DOZ wird durch einen Zuschuss aus der Genfer Stiftung unterstützt. SN wurde von einem Postdoctoral Fellowship Grant von der Pittsburgh Tissue Engineering Initiative unterstützt.

1. Isolieren von aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. <ol><li> Isolieren Ratte perirenalen und Nebenhoden Fettgewebe und wäscht mit sterilen gepufferten Salzlösung Hanks-Lösung (HBSS) mit 1% fötalem Rinderserum (FBS), wie zuvor 6 beschrieben. </li><li> Hackfleisch und das Gewebe zu übertragen 1-2 g in 25 ml HBSS, enthaltend 1% FBS in einen 50 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 500 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Sammeln der frei schwebenden Fettgewebe Schicht und Übertragung in 125 ml Erlenmeyer-Kolben und Behandlung mit 25 ml Collagenase Typ II (200 U / ml) in HBSS für 45 min bei 37 ° C auf einem Schüttler (125 rpm). </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die flüssige Fraktion (unten Öl-und Fett-Schicht) und der Filter nacheinander durch eine 100-um und um 70-Nylon-Mesh-Filter. Zentrifuge das Filtrat bei 500 g für 10 min bei Raumtemperatur, saugen Sie den supernatant und waschen Sie das Pellet zweimal mit 25 ml HBSS. </li><li> Zellpellet in 50 ml Wachstumsmedium (MesenPRO RS Basal Medium) mit MesenPRO RS Growth Supplement, Antibiotika-Antimykotika (100 U / ml Penicillin G, 100 ug / ml Streptomycin-Sulfat, und 0,25 ug / ml Amphotericin B) ergänzt und 2 mM L-Glutamin und Pipette Zellen in 2 T75-Flaschen (25 ml / Flasche). </li><li> Kultur der ASC in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C (Passage 2-4 ASC für alle Experimente verwendet werden). </li></ol> 2. Herstellung von Chitosan Mikrokügelchen (CSM) Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. <ol><li> CSM werden von einer Wasser-in-Öl-Emulsion Prozess zusammen mit einem ionischen Koazervation Technik mit unserer vorherigen Protokolls 6 hergestellt. Emulgieren einer wässrigen Lösung von Chitosan (6 ml 3% w / v Chitosan in 0,5 M Essigsäure) in einem 100 ml einer Ölphase bestehend aus SojaÖl, n-Octanol (1:2 v / v) und 5% Sorbitan-Mono-Oleat (Span 80) Emulgator an Overhead (1700 rpm) und magnetischem Rühren (1000 rpm) gleichzeitig in entgegengesetzten Richtungen. Dieser duale Verfahren zum Mischen sorgt dafür, dass Micellen früh vor dem Vernetzen tritt in Lösung bleiben kann und nicht am Boden absetzen. Darüber hinaus der magnetische Rührstab hilft bei de-Aggregation Chitosan während Mizellenbildung und rigidization. </li><li> Die Mischung wird kontinuierlich für ungefähr 1 Stunde, bis eine stabile Wasser-in-Öl-Emulsion erhalten wird gerührt. Ionische Vernetzung wird durch die Zugabe von 1,5 ml von 1% w / v Kaliumhydroxid in n-Octanol alle 15 min für 4 h (24 ml Gesamtvolumen) eingeleitet. </li><li> Nach Beendigung der Vernetzungsreaktion, langsam dekantieren die Ölphase der Mischung, die CSM und sofort die Kugeln 100 ml Aceton. Waschen der Kugeln mit Aceton, bis die Ölphase vollständig entfernt wird. </li><li> Trocknen Sie die wiederhergestellten Sphären in einem Vakuumexsikkator und analYZE ohne weitere Verarbeitung. Die durchschnittliche CSM Partikelgröße, Oberfläche pro Milligramm und die Einheit Kubikmeter Volumen wurde mit Partikelgrößenanalyse. </li><li> Für die folgenden Experimente, waschen Sie CSM dreimal mit sterilem Wasser, um restliche Salze zu entfernen und zu sterilisieren mit absolutem Alkohol. </li></ol> 3. Bestimmen der Anzahl der freien Aminogruppen in CSM Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. <ol><li> Bestimmen