Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Deakin University Zebrafisch Facility for eine ausgezeichnete laufenden Tierhaltung Pflege danken. YG wird durch ein Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship und Central Research Grant von Deakin University unterstützt. SLM wird durch eine NHMRC Career Development Fellowship unterstützt. ACW wird von einem NHMRC Aktivieren Stipendium unterstützt. Alle Autoren werden von der Molecular &amp; Medical Research Strategic Research Centre an der Deakin University unterstützt.

Teil 1: Chemische Behandlung von Zebrafisch-Embryonen <ol><li> Sammle Zebrafisch Embryonen nach der Befruchtung. Inkubation bei 28,5 ° C in E3 Medium in 100 mm × 15 mm Petrischalen. Hinweis: Für die in situ-Hybridisierung oder Oil-Red-O-Färbung, ist 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) in einer Endkonzentration von 0,2 mM hinzugefügt inhibieren Pigmentbildung, 1, aber ist nicht notwendig für Seahorse Analyse. </li><li> Für pharmakologische Studien, fügen Sie die erforderlichen chemischen zu einem angemessenen Endkonzentration zu entwickeln Zebrafischembryonen bei rund 26 Stunden nach der Befruchtung (hpf) mit einem geeigneten Fahrzeug nur die Kontrolle. Hinweis: für lichtempfindliche pharmakologische Inhibitoren, Embryonen erlaubt werden kann, in der Entwicklung werden die dunkle vor der Analyse. </li></ol> Teil 2: Live Metabolic Profil mit dem Seahorse XF 24 Analyser <ol><li> Vor jedem Lauf, der Seahorse XF 24 Analyser Patrone, beherbergt das O 2 und H <sbis&gt; + Fluorophore wird durch einen automatisierten Prozess von dem Analysator durchgeführt kalibriert. </li><li> Vorbereitung der 24-Well-XF 24 Inselchen Platte. Die folgenden experimentellen Sequenz verwendet wird: <ol><li> Da Sauerstoffverbrauch ist empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen, sind vier Bohrungen verwendet werden, um nach möglichen Temperaturschwankungen über die Platte zu steuern. Diese Vertiefungen enthalten keine Embryonen, sondern werden mit 700 ul Medium E3 (2A) gefüllt ist. </li><li> Die verbleibenden 20 Bohrungen (siehe Abschnitt 2.2) werden mit 700 ul Medium und E3 ein Embryo jedes (2B) gefüllt. </li><li> Für jedes Experiment werden 10 Embryonen mit Fahrzeug-only (Kontrolle) und 10 mit chemischen Inhibitor (behandelt) behandelt wurden. Kontroll-und behandelten Embryonen abgewechselt werden (zB auch A2: control Embryos, gut A3: behandelte Embryo: well A4: control Embryos, gut A5 behandelt Embryo, etc). </li><li> Eine kleine Insel Capture-Bildschirm auf der Oberseite hinzugefügt. jede Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Probe in der Messkammer in der Assay (2B) bleibt Hinweis: chemisch behandelten Embryonen bleiben mit ihren ursprünglichen chemischen Lösung während des gesamten Verfahrens, ohne die Notwendigkeit zu waschen die chemische vor Ausführung der Seahorse-Analysator Programm. </li><li> Einmal abgeschlossen, wird die Platte in das Seahorse Analyser geladen und der Assay wird gestartet. </li></ol></li><li> Analyse von Proben. Zwei verschiedene Tests werden routinemäßig durchgeführt. <ol><li> Basalatmung / Maximum Atmung Programm (Dauer ca. 90 min.). Veränderungen in Basalatmung untermauern metabolische Dysfunktion, während maximale Atmung ist ein Maß der gesamten Energieerzeugung Kapazität und Veränderungen dieser Parameter mit einer Reihe von sowohl pathologischen und physiologischen Zuständen zugeordnet. Das Reserverad Atemkapazität oder die Kapazität für das System weiter zu steigern ATP-Produktion, wird ebenfalls berechnetaus diesem Test durch die Subtraktion der Basal von maximal Atmung. Drei Wiederholungen von jeder Mischung (2 min) / wait (1 min) / Messung (2 min) Zyklus wird durchgeführt, um zuerst feststellen Basalatmung. Am Ende des dritten Zyklus wird eine Endkonzentration von 2,5 pM FCCP (mitochondriale protonophore / Entkoppler) in jede Vertiefung erlaubt die Messung der maximalen Atmung aufgenommen. Der Meßzyklus wird dann 5 bis 8 mal (Abbildung 3) wiederholt. </li><li> ATP Umsatz / Proton Leck Programm (Dauer ca. 60 min.). Atmung durch ATP Umsatz repräsentiert die Hauptfunktion von Mitochondrien in Form von ATP-Produktion, während der Atmung durch Proton Leck oder ungekoppelten Atmung, ist untrennbar mit anderen Parametern der mitochondrialen Funktion einschließlich Basalatmung und Bildung reaktiver Sauerstoffspezies verknüpft. Atmung durch ATP Umsatz wird durch die Differenz in der Atmung nach der Zugabe von 25 uM Oligomycin (ein Inhibitor von A dargestellteTP-Synthase) an Basalatmung verglichen. Ungekoppelten Atmung, oder die Atmung durch Proton Leck, durch Berechnen der Differenz zwischen Oligomycin-vermittelte Beatmung und Atmung nach der Zugabe von 25 uM Rotenon (eine komplexe I-Inhibitor) ermittelt. Messzyklen 8 mal nach Zugabe jedes mitochondrialen Inhibitor wiederholt. </li></ol></li></ol> Am Ende der Läufe, Mittelwerte der 10 Kontrolltieren und 10 chemisch behandelten Embryonen werden berechnet. Teil 3: Oil-Red-O-Färbung <ol><li> Embryonen bei 50 hpf sind dechorionated mit feinen Pinzetten und in 4% PFA fixiert Nacht bei 4 ° C. </li><li> Oil-Red-O-Färbung durchgeführt wird, wie zuvor 2 beschrieben (siehe Abbildung 4). </li></ol>

