Diese Arbeit wurde von der Universität Basel, Departement Biomedizin und der Schweizerischen National Science Foundation (31003A-116624) gefördert.

Ein. Einrichten Organotypische Cerebellar Scheibe Kulturen Cerebellar Slice-Kulturen aus postnatalen Tag 8 P (8) mit der Maus Welpen mit der statischen Inkubation Verfahren 10 hergestellt. In unserem Labor verwenden wir B6CF1 Mäusen. In einigen Experimenten auch transgene Mäuse wurden verwendet, ausdrücken EGFP selektiv in Purkinje-Zellen. Die Aufstellung von Slice-Kulturen dauert etwa 30 Minuten pro Maus pup, dh 3 Stunden für einen Wurf von 6 Maus Welpen. Alle Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Werkbank mit sterilisierten chirurgischen Instrumente durchgeführt. <ol><li> Das Kleinhirn der Maus P8 Jungtieren wird aus dem Gehirn in eiskaltem Herstellungsmedium (MEM (Gibco Katalog Nr. 11012) mit Glutamax 1:100, pH 7,3) mit einem Stereomikroskop seziert. </li><li> Das Kleinhirn ist in 350 um dicke Scheiben in der sagittalen Ausrichtung mit Hilfe eines McIlwain Gewebe Chopper geschnitten. </li><li> Die Scheiben werden auf Millipore Zellkultur-Inserts (ca.6 Slice platzierts pro Einsatz, Millipore PICM03050) und werden in 6-well Platten mit 0,75 ml pro Vertiefung der Inkubationsmedium (48,35 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml Pferdeserum, 1ml Glutamax I, 0,65 ml einer sterilen 10% Glucose inkubiert Lösung, pH 7,3) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C. Alle Reagenzien Zellkultur wurden von Gibco, Invitrogen. </li><li> Pharmakologische Behandlungen sind in der Regel nach 3 Tagen in vitro (DIV3) durch Zugabe des Wirkstoffes in der gewünschten Konzentration zu dem Kulturmedium gestartet. Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA) und (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG) stammten von Tocris, UK. Da viele Arzneistoffe die Verwendung von DMSO oder Ethanol zur Herstellung einer Stammlösung (zB PMA) erfordern sollte darauf geachtet werden, daß die Gesamtmenge des Lösungsmittels zu dem Kulturmedium zugegeben nicht mehr als 1% (7,5 ul pro Vertiefung) werden. Die Wirkstoffe werden zusammen mit der Änderung des Kulturmediums alle 2. oder 3. Tag erneuert. </li></ol> 2. Fixierung und ImmunosTaining der Organotypische Cerebellar Scheibe Kulturen Ein wichtiger Vorteil ist, dass das Kleinhirn Antikörper verfügbar sind, die spezifisch und helle Verfärbung die prinzipiellen Kleinhirnneuronen, dh Purkinje-Zellen und Körnerzellen. Die dendritischen Morphologie der Purkinje-Zellen können durch Immunfärbung mit Anti-Calbindin D28K enthüllt werden. <ol><li> Zur Fixierung der Kulturen wird das Kulturmedium entfernt und 3 ml kaltem 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) pro Vertiefung werden sorgfältig mit dem Einsatz mit der Millicell zerebelläre Scheiben an der Membran aufgenommen. Die Kulturen werden über Nacht fixiert dann das Fixiermittel entfernt und die Kulturen werden mit Phosphatpuffer gespült. </li><li> Immunfärbung für folgende Antikörper verwendet: Kaninchen-anti-D-Calbindin 28K (Swant, Bellinzona, Schweiz) bei 1:1000 zum selektiven Visualisierung Purkinje-Zellen und monoklonalen Anti-NeuN (Chemicon, Millipore) bei 1:500 zum selektiven Visualisierung Granulatmenle Zellen 12. Rabbit