der Anzahl von freien Aminogruppen in CSM nach ionische Vernetzung unter Verwendung des Trinitro Benzolsulfonsäure (TNBS)-Assay der Bubins und Ofner 7. Inkubiere 5 mg Mikrosphären mit 1 ml 0,5% TNBS-Lösung in einem 50 ml Glasröhrchen für 4 h bei 40 ° C und Hydrolyse unter Zusatz von 3 ml 6 N HCl bei 60 ° C für 2 Stunden. </li><li> Kühlung der Proben auf Raumtemperatur, und Extrahieren der freien TNBS durch Zugabe von 5 ml entionisiertem Wasser und 10 ml EthylacetatÄther. </li><li> Warm eine 5-ml-Aliquot der wässrigen Phase auf 40 ° C in einem Wasserbad für 15 min, um das restliche Ether, auf Raumtemperatur abkühlen, verdampft und verdünnt mit 15 ml Wasser. </li><li> Die Absorption bei 345 nm mit einem Spektrophotometer unter Verwendung TNBS-Lösung ohne Chitosan als leer und die Chitosan zur Herstellung CSM verwendet, um die Gesamtzahl der Aminogruppen zu bestimmen. Schätzen Sie die Anzahl der freien Aminogruppen des CSM in Bezug auf Chitosan. </li></ol> 4. Lädt ASC in CSM Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. <ol><li> Äquilibrieren 5 mg sterilisiert CSM aus Abschnitt 2.5 in sterilem HBSS über Nacht, und fügen Sie in ein 8-um Porengröße Membran Kulturplatte Einsatz (24-Well-Platte). </li><li> Nachdem die CSM auf die Membran niedergelassen haben, sorgfältig absaugen HBSS und 300 ul von Wachstumsmedium auf die Innenseite des Einsatzes und 700 ul des Wachstums Medien zu the Außenseite des Einsatzes. </li><li> Resuspendieren ASC in der entsprechenden Konzentration (1 x 10 4 bis 4 x 10 4) in 200 ul Wachstumsmedium und Saatgut über den CSM in der Kulturschale Einsatz. Das Endvolumen des Mediums innerhalb der Kultur Einsatz, nach dem Aussäen von 500 ul. </li><li> Inkubieren Sie die ASC seeded auf CSM für 24 h in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. </li></ol> 5. Bestimmung des Prozentsatzes ASC Loading und Zelllebensfähigkeit in CSM Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. <ol><li> Nach der Inkubation, sammeln die ASC-beladenen CSM in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, ohne die Zellen, die in den Einsatz Membran gewandert sind. </li><li> Entfernen Sie die Reste des Mediums und 250 ml frisches Wachstumsmedium in das Röhrchen. </li><li> In jedes Röhrchen hinzufügen 25 ul MTT [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid]Lösung (5 mg / ml) und Inkubation für 4 h in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C </li><li> Nach der Inkubation des Mediums zu entfernen, mit 250 ul Dimethylsulfoxid und Wirbel der Mischung für 2-5 min, um die Formazan-Komplex aufzulösen. </li><li> Zentrifugieren Sie die CSM bei 2700 x g für 5 min, und bestimmen Sie den Überstand Absorption bei 570 nm mit 630 nm als Referenz gemessen. </li><li> Bestimmen Sie die Zellzahl mit dem CSM gegenüber dem Extinktionswert von bekannten Anzahl lebensfähiger ASC erhalten assoziiert. </li></ol> 6. Charakterisierung von ASC-CSM-Embedded Kollagen-Gel Hinweis: Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. <ol><li> ASC-Mix geladene CSM (5 mg enthält ≈ 2 x 10 4 Zellen) mit Typ 1-Kollagen (7,5 mg / ml) aus Rattenschwanzsehnen nach der Methode der Bornstein 8 und fibrillieren extrahiert nach Einstellen des pH auf 6,8 mit 2 N NaOH. </li&gt; <li> In der fibrillierten Kollagen-ASC-CSM Mischung auf eine 12-Well-Platte und Inkubation für 30 min bei einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C </li><li> Nach der vollständigen Kammerflimmern, bebrüten die Kollagen-ASC-CSM-Gele für bis zu 14 Tage in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Veröffentlichung und Migration von Zellen von CSM in das Gel wurden mittels Standard-Mikroskopie-Techniken. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse In der vorliegenden Studie haben wir ein in vitro-Strategie zur Stammzellen aus Chitosan-Mikrokügelchen (CSM) in ein Kollagengel Gerüst liefern entwickelt. Poröse CSM von einheitlicher Größe (175-225 um Durchmesser) und Zusammensetzung wurden hergestellt und wie Zellträger (2) verwendet. Nach Inkubation mit dem ASC CSM, die Zellen bei einer Konzentration von 2 x 10 4 cells/5mg der CSM befestigt. Die Zellen waren in der Lage sich über den Mikrokügelchen, während sich Filopodienin die Spalten der porösen Mikrokügelchen (3). Sobald die Zelle beladenen CSM mit dem Kollagen-Gel gemischt wurden, begann die Zellen sofort wandern in den Gelen (Abbildung 4). <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624table1.jpg" /> Tabelle 1. Biologische Vorteile für die Verwendung von Chitosan und Kollagen in einer Stammzelle Abgabesystem. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Gesamtstrategie für die zweifache Nutzung von ASC-CSM geladenen Kollagenträger. Abbildungen 2, 3 und 4 sind mit Anmerkungen in der schematischen um bei der Interpretation der Bilder zu unterstützen. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung, den Prozess der Aussaat Stammzellen auf Chitosan-Mikrokügelchen. Das procESS beinhaltet Co-Kultivierung mit ASC CSM in einem 8 - um Porengröße Membran Kulturplatte Einsatz. Nach 24 Stunden werden die Mikrokügelchen aus dem Einsatz entfernt und sind für die Einbettung in eine Matrix Biomaterial. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig3.jpg" /> Abbildung 3. Morphologische Charakterisierung von CSM mit ASC-geladen. Panel A zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme von ASC-beladenen CSM, während Panel B zeigt die gleichen Sichtfeld mit einem Bild durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie erhalten überlagert. ASC wurden mit Calcein AM (grün) vorinstalliert. Tafel C zeigt ein Bild eines SEM-Bildes eines unbelasteten Mikrokügelchen, während Tafel D zeigt Zellen auf die Mikrokügelchen (Sternchen) geladen. TEM-Bild Tafel E zeigt einen Querschnitt eines unbelasteten Mikrokügelchen. Eine Vielzahl von Poren und Risse werden in der Mikrokügelchen angeordnet. Tafel F zeigt eine Querschnitt Mikrokügelchen mit Zellen (Pfeile) befestigt ist und sich in die cre FilopodienLaster. Original-Vergrößerungen: A &amp; B = 70X, C = 500x, D = 2.000 x; E &amp; F = 2.500 x. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig4.jpg" /> Abbildung 4. Migration der ASC von der CSM in den dreidimensionalen Kollagen-Gerüst. Felder A und B zeigen die CSM mit Zellen Migration von Mikrokügelchen und in die Kollagenmatrix am Tag 3 (A, Pfeile). Tafel B zeigt eine ähnliche Kultur nach 12 Tagen. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) in C-, D und E. Sternchen in C und D dargestellt zeigen eine Mikrokugel, die bereits im Querschnitt hat mit Zellen Migration vom Mikrokugel (Pfeile). Höhere Vergrößerung Panel D wird im Panel E dargestellt und zeigt Zelle Filopodien an den Kollagenfibrillen (kleines Bild). Original-Vergrößerung: A &amp; B = 100x; C &amp; D = 6.000 x; E = 20.000 x, x Einsatz = 150.000. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig5.jpg" /> Abbildung 5.Schematische Darstellung der überwiegende Verwendung von CSM in der regenerativen Medizin und Drug Delivery.