<ol>
	<li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish. , (2002).</li><li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish.">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li><li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis.">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development.">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652 (2011).</li><li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics.">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li><li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes:+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities.">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li><li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+obesity.">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li><li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+in+multiple+sclerosis.">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li><li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li><li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li><li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer.">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Zebrafisch ist ein gut etabliertes genetisches Modell für sowohl vorwärts (ENU Mutagenese) und rückwärts (Tilling, Zinkfinger-Nuclease gezielte Knock-out-, Morpholino Knockdown) genetische Ansätze 3,4, während Genfunktion beim Zebrafisch Embryonen können auch einfach blockiert oder aktiviert werden Verwendung selektiver pharmakologischen Verbindungen spezifisch für den codierten Produkte. Aufgrund ihrer externen Entwicklung und geringen Größe sind Zebrafischembryonen besonders geeignet für metabolische Analyse. Allerdings hat sich das robuste Messung der metabolischen Profils und die Funktion der Mitochondrien in vivo in Zebrafisch-Embryonen nicht erreicht wurde, mit nur einer vorläufigen Beschreibung berichtete 5. Seahorse Analyse wurde ursprünglich für zellbasierte metabolischen Untersuchungen ausgelegt und hat sich gezeigt, um genaue und zuverlässige Ergebnisse 6. Die Anwendung dieser neuen Methode zur Zebrafisch-Embryonen ist bezeichnend, und wahrscheinlich die breitere Nutzung dieses Modells für metabolische Studien zu erhöhen. In dieser Studie zeigen wir, Messung einer Reihe von Atmung Parameter in Zebrafisch-Embryonen mit dem Seahorse Analyser, einschließlich Basalatmung, maximal Atmung, Freizeit Atemkapazität, ATP Umsatz und Protonen Leckage. Wir stellen auch ein Beispiel, wie solche Messungen können mit anderen physiologischen Parameter, in diesem Fall Lipidakkumulation und der Verwendung pharmakologischer Inhibitoren in diesem Testsystem korreliert werden. In Kombination mit dem Einsatz von genetisch veränderten Embryonen, stellt dies eine starke experimentelle Plattform für das Verständnis Einflussfaktoren auf den Stoffwechsel. Es gibt eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für diese neue Methodik, mit mitochondrialer Dysfunktion ist in vielen menschlichen Erkrankungen, wie Diabetes mellitus 7, 8 Fettleibigkeit, Multipler Sklerose 9, Parkinson-Krankheiten 10, Alzheimer 11 und irgendeine Art von Krebserkrankungen 12 gebracht. Wichtig ist, owie Zytokine, entwicklungsbezogenen Wachstum usw. - - ur Arbeit wird in vivo, wo alle Umwelteinflüsse durchgeführt aktiv sind, wodurch eine physiologisch relevante Sicht in vivo Atmung und metabolische Profil. Als chemische Bildschirme werden auch routinemäßig in Wildtyp und Mutante Hintergrund Zebrafischembryonen (Abbildung 1), neuartige Medikamente, die Einfluss auf die Atmung, Mitochondrien-Funktion oder Stoffwechsel leicht identifiziert werden konnte mit der Seahorse-Analysator durchgeführt. Die Ergebnisse unter Verwendung der Seahorse-Analysator könnte in Verbindung mit anderen Assays verwendet werden, um zusätzliche Informationen bereitzustellen. Dazu kann auch physiologische Analyse, wie Öl-Rot-Färbung oder der molekularen Analyse, wie in situ Hybridisierung für spezifische Marker wie Adipozyten cebpα, PPARalpha, PPAR &amp;ggr;, FAS usw. Es bleiben jedoch einige Einschränkungen zu dieser Methodik. Obwohl wir und andere konnten Oligomycin zum Messen verwendenure ATP-Produktion und Proton Leck auf junge Embryonen 5 (siehe Abbildung 3), in Embryonen älter als 60 hpf Oligomycin Behandlung ist ineffizient. Wir glauben, dass bei älteren Embryonen Oligomycin nicht so leicht als bei jüngeren Embryonen machen die Ergebnisse nicht zu interpretieren diffundieren. Da die Ergebnisse Oligomycin zwingend zur Bestimmung der Atmung durch ATP Umsatz und ungekoppelten Atmung sind, untersuchen wir derzeit höhere Konzentrationen an Oligomycin für ältere Embryonen. Allerdings bleiben Antimycin A Behandlungen wirksam länger, mit anderen Messungen wie Basalatmung, maximale Atmung und Ersatz Atemkapazität können bei älteren Zebrafischembryonen durchgeführt werden, bis zu 68 hpf (nicht dargestellt). Eine weitere Einschränkung bei der Verwendung der aktuellen Seahorse Analyser Setup ist der physische Raum innerhalb der einzelnen Insel Fangplatte gut, so dass sie nur für Zebrafisch Embryonen und jungen Larven sind. Daher Durchführung metabolic Studien über ernährungsbedingte Fettleibigkeit bei erwachsenen Fische, zum Beispiel, ist technisch noch nicht machbar. Allerdings kann diese Studie fordert die Entwicklung von Platten speziell für jugendliche oder erwachsene Fische entwickelt, wodurch der Anwendungsbereich der Analysen möglich.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> XF 24 extrazellulären Fluss-Analysator </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> 24-Well-Format </td></tr><tr><td> Islet Capture-Mikrotiterplatten </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> 24-Well-Format </td></tr><tr><td> XF Kalibrierlösung </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF Assay-Medium </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Oil-Red-O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (embryonale medium) </td><td> Selbst gemacht </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100x15 mm Petrischalen </td><td> Falke </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomycin </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