anti-GFP war von Abcam, UK. Fluoreszierenden sekundären Alexa Antikörper wurden von Molecular Probes, Invitrogen. </li><li> Die Kulturen werden permeabilisiert und durch Zugabe von 3% normales Ziegenserum + 0,3% Triton X100 in 0,1 M Phosphatpuffer (Blockierungslösung) blockiert. Anti-Calbindin D28K und Anti-NeuN in Blockierungslösung verdünnt, und die Kulturen werden mit der Lösung, welche die blockierenden Antikörpern über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Rühren inkubiert. Alle Verdünnungen in% (v / v) angegeben, erfolgt Triton X100 aus einer 10% Stammlösung genommen, um Pipettieren erleichtern. </li><li> Die Kulturen werden gespült 3x mit 0,1 M Phosphatpuffer und werden dann mit entsprechenden zweiten Antikörper, z. B. Ziege anti-Kaninchen-Alexa 568 und Ziegen-Anti-Maus-Alexa 488 inkubiert verdünnt 1:500 in 0,1 M Phosphat-Puffer + 0,1% Triton X100 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Kulturen werden dann gespült 3x mit 0,1 M Phosphatpuffer. </li><li> Die gefärbten Scheiben werden aus der Kultur entferntauch mit einem Pinsel und auf Superfrost Plus Objektträger montiert und eingedeckt mit einem geeigneten Eindeckmedium, z. B. Mowiol. Die Kulturen können nun auf einer regelmäßigen Epifluoreszenz-Mikroskop mit Geräten oder mit einem konfokalen Mikroskop betrachtet werden. </li></ol> 3. Anzeigen einzelner Purkinje Zellen in organotypischen Kulturen <ol><li> Nach Immunfärbung mit Calbindin D28k die komplette Zytoplasma der Purkinje-Zellen ist hell einschließlich der Dendriten und dem Axon gefärbt. Aufgrund der dichten Ausrichtung Purkinje Zellen in der Purkinje-Zellschicht werden die dendritischen Dornen von höchstens Purkinjezellen überlappenden was es schwierig macht, das komplette Dorn einer Einzelzelle zu studieren. Aufgrund Zelltod einiger Purkinjezellen während des Herstellungsverfahrens, in vielen Kulturen einige Bereiche vorhanden sind, mit einer reduzierten Dichte von Purkinje-Zellen. In solchen Gebieten ist es möglich, Purkinje-Zellen mit einem vollständigen dendritischen Dorn, der nicht mit anderen c überlappt findenEllen. In diesen Zellen kann die dendritischen arbor betrachtet und analysiert werden in einer Qualität vergleichbar mit einem Golgi-Färbung. Da im Kleinhirn die Purkinje-Zellen der einzige Zelltyp Ausdruck Calbindin D28K sind die Zellen werden auch als Purkinje-Zellen identifiziert. </li><li> Ein alternatives Verfahren ist es, aus Kulturen B6 abgeleitet verwenden; FVB-Tg (pCP2-EGFP) 146.244Yuza / J-Mäusen (hier genannt pCP2-EGFP Mäusen, erhältlich von Jackson Laboratories), die unter dem Ausdruck EGFP Purkinje zellspezifischen Promotor L7 11. In solchen Slice-Kulturen leben Purkinje Zellen visualisiert werden durch die Expression von EGFP. Es ist auch möglich, die dendritische Morphologie einer einzelnen Zelle mit der Zeit folgen. Alternativ können nach Fixation kann EGFP-exprimierende Purkinje-Zellen mit einem Anti-GFP-Antikörper immungefärbt werden. Beide Verfahren eignen sich zur Färbung Dendriten, Zellkörper und Axone der Purkinje-Zellen in organotypischen Kulturen. Weil der L7-Promotor in den pCP2-EGFP Mäusen ist nicht in jedem Purkinje-Zelle exprimiert und es gibt variationen im Frequenzbereich auszudrücken Purkinjezellen zwischen Mäusen (Kapfhammer, Daten