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Eine große Hürde in der Stammzell-basierten Therapie ist die Entwicklung effizienter Methoden für die Lieferung von Zellen zu den angegebenen Regionen zur Reparatur. Aufgrund der Patient zu Patient Variabilität, die Gewebe-Typ, Größe und Tiefe Verletzungen, muss die Methodik der Bereitstellung von Stammzellen auf einer Fall-zu-Fall-Basis bestimmt werden. Obwohl die Einbettung Stammzellen in einer Matrix und liefert sie an der Wundstelle scheint ein nächster logischer Ansatz für das Tissue Engineering werden, ble...

<table border="1" ><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hanks BalancedSalt Lösung (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14175 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Kollagenase vom Typ II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6685 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> 70-um Nylonmaschenfilter </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> 100-um Nylonmaschenfilter </td><td> BD Biosciences </td><td> 352360 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> MesenPRO Growth Medium-System </td><td> Invitrogen </td><td> 12746-012 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> T75 Zellkulturflasche </td><td> BD Biosciences </td><td> 137787 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Chitosan </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 448869 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320099 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> N-Octanol </td><td> Acros Organics </td><td> 150630025 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Sorbitan-Mono-Oleat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S6760 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Kaliumhydroxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1767 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> Fisher Scientific </td><td> L-4859 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270741 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Trinitro Benzolsulfonsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2297 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Salzsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 320331 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Ethyl Ether </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 472-484 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> 8-um Gewebekulturplatte Einsätze </td><td> BD Biosciences </td><td> 353097 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> 1,5-ml Reaktionsgefäße </td><td> Fischer </td><td> 05-408-129 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> MTT-Reagenz </td><td> Invitrogen </td><td> M6494 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8779 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Qtracker Zelle Labeling Kit (Q-Tracker 655) </td><td> Molecular Probes </td><td> Q2502PMP </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Typ 1-Kollagen </td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8045 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> 12-well-Zellkulturplatten </td><td> BD Biosciences </td><td> 353043 </td><td> Verbrauchsmaterial </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Orbitalschüttler </td><td> New Brunswick einem wissenschaftlichen </td><td> C24 </td><td> Ausrüstung </td&gt; </tr><tr><td> Befeuchteten Inkubator mit Air-5% CO 2 </td><td> Thermo Scientific </td><td> Modell 370 </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Kopfrührer </td><td> IKA </td><td> Visc6000 </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Magnetrührer </td><td> Corning </td><td> PC-210 </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Vakuumexsikkator </td><td> - </td><td> - </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Particle Size Analyzer </td><td> Malvern </td><td> STP2000 Spraytec </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Wasserbad </td><td> Fisher Scientific </td><td> Isotemp210 </td><td> Ausrüstung </td&gt; </tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> Beckman </td><td> Beckman Coulter DU800UV/Visible Spektralphotometer </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Wirbel </td><td> Diagger </td><td> 3030A </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Mikroplatten-Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M2 </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Licht / Fluoreszenz-Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> IX71 </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Olymp </td><td> FV-500 Laser-konfokalen </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Rasterelektronenmikroskop </td><td> Carl Zeiss MicroImaging </td><td> Leo 435 VP </td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Transmissions-Elektronenmikroskop </td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td> Ausrüstung </td></tr></tbody></table>

constructing a collagen hydrogel for the delivery of stem cell-loaded chitosan microspheres

Multipotente Stammzellen hat sich gezeigt, extrem nützlich sein auf dem Gebiet der regenerativen Medizin 3.1. Um jedoch diese Zellen effektiv zu nutzen für die Geweberegeneration, müssen eine Reihe von Variablen berücksichtigen. Diese Variablen umfassen: das Gesamtvolumen und die Oberfläche der Implantationsstelle, die mechanischen Eigenschaften des Gewebes und das Gewebe Mikroumgebung, die die Menge an Vaskularisierung und die Komponenten der extrazellulären Matrix umfasst. Daher müssen die Materialien verwendet, um diese Zellen zu liefern biokompatibel mit einer definierten chemischen Zusammensetzung während eine mechanische Festigkeit, die den Host Gewebe nachahmt. Diese Materialien müssen auch durchlässig für Sauerstoff und Nährstoffe, um einen günstigen Mikroumgebung für Zellen zu befestigen und vermehren können. Chitosan, ein kationisches Polysaccharid mit hervorragender Biokompatibilität, leicht chemisch modifiziert sein und hat eine hohe Affinität mit in vivo binden mackromoleküle 4-5. Chitosan imitiert das Glycosaminoglycan Teil der extrazellulären Matrix, so dass es als Substrat für die Zelladhäsion, Migration und Proliferation funktionieren zu können. In dieser Studie verwenden wir Chitosan in Form von Mikrokügelchen, um Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC) in eine Basis von Kollagen dreidimensionales Gerüst 6 zu liefern. Eine ideale Zelle-zu-Mikrokügelchen-Verhältnis wurde in Bezug auf die Inkubationszeit und-Zelldichte, zu maximale Anzahl der Zellen, die geladen werden erreichen konnte bestimmt. Sobald ASC auf die Chitosan-Mikrokügelchen (CSM) ausgesät werden, werden sie in einer Kollagenmatrix eingebettet und können in Kultur für ausgedehnte Zeiträume beibehalten werden. Zusammenfassend liefert diese Studie eine Methode, um genau zu liefern Stammzellen innerhalb eines dreidimensionalen Gerüst Biomaterial.