metabolic profile analysis of zebrafish embryos

Eine wachsende Ziel im Bereich des Stoffwechsels ist, die Auswirkungen der Genetik auf verschiedene Aspekte der mitochondrialen Funktion zu bestimmen. Das Verständnis dieser Zusammenhänge wird helfen, die zugrunde liegende Ätiologie für eine Reihe von Erkrankungen, die mit mitochondriale Dysfunktion, wie Diabetes und Fettleibigkeit zu verstehen. Jüngste Fortschritte in der Instrumentierung, hat die Überwachung der verschiedenen Parameter der mitochondrialen Funktion in Zelllinien oder Gewebe Explantate aktiviert. Hier präsentieren wir eine Methode für eine schnelle und empfindliche Analysen der mitochondrialen Funktion Parameter in vivo während der Zebrafisch Embryonalentwicklung mit der Seahorse Bioscience XF 24 extrazellulären Fluss-Analysator. Dieses Protokoll nutzt die Islet Capture-Mikrotiterplatten, wo ein einzelner Embryo in jedem gut platziert ist, so dass die Messung der Bioenergetik, einschließlich: (i) Basalatmung; (ii) basal mitochondriale Atmung (iii) die mitochondriale Atmung durch ATP Umsatz; (iv) mitochondriale entkoppelt Atmung oder prOton Leck und (iv) maximale Atmung. Mit diesem Ansatz embryonalen Zebrafisch Atmung Parameter können zwischen Wildtyp und gentechnisch veränderte Embryonen (Mutante, Gen-Überexpression oder Gen-Knockdown) oder den manipulierten pharmakologisch verglichen werden. Es wird erwartet, dass die Verbreitung dieses Protokolls werden die Forscher mit neuen Tools bieten, um die genetischen Grundlagen von Stoffwechselstörungen in vivo in diesem relevanten Wirbeltier Modell zu analysieren.