nicht gezeigt) schneiden Kulturen von diesen Mäusen abgeleitet erleichtern, zu visualisieren und zu messen Purkinje-Zellen, die dendritischen Bäumen, die mit anderen Purkinjezelle Dendritenbäume überlappen. Solche dendritischen Bäume können einzeln betrachtet werden, wenn die benachbarten Purkinje Zellen mit überlappenden Dendritenbäumen nicht exprimieren GFP (Abbildung 1A, B). </li></ol> 4. Messung der Purkinje Zelle Dendritische Baum Größe und Branch Punkte <ol><li> Dendritenbaum Größe. Mit der Fluoreszenzmarkierung Purkinjezellen die Größe des Dendritenbaum einer gegebenen Zelle kann leicht gemessen werden, wenn der Baum nicht überlappenden mit anderen Zellen werden. Da die Etiketten Calbindin Immunfärbung alle Purkinje-Zellen, kann es schwierig sein, um Zellen mit nicht überlappenden Dendritenbäume identifizieren. In diesem Fall ist die Verwendung des pCP2-EGFP ist empfehlenswert, um die Identifizierung von ausreichender Purkinjezelle vereinfachens bei nichtüberlappenden Dendritenbäume. Sobald ein Purkinje-Zelle mit einem nicht-überlappenden dendritischen Baumes identifiziert wird, wird es mit dem 20fach-Objektiv gesehen wird und ein Bild mit einer Digitalkamera aufgezeichnet. Dieses Bild kann dann mit einem Bildanalyse-Programms analysiert. Wir verwenden Image Pro Plus, das umreißt die Dendritenbaum der Zelle mit einem einzigen Mausklick mit dem Zauberstab-Werkzeug im Messbetrieb (2A) ermöglicht. Das Programm berechnet dann den durch die dendritischen Baumes abgedeckt und exportiert sie in MS Excel. Die statistische Analyse der Daten mit GraphPad Prism Software (siehe unten) erfolgen. </li><li> Anzahl der Verzweigungspunkte. Aufgrund der stark verzweigten und feine Morphologie der Purkinje-Zellen dendritische Ast Punkte müssen manuell gezählt werden. Die 20x-Image-Datei der Purkinjezellen ist so, dass es die meisten der Bildschirm mit Adobe Photoshop deckt erkennen. Dann wird jeder Verzweigungspunkt wird gezählt und mit einem hellen Punkt (Abbildung 2B). </li></ol> Überwachung der Entwicklung der Purkinje Zelle Dendritenbaum während der Anzucht Organotypischen Kulturen aus pCP2-EGFP-Mäusen, die EGFP exprimieren spezifisch in Purkinje-Zellen abgeleitet ermöglichen, um die Morphologie der einzelnen Zellen während mehrerer Tage in Kultur zu untersuchen. Auf diese Weise das Wachstum und die Entwicklung des Dendritenbaum während der Anzucht kann schön dokumentiert. Wohnzimmer identifiziert Purkinje Zellen wurden fotografiert jeden 2. oder 3. Tag während der Anzucht mit dem Objektiv 10x. Diese Low-Power-Ziel wurde gewählt, um zu vermeiden und phototoxische Schädigung der Zellen durch die Beleuchtung mit Leuchtstoffröhren. Abbildung 3 zeigt zwei Beispiele von Purkinje-Zellen im lebenden Kulturen fotografiert. Die erste Zelle wurde aus 2 Tagen in vitro bis zu 7 Tagen in vitro (Abb. 3, AC) gefolgt. Es ist offensichtlich, dass die dendritic Baum dieser Zelle während dieser Zeit wächst mehrere neue Filialen und expandiert in Größe. In dem zweiten Beispiel wurde ein Purkinje-Zelle 4 bis 11 Tagen in vitro (Abb. 3, DF) gefolgt. Der kleine Dendritenbaum anwesend DIV4 expandiert im Wesentlichen während dieser Zeit. Beide Beispiele zeigen, dass die meisten der dendritischen Struktur der Purkinje-Zellen am Ende der Kulturperiode präsentieren tatsächlich in der Kultur zu entwickeln. Entwicklung der Purkinje-Zellen dendritische Baum wird durch PKC oder mGluR1 Stimulation inhibiert Organotypischen zerebelläre Slice-Kulturen wurden für 11 Tage kultiviert. Ab dem 2. Tag in vitro, einige der Kulturen wurden mit entweder PMA (50 nM), einem Phorbolester Stimulieren PKC oder DHPG (10 uM), ein mGluR1 Agonist, behandelt, bis die Kulturen wurden fixiert. Beide Verbindungen wurden bereits zu hemmen und begrenzen Purkinjezelle dendritisches Wachstum 7, 8, 9, 5 dargestellt.In der unbehandelten Kontrolle Scheiben Purkinje Zellen entwickelten eine typische große und hochverzweigte dendritische Baum, visualisiert entweder durch anti-Calbindin Immunfärbung (4A) oder in Kulturen mit EGFP-exprimierende Purkinje-Zellen wurde durch Immunfärbung mit Anti-GFP (4D). In Kulturen mit PMA behandelt die Morphologie der dendritischen Baum wurde grundlegend verändert. Die Dendriten erschien verdickt und hatte nur wenige Seitenzweige. Viele Purkinje-Zellen, anders als in Kontrollkulturen, waren nicht mehr unipolar, mit einer primären Dendrit ausgehenden vom Zellkörper, sondern entwickelt zwei oder noch mehr primären Dendriten (4B, E). Das Gebiet der dendritischen Baumes abgedeckt wurde deutlich reduziert (siehe unten). Eine ähnliche Situation war in DHPG-behandelten Kulturen. Die Dendritenbaum der Purkinje-Zellen wurde stark verkleinert und die Verzweigung wurde deutlich reduziert (4C, F). Allerdings gibt es auch einige qualitative Unterschiede zu PMA-behandelten Kulturen verglichen. Es gab keine Verdickung der dendritischen Äste, und die primären Dendriten durchgeführt vielen sehr kurzen sekundären Dendriten (4C, F) darauf hindeutet, dass die Signalisierungsereignisse los in PMA-behandelten und DHPG Purkinjezellen kann ähnlich, aber nicht identisch. Quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum Größe und Branche Punkten Zur quantitativen Auswertung wird die Größe der Purkinje Zelle Dendritenbaum und die Anzahl der Verzweigungspunkte pro Purkinje Zelle wie oben beschrieben gemessen. Ergebnisse von mindestens drei unabhängigen Experimenten sind zusammen gepoolt und ein Minimum von 20 Zellen analysiert werden müssen. Der Mittelwert des durch die dendritischen Bäume für den Kontrollexperimenten abgedeckt wird bestimmt und als 100% gesetzt und die Werte für die anderen Versuche werden als prozentuale Werte entsprechend ausgedrückt. Die statistische Analyse der Daten mit GraphPad Prism Software durchgeführt. Weil wir nichtangenommen, dass alle Werte bestimmt Teil einer Gaußverteilung sind, verwenden wir statistische Tests, die nicht davon ausgehen kann eine solche Verteilung der gemessenen Werte. Für den Vergleich mehrerer Bedingungen und Tests für die statistische Signifikanz, verwenden wir Kruskal-Wallis-Test nach einem geeigneten Verfahren für Post-Hoc-Tests für Rang-basierte Statistiken folgte, wie z. B. in der Dunns Post-Test in GraphPad Prism umgesetzt. Die Ergebnisse werden in der Regel als Balkendiagramme dargestellt. Ein Beispiel für eine solche statistische Auswertung ist in Abbildung 5 gegeben. Sowohl die Analyse der dendritischen Baumes Größe (5A) und die Anzahl der Verzweigungspunkte pro Purkinje Zelle (5B) zeigen deutliche Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und DHPG oder PMA Behandlung. Beide Parameter waren unterschiedlich mit einer statistischen Signifikanz von p &lt;0,001 nach dem Kruskal-Wallis-Test. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> FiguRE 1. EGFP-markierten Purkinje Zelle. In pCP2-EGFP Mäusen nicht alle Purkinje-Zellen exprimieren EGFP. Daher kann Dendritenbäume einiger Purkinjezellen einzeln betrachtet werden, wenn sie ausdrücklich EGFP (EGFP Kanal in A) und die benachbarten Purkinjezellen mit überlappenden Dendritenbäume nicht (negativ in EGFP Kanal in A gezeigt, positiv in die Anti-Färbung gezeigt Calbindin im roten Kanal in B). Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> Abbildung 2. Messung der Parameter des dendritischen Purkinjezellen. (A). Die Größe des dendritischen Baumes können durch Rückverfolgung der Umriss des Purkinje Zelle mit einem einzigen Mausklick in der Bildanalyse-Software Image Pro plus mit dem Zauberstab-Werkzeug gemessen werden. Der Zauberstab wird so verwendet, dass die gesamte Dendritenbaum einschließlich des Zellsoma und alle dendritischen Zweigen vollständig umgeben von der Linie. (B). Die Zahl der Verzweigungspunkte ist coumanuell in Bilder Purkinjezellen nted. Jeder Knotenpunkt ist mit einem gelben Punkt markiert. Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> Abbildung 3. Überwachung der Entwicklung der Purkinje Zelle dendritischen Baumes. Identifizierte Purkinje Zellen wurden wiederholt, um das Wachstum der Dendriten zu überwachen fotografiert. (AC): Dendritische Baum einer Purkinje Zelle wächst und entwickelt sich von Tag in vitro (DIV) 2 bis DIV7. Es gibt kontinuierliche Wachstum und Verzweigung der Dendriten während dieser Kulturperiode. (DF): Dendritische Baum einer Purkinje-Zelle wächst und entwickelt von DIV4 bis DIV11. Die dendritische Struktur erweitert Wesentlichen während dieser Kultur Zeitraum. Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> Abbildung 4. Entwicklung der Purkinje-Zellen dendritische Baum wird durch PKC oder mGluR1 stimulati gesperrtauf (A), (D):. Unbehandelte Kontrollzellen mit einem gut entwickelten Dendritenbaum. (B), (E): Nach 9 Tagen nach PMA-Behandlung Dendriten erscheinen verdickt und der Dendritenbaum ist stark in Größe verringert. Cells verlieren oft ihre Polarisation und werden bipolar (E). (C), (F): Nach 9 Tagen nach DHPG Behandlung das dendritische Baum stark verkleinert. Anders als in der PMA-Behandlung, sind viele sehr feinen und kurzen vorliegende Seitenäste an den primären und sekundären Dendriten. Cells verlieren oft ihre Polarisation und werden bipolar (F). Purkinje Zellen wurden durch Anti-Calbindin Immunfärbung visualisiert (A - C) und durch EGFP-Expression in Kulturen aus pCP2-EGFP Mäuse in (D - F) abgeleitet wird. Maßstab = 50 um. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> Abbildung 5. Quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum Größe und Verzweigung. Quantitative Messungen zeigen, dass sowohl Dendritenbaum Größe (obere Balken) und die number von Verzweigungspunkten (untere Balken) sind stark nach PMA oder DHPG Behandlung reduziert. Unterschiede zwischen Kontroll-Dendritenbäumen und dendritischen Bäume Purkinje Zellen von behandelten Kulturen waren signifikant mit p &lt;0,001.

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	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li><li>Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+slice+cultures.">Cerebellar slice cultures.</a> Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).</li><li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. 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Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates vom 24. November 1986 (86/609/EWG) durchgeführt und wurden überprüft und zugelassen durch die Schweizer Behörden. Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier vorgestellten Verfahren ermöglichen Purkinjezelle dendritische Entwicklung in organotypischen zerebelläre Schnittkulturen studieren und quantitativ auszuwerten Purkinjezelle dendritischen Expansion durch Messen Dendritenbaum Größe und die Anzahl der dendritischen Verzweigungspunkte. Natürlich ist ein umfangreicher und ausgefeilte quantitative Analyse von Purkinje-Dendriten möglich, z. B. durch Bestimmung der gesamten dendritischen Länge, Durchführen einer Analyse oder Sholl Bestimmung der fraktalen Dime...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Zellkultureinsätze </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> Die PICMORG50 Einsätze haben einen niedrigen Rand und ermöglichen die Anzeige von Live-Kulturen an einem Mikroskop </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medum Adler </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-Dihydroxy-phenylglycin (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-Calbindin D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Anti NeuN, Klon A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

Purkinje-Zellen sind ein attraktives Modell für die Untersuchung dendritischen Entwicklung, weil sie eine beeindruckende Dendritenbaum die streng ausgerichtet ist in der Sagittalebene und entwickelt vor allem in der postnatalen Phase bei kleinen Nagern 3 haben. Darüber hinaus sind mehrere Antikörper zur Verfügung, die gezielt und intensiv Label Purkinje Zellen, einschließlich aller Prozesse, mit anti-Calbindin D28K die am meisten verbreitet. Zum Betrachten von Dendriten in lebenden Zellen sind Mäuse, die EGFP selektiv in Purkinje-Zellen 11 bis Jackson Labs zur Verfügung. Organotypische Kleinhirn Slice-Kulturen Zellen ermöglichen eine einfache experimentelle Manipulation der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung, weil die meisten der dendritischen Ausbau der Purkinje Zelle Dendritenbaum tatsächlich stattfindet während der Anzucht 4. Wir stellen Ihnen hier eine kurze, zuverlässige und einfach Protokoll für Ansicht und Analyse der dendritischen Morphologie der Purkinje-Zellen im organotypi gewachsenc Kleinhirn Slice-Kulturen. Für viele Zwecke ist eine quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum wünschenswert. Wir konzentrieren uns hier auf zwei Parameter, Größe und Dendritenbaum Verzweigungspunkt Zahlen, die sich schnell und einfach von anti-Calbindin gebeizt zerebelläre Schnittkulturen bestimmt werden kann. Diese beiden Parameter ergeben eine zuverlässige und empfindliche Messung der Veränderungen des Purkinjezelle Dendritenbaum. Am Beispiel der Behandlungen mit der Proteinkinase C (PKC) und der Aktivator PMA metabotropen Glutamat-Rezeptor 1 (mGluR1) zeigen wir, wie Unterschiede in der dendritischen Entwicklung visualisiert und quantitativ bewertet werden. Die Kombination des Vorhandenseins eines umfangreichen Dendritenbaum, selektive und intensive Immunfärbung Methoden organotypischen Kulturen, die die Periode des dendritischen Wachstums und einem Mausmodell Deckel mit Purkinje zellspezifische Expression EGFP machen Purkinjezellen ein leistungsfähiges Modellsystem für enthüllt die Mechanismen der dendritischen Entwicklung.

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Wir präsentieren ein Protokoll, das zu sehen und zur quantitativen Beurteilung der Morphologie der dendritischen Baumes der einzelnen Purkinje-Zellen im Kleinhirn organotypischen Slice-Kulturen angebaut erlaubt. Dieses Protokoll soll Studien zu den Mechanismen der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung zu fördern.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

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18.4K Aufrufe.  University of Basel. Wir präsentieren ein Protokoll, das zu sehen und zur quantitativen Beurteilung der Morphologie der dendritischen Baumes der einzelnen Purkinje-Zellen im Kleinhirn organotypischen Slice-Kulturen angebaut erlaubt. Dieses Protokoll soll Studien zu den Mechanismen der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung zu fördern.

Serie: The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Forschung

Neurowissenschaften

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.