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Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Eine große Hürde in der aktuellen Stammzelltherapien ist die Bestimmung der effektivste Methode, diese Zellen zu Wirtsgewebe zu liefern. Hier beschreiben wir eine Chitosan-basierte Methode, die Lieferung effizienter und einfacher in Ansatz ist, während es aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen, ihre Multipotenz aufrecht zu erhalten.

Der Bau einer Kollagen-Hydrogel für die Lieferung von Stem Cell-beladenen Chitosan-Mikrokügelchen

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

constructing-collagen-hydrogel-for-delivery-stem-cell-loaded-chitosan

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K Aufrufe.  United States Army Institute of Surgical Research. Eine große Hürde in der aktuellen Stammzelltherapien ist die Bestimmung der effektivste Methode, diese Zellen zu Wirtsgewebe zu liefern. Hier beschreiben wir eine Chitosan-basierte Methode, die Lieferung effizienter und einfacher in Ansatz ist, während es aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen, ihre Multipotenz aufrecht zu erhalten.

Serie: Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotypische Collagen I Assay: A Temperguss Platform to Cell Verhalten in 3-Dimensional Kontext beurteilen

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Forschung

Biotechnik

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Typ I-Kollagen aus der Haut

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Imaging denaturierten Kollagen-Stränge<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Über die Photo-ausgelöst Hybridisierung von Caged Collagen mimetischen Peptiden

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Synthese einer Intein-vermittelten Protein-Hydrogel Künstliche

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or erosion. Amelogenin has been proven to be a critical protein for controlling the organized growth of apatite crystals. In this paper, we present a detailed protocol for superficial enamel reconstruction by using a novel amelogenin-chitosan hydrogel. Compared to other conventional treatments, such as topical fluoride and mouthwash, this method not only has the potential to prevent the development of dental caries but also promotes significant and durable enamel restoration. The organized enamel-like microstructure regulated by amelogenin assemblies can significantly improve the mechanical properties of etched enamel, while the dense enamel-restoration interface formed by an in situ regrowth of apatite crystals can improve the effectiveness and durability of restorations. Furthermore, chitosan hydrogel is easy to use and can suppress bacterial infection, which is the major risk factor for the occurrence of dental caries. Therefore, this biocompatible and biodegradable amelogenin-chitosan hydrogel shows promise as a biomaterial for the prevention, restoration, and treatment of defective enamel.

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

In this article, we describe a protocol for fabricating an amelogenin-chitosan hydrogel for superficial enamel reconstruction. Organized in situ growth of apatite crystals in the hydrogel formed a dense enamel-restoration interface, which will improve the effectiveness and durability of restorations.

Entwicklung von Amelogenin-Chitosan-Hydrogel für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Emaille Nachwachsen mit einem dichten Schnittstelle

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant exogenous molecular probes into cells. This work reports a microfluidic electroporation platform capable of performing multiple molecule delivery to mammalian cells with precise and molecular-dependent parameter control. The system&#8217;s ability to isolate cells with uniform size distribution allows for less variation in electroporation efficiency per given electric field strength; hence enhanced sample viability. Moreover, its process visualization feature allows for observation of the fluorescent molecular uptake process in real-time, which permits prompt molecular delivery parameter adjustments in situ for efficiency enhancement. To show the vast capabilities of the reported platform, macromolecules with different sizes and electrical charges (e.g., Dextran with MW of 3,000 and 70,000 Da) were delivered to metastatic breast cancer cells with high delivery efficiencies (&#62;70%) for all tested molecules. The developed platform has proven its potential for use in the expansion of research fields where on-chip electroporation techniques can be beneficial.

A microfluidic vortex assisted electroporation platform was developed for sequential delivery of multiple molecules into identical cell populations with precise and independent dosage control. The system&#8217;s size based target cell purification step preceding electroporation aided to enhance molecular delivery efficiency and processed cell viability.

Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Eine injizierbare and Drug belasteten supramolekulares Hydrogel für Lokale Catheter Injection in die Pig Herz

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Der Bau einer Kollagen-Hydrogel für die Lieferung von Stem Cell-beladenen Chitosan-Mikrokügelchen

Zusammenfassung

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