<html> Wir sind daran interessiert zu verstehen, die Rolle bestimmter Gene auf den Stoffwechsel, insbesondere Atemfrequenz und Fettstoffwechsel. Daher behandelten wir Wildtyp Zebrafischembryonen aus 26 hpf vorwärts mit einer spezifischen pharmakologischen Inhibitor des Enzyms durch einen dieser Gene kodiert. Bei 50 hpf, die Hälfte des Fahrzeugs und Inhibitor-behandelten Embryonen wurden mit dem Seahorse für mitochondriale Funktion, während die andere Hälfte in 4% PFA wurden über Nacht bei 4 ° C und anschließend für die Lipid-Abscheidung mit Oil-Red-O gefärbt. Die Behandlung mit dem spezifischen Enzym-Inhibitor führte ein ~ 2 fache Erhöhung Basalatmung (4A), die mit einer Zunahme der Lipidablagerung insbesondere im Telencephalon und unterhalb des otisch Vesikel (4B, C) ​​zugeordnet wurde. pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Schematische Darstellung der chemischen Behandlung von Zebrafisch-Embryonen. Wildtyp, genetisch manipuliert oder pharmakologisch behandelt Zebrafischembryonen sind Hintergrund. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Abbildung 2. XF24 Insel Platte auf. (A) Vier Brunnen embryonalen Medium enthalten nur Temperaturregelung (markiert durch ein X) und die anderen enthalten ein Embryo / gut. (B) Close-up von einem gut (C6) zeigt eine 50 hpf Wildtyp Embryo mit Vehikel (DMSO) von einer kleinen Insel Capture-Bildschirm (Pfeilspitze) abgedeckt behandelt. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Abbildung 3. Respiration Parameter für Wildtyp 50 hpf Zebrafischembryonen. (A) Für jede Messung wird der Mittelwert der 20 einzelnen Embryonen vorgestellt. Basalatmung (Mittelwert: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), Maximal Atmung (Mittelwert: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), Spare Respiratory Capacity (Mittelwert: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) Für jede Messung wird der Mittelwert aus den 20 Einzelmessungen dargestellten Ergebnisse. Basal mitochondriale Atmung; mitochondriale Atmung durch ATP Umsatz; Mitochondrien entkoppelt Atmung und nicht die mitochondriale Atmung. Mt: Mitochondrien, SRC: Spare Respiratory Kapazität; SD: Standardabweichung, SEM: Standardfehler des Mittelwerts. Die Ergebnisse werden in pmol von O 2 vorgestellt konsumiert / min / Embryo. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Reprerepräsentativen Ergebnisse der chemischen Einwirkung auf die basale Atmung und Lipidablagerung. (A, B) 50 hpf Embryo mit Öl-Rot O in Seitenansicht angefärbt. Der Embryo mit der selektiven Inhibitor (B) inkubiert zeigt mehr Oil-Red-O-Färbung im Telencephalon (Pfeilspitze) und unterhalb des otic Vesikel (Pfeil) im Vergleich zu einem Fahrzeug-behandelten Kontrollgruppe Embryo. (C) zeigt ein Basalatmung ~ 2 fache Erhöhung der chemisch behandelten Embryonen (n = 10 Embryonen pro Gruppe). Ergebnisse sind in pMol von O 2 / min / Embryo präsentiert.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos at JoVE.com

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Zebrafisch stellen eine leistungsstarke Wirbeltier-Modell, das schon für metabolische Studien nicht ausreichend genutzt hat. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode, um die Messung<em&gt; In vivo</em&gt; Metabolische Profil zu entwickeln Zebrafisch, die den Vergleich verschiedener mitochondrialer Funktion Parameter zwischen gentechnisch oder pharmakologisch manipulierte Embryonen ermöglicht, wodurch die Anwendbarkeit dieses Organismus.

Metabolic-Profil-Analyse von Zebrafischembryonen

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

metabolic-profile-analysis-of-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

19.8K Aufrufe.  School of Medicine, Deakin University. Zebrafisch stellen eine leistungsstarke Wirbeltier-Modell, das schon für metabolische Studien nicht ausreichend genutzt hat. Hier beschreiben wir eine schnelle Methode, um die Messung In vivo Metabolische Profil zu entwickeln Zebrafisch, die den Vergleich verschiedener mitochondrialer Funktion Parameter zwischen gentechnisch oder pharmakologisch manipulierte Embryonen ermöglicht, wodurch die Anwendbarkeit dieses Organismus.

Serie: Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generieren Chimäre Zebrafischembryonen durch Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Eukaryotische Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

Imaging Glykane in Zebrafisch-Embryonen durch metabolische Markierung und Bioorthogonale Click-Chemie

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Die Analyse der Apoptose in Zebrafischembryonen von Whole-mount Immunfluoreszenz an aktivierte Caspase 3 Detect

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...