

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	<li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis.">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling.">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li><li>Tang, Y. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations.">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li><li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-based+metabolic+flux+analysis.">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll besteht aus Fütterung der Zelle mit einem markierten Substrat und Messung der daraus resultierenden Isotopenmarkierung Muster in den Aminosäuren via GC-MS. Da MS-Daten (m / z-Verhältnisse) nur der Gesamtbetrag der Kennzeichnung von MS-Ionen geben, haben wir auf die Isotopomer Ausschüttungen von Aminosäuren durch die Untersuchung der m / z-Verhältnisse der beiden unfragmentierte (M-57) + und fragmentiert Aminosäuren zu bewerten (dh, (M-159) + und (F302) +). Darüber h...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19915 </td><td> - </td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 34865 </td><td> - </td></tr><tr><td> Labeled Kohlenstoffsubstrat </td><td> Cambridge Isotope Laboratories </td><td> Verlassen Sie sich auf die experimentelle Bedingung </td><td> Website: <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> Gas-Chromatographen </td><td> Agilent Technologies </td><td> Hewlett-Packard, Modell 7890A </td><td> - </td></tr><tr><td> GC-Säulen </td><td> J &amp; W Scientific, Folsom, CA </td><td> DB5 (30m) </td><td> - </td></tr><tr><td> Massenspektrometer </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5975 </td><td> - </td></tr><tr><td> Reacti-Vap Evaporator </td><td> Thermo Scientific </td><td> TS-18825 </td><td> Zum Trocknen Aminosäure-Proben </td></tr></tbody></table>

metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids

Mikroben haben komplexe Stoffwechselwege, untersucht mit Hilfe der Biochemie und der funktionellen Genomik Methoden werden kann. Eine wichtige Technik, um Zelle zentralen Stoffwechsel untersuchen und entdecken neue Enzyme ist 13 C-assisted Stoffwechsel-Analyse 1. Diese Technik basiert auf Isotopenmarkierung, wobei Mikroben mit 13 C markierten Substraten zugeführt beruhen. Die Verfolgung der Atom Übergang Wege zwischen Metaboliten in die biochemische Netzwerk können wir bestimmen, funktionale Wege und entdecken neue Enzyme. Als ergänzende Methode zur Transkriptom-und Proteomforschung, Ansätze für Isotopomer-gestützte Analyse von Stoffwechselwegen drei große Schritte 2 enthalten. Erstens, wir wachsen Zellen mit 13 C markierten Substraten. In diesem Schritt werden die Zusammensetzung des Mediums und die Auswahl der markierten Substraten zwei Schlüsselfaktoren. Um zu vermeiden, Mess-Geräusche aus nicht-markierten Kohlenstoffs in Nahrungsergänzungsmittel, Ist ein Minimal-Medium mit einer einzigen Kohlenstoffquelle erforderlich. Weiterhin ist die Wahl einer markierten Substrat, wie effektiv es wird der Weg zu analysierenden Aufklärung basiert. Da neuartige Enzyme beinhalten häufig unterschiedliche Reaktion Stereochemie oder Zwischenprodukte in der Regel einfach markierten Kohlenstoffsubstrate informativer für den Nachweis neuartiger Wege als einheitlich bezeichnet diejenigen für die Erkennung von neuen Bahnen 3, 4 sind. Zweitens analysieren wir Aminosäure Kennzeichnung Muster mit GC -MS. Aminosäuren sind reich an Protein und kann daher aus Biomasse Hydrolyse erhalten werden. Aminosäuren können durch N-(tert-Butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) derivatisiert vor GC-Trennung. TBDMS derivatisierten Aminosäuren kann durch MS und das Ergebnis in verschiedenen Arrays von Fragmenten fragmentiert. Bezogen auf die Masse zu Ladung (m / z)-Verhältnis von fragmentierten und unfragmentierte Aminosäuren, können wir ableiten, die möglichen beschriftet Muster der zentralen Metaboliten, dieVorläufer der Aminosäuren. Drittens verfolgen wir 13C Carbon-Übergänge in der vorgeschlagenen Wege und auf der Grundlage der Isotopomer Daten bestätigen, ob diese Wege Aktiv-2 sind. Messung von Aminosäuren bietet Isotopenmarkierung Informationen rund acht entscheidende Vorstufe Metaboliten in den zentralen Stoffwechsel. Diese metabolischen Schlüssel Knoten spiegeln die Funktionen der assoziierten mittel-Bahnen. 13 C-assisted Stoffwechsel-Analyse über proteinogenen Aminosäuren können sehr für die funktionelle Charakterisierung von schlecht charakterisiert mikrobiellen Stoffwechsel 1 verwendet werden. In diesem Protokoll werden wir Cyanothece 51142 als Modell Belastung verwenden, um die Verwendung markierter Kohlenstoff-Substraten für die Entdeckung neuer enzymatischer Funktionen zu demonstrieren.

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Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13 C-Isotopenmarkierung ist eine nützliche Technik für die Bestimmung der Zelle zentralen Stoffwechsel für verschiedene Arten von Mikroorganismen. Nachdem die Zellen mit einer bestimmten markiertem Substrat gezüchtet haben, können GC-MS-Messung zeigen funktionale Stoffwechselwege auf einzigartige Kennzeichnung Muster in proteinogenen Aminosäuren basiert.

Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch 13 C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

metabolic-pathway-confirmation-discovery-through-13c-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

24.1K Aufrufe.  Washington University. 13 C-Isotopenmarkierung ist eine nützliche Technik für die Bestimmung der Zelle zentralen Stoffwechsel für verschiedene Arten von Mikroorganismen. Nachdem die Zellen mit einer bestimmten markiertem Substrat gezüchtet haben, können GC-MS-Messung zeigen funktionale Stoffwechselwege auf einzigartige Kennzeichnung Muster in proteinogenen Aminosäuren basiert.

Serie: Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Mit dem GELFREE 8100 Fraktionierung System für Molecular Weight-Based Fraktionierung mit Liquid Phase Wiederherstellung

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Forschung

Biologie

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

Ein-Schritt-Metabolomics: Kohlenhydrate, organische und Aminosäuren in einem einzigen Verfahren Quantifizierte

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Entwicklung von Inhibitoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch REPLACE: Anwendung auf die Konzeption und Entwicklung Nicht ATP Competitive CDK-Inhibitoren

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

Rückstands spezifische Einbau nichtkanonischer Aminosäuren in Modellproteine ​​eine Verwendung<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zellfreie Transkription-Translation-System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.