Diese Methode ermöglicht es, den grundlegenden Mechanismus der Myelinisierung und Remyelination auf zellulärer und tissularer Ebene zu studieren. Diese Technik ist an der Kreuzung zwischen Primärkulturen und In-vivo-Ansätzen. Es ist ein schnelles und zugängliches Modell mit dem Hauptvorteil, die Gewebearchitektur zu erhalten.
Demonstriert wird das Verfahren von Melina Thetiot, einer Postdoktorandin, und Remi Ronzano, einer Doktorandin aus meinem Labor. Um zu beginnen, legen Sie eine kleine Schere sanft in das Foramen Magnum und schneiden Sie den Schädel durch einen seitlichen Schnitt zur Seite, und dann um den Kopf Schädel schneiden. Um den dorsalen Teil des Schädels zu bergen, verwenden Sie eine feine, gerade Zange, um den dorsalen Teil des Schädels vorsichtig zu heben.
Dann führen Sie vorsichtig die Zange zwischen dem ventralen Schädel und dem Gehirn ein. Heben Sie das Gehirn sanft aus und schneiden Sie die optischen und trigeminalen Nerven mit einer kleinen Schere. Als nächstes drehen Sie den Kopf oder den dorsalen Teil des Schädels auf den Kopf knapp über einer 60-Millimeter-Zellkulturschale, die eiskaltes Dissektionsmedium enthält, um dem Gehirn zu helfen, durch die Schwerkraft zu fallen.
Mit feinen Zangen, orientieren Sie das Gehirn mit der dorsalen Seite nach oben und die ventrale Seite liegend. Verwenden Sie unter dem binokularen Mikroskop die feinen, geraden Zangen, um das Gehirn auf der Vorhirnseite zu immobilisieren. Dann trennen Sie das Hinterhirn vom Rest des Gehirns.
Schneiden Sie die Kleinhirn-Pedunkel unter dem Kleinhirn, um das Kleinhirn vom Rest des Hinterhirns zu trennen. Sobald das Kleinhirn isoliert ist, verwenden Sie feine, gerade Zange, um vorsichtig die Meningen wegzureißen. Halten Sie das Kleinhirn vorsichtig mit den feinen, gekrümmten Zangen und legen Sie es mit der Dorsalseite auf die Kunststoffplattform, senkrecht zur Chopper-Rasierklinge.
Als nächstes, mit einer sterilen, dünnen Endpipettenspitze, die an einer Ein-Milliliter-Pipette befestigt ist, aspirieren Sie jeden Zugang des Sezierensmediums um das Kleinhirn. Dann, mit einem Gewebe-Chopper, schneiden 300 Mikrometer dicke saggital Abschnitte des Kleinhirns. Als nächstes fügen Sie einen Tropfen Seziermedium auf das in Scheiben geschnittene Kleinhirn sanft.
Dann, mit einer breiten Eber-Pipette-Spitze an der ein Milliliter Pipette befestigt, langsam das geschnittene Kleinhirn ansaugen und in die 60-Millimeter-Zellkulturschale mit eiskaltem Dissektionsmedium zurückübertragen. Verwenden Sie als Nächstes zwei feine, gerade Zangen, um einzelne Scheiben zu trennen. Dann, mit einer breiten Eber Pipettenspitze an der ein Milliliter Pipette befestigt, übertragen bis zu vier ausgewählte Scheiben aus der Vermis, zusammen mit einigen Seziermedium auf eine Kultur-Einsatz einer sechs Brunnenplatte.
Entfernen Sie jeden Zugriff auf das Seziermedium um die Scheiben mit einer dünnen Endpipettenspitze. Für die Entmyzination entfernen Sie alle Kulturmittel unterhalb der Kultureinsätze nach sechs Tagen in vitro, und ersetzen Sie es durch einen Milliliter pro Brunnen des vorgewärmten, frischen Kulturmediums mit 0,5 Milligramm pro Milliliter LPC. 15 bis 17 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung inkubieren.
Waschen Sie die Einsätze nach der Inkubation, indem Sie sie in eine 25-Milliliter-Petrischale mit einem Milliliter vorgewärmtem Kulturmedium legen. Dann übertragen Sie sofort die Kultureinsätze in eine neue, sechs Brunnenplatte, die frisches, vorgewärmtes Kulturmedium enthält. Um mit der Immunhistochemie zu beginnen, verwenden Sie zunächst Zangen, um Kultureinsätze zu heben und das Darunter zu entfernen.
Dann fügen Sie zwei Milliliter 4%PFA in 1x PBS, ph 7.4, auf die Membraneinsätze, um die Kleinhirnscheiben zu fixieren. Nach 30 Minuten die Scheiben dreimal mit zwei Millilitern 1x PBS für 10 Minuten waschen. Als nächstes, unter dem binokularen Mikroskop, mit einer 25x bis 30x Vergrößerung, verwenden Sie ein Skalpell oder eine Bürste, um die Scheiben vorsichtig von den Membraneinsätzen zu lösen.
Dann verwenden Sie eine Bürste, um die schwimmenden Scheiben in die Brunnen einer vier Brunnenplatte zu übertragen, die 1x PBS enthält, um den Antikörperverbrauch zu begrenzen. Dann die PBS von jedem Brunnen absaugen und die Scheiben in vorgekühltem 100%Ethanol bei minus 20