Organotypische Scheibenkultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um neuroentwicklungsfördernde und degenerative oder regenerative Prozesse zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um Kandidatenmoleküle schnell auf ihr neuroprotektives Potenzial zu untersuchen. Diese Methode imitiert in vivo-Bedingungen im Vergleich zu dissoziierten primären Zellkulturen eng, da die Gewebesatzarchitektur und die nativen Zell-Zell-Verbindungen innerhalb der Ebenen der Abschnitte erhalten bleiben.
Hier zeigen wir die Untersuchung des Purkinje-Zelltodes im sich entwickelnden Kleinhirn. Aber die organotypische Scheibenkultur eignet sich gleichermaßen, um neurodegenerative Erkrankungen in fast jeder Region des zentralen Nervensystems zu modellieren. Das Verfahren mit Jennifer Rakotomamonjy demonstriert Sean McDermott, ein Techniker aus meinem Labor.
Vor der Ernte der Kleinhirnscheiben, in einem sterilisierten Biosicherheitsschrank, füllen Sie jeden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Kulturplatte mit einem Milliliter vakuumgefilterten Kulturmedium, und fügen Sie das pharmakologische Mittel von Interesse zu den Behandlungsbrunnen, und ein gleiches Volumen des Fahrzeugs zu den Kontrollbrunnen. Mit sterilen Zangen, legen Sie eine 0,4-Mikrometer Porengröße PTFE Membranfilter-Einsatz in jedem Brunnen, wobei darauf geachtet wird, Blasen an der Schnittstelle jeder Membran und des Mediums zu vermeiden, und das Medium in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator für zwei Stunden ausdemieren. Um das Kleinhirn zu ernten, verwenden Sie gerade Dressing Zangen, um den Welpenkopf an der Nase zu greifen, und verwenden Sie gerade Augenschere, um die Kopfhaut vom hinteren Ende seitlich bis zur Mittellinie zu schneiden.
Schneiden Sie den Schädel auf die gleiche Weise, zeigen Sie die Scherenspitzen nach außen, um eine Beschädigung des Kleinhirns zu vermeiden, und verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn auf eine 60-Millimeter-Schale mit kaltem HBSS und fünf Milligramm pro Milliliter Glukose zu übertragen. Verwenden Sie die geraden Verbandszangen, um das Kleinhirn sorgfältig zu sezieren, und verwenden Sie sterile gekrümmte feine Zangen, um das Gewebe auf eine Kunststoffscheibe auf dem Schneidtisch eines Gewebehäckslers zu legen. Drehen Sie den Schneidtisch, um das Gewebe zu orientieren, um die Erfassung von parasagittalen Abschnitten zu ermöglichen, und ziehen Sie den Tischfreigabeknopf nach rechts, um den Schneidtisch zu bewegen, bis die Klinge am Rand des Gewebes positioniert ist.
Passen Sie dann die Scheibendicke auf 350 Mikrometer und die Klingengeschwindigkeit auf Mittel an, und starten Sie den Chopper. Wenn das ganze Kleinhirn in Scheiben geschnitten wurde, schalten Sie den Chopper aus. Mit sterilen Zangen halten Sie die Scheibe über eine neue 60-Millimeter-Schale.
Verwenden Sie eine Transferpipette, um HBSS plus Glukose über die Scheibe zu spülen, so dass die Scheiben in die Schale fallen. Wenn Sie dann die Proben so minimal wie möglich berühren, verwenden Sie eine Mikrosonde, um die Scheiben zu trennen. Verwenden Sie die Transferpipette, um Abschnitte des Kleinhirns in der Nähe der Vermis auf einzelne Zellkultureinsätze in der Sechs-Well-Platte auszuwählen, und verwenden Sie die Mikrosonde, um die Scheiben in der Mitte jedes Inserts zu positionieren.
Wenn alle Scheiben platziert wurden, saugen Sie sorgfältig überschüssige HBSS plus Glukose an und geben Sie die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurück. Für Die Immunfluoreszenzfärbung entfernen Sie den Überstand aus jedem Brunnen und waschen Sie die Einsätze mit PBS. Fixieren Sie die Scheiben mit einem Milliliter kaltem 4%Paraformaldehyd im Brunnen jedes Einsatzes und 500 Mikroliter auf jedem Einsatz für eine Stunde.
Am Ende der Fixierung die Einsätze viermal für 10 Minuten mit einem Milliliter frischer PBS unter jedem Einsatz und 500 Mikroliter frischer PBS auf jedem Einsatz pro Wäsche auf einem Orbital-Shaker waschen. Füllen Sie jeden Brunnen einer 24-Well-Platte mit 500 Mikroliter PBS-TB vor und übertragen Sie mit einem Pinsel die Kleinhirnscheiben aus jedem Zellkultureinsatz in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte. Permeabilisieren und blockieren Sie die Scheiben bei Raumtemperatur für eine Stunde.
Am Ende der Inkubation die Zellen mit 200 Mikrolitern des primären, in PBS-TB verdünnten primären Biots pro Brunnen über Nacht bei vier Grad Celsius auf dem Orbitalshaker beschriften. Am nächsten Morgen die Scheiben viermal für 10 Minuten und 500 Mikroliter frische SB-PBS pro Wäsche auf dem Shaker waschen, bevor sie die Proben mit den entsprechenden fluorophorkonjugierten Sekundärantikörpern zwei Stunden lang bei Raumtemperatur auf dem Shaker, vor Licht geschützt, beschriften. Am Ende der Inkubation die Abschnitte mit 500 Mikrolitern eines geeigneten Kernflecks pro Brunnen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt, gegenstainieren.
Und verwenden Sie eine Transferpipette, um die Scheiben auf Glasschlitten zu montieren. Dann lassen Sie die Abschnitte vollständig trocknen, bevor Sie mit PBS rehydrieren und die Gewebe mit Abdeckungen beschichten, die mit ca. 80 Mikroliter Montagemedium beschichtet sind. Sobald das Montagemedium ausgehärtet ist, sind die Kleinhirnabschnitte abgefertigt.
Am sechsten Tag der Postnatale ist das Überleben der Purkinje-Zellen in den Kontrollproben gering, was mit ihrem bekannten Verwundbarkeitsfenster übereinstimmt. Das Überleben steigt, wenn das Spendertier älter wird und diese kritische Periode beendet. Die Behandlung von Kleinhirnscheiben mit einer hohen Konzentration von Kaliumchlorid führt zu einer erfolgreichen Induktion ihrer Depolarisation und ihres Überlebens.
Um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, gesunde Kleinhirnabschnitte auszuwählen und das Kultur-Setup so effizient wie möglich durchzuführen. Postkulturanwendungen gehen über die Immunfluoreszenz hinaus. Als organotypische Scheiben können für Genomproteinexpressionsstudien und zur Überwachung der neuronalen Schaltkreisaktivität mittels Elektrophysiologie und Kalzium-Live-Bildgebung verwendet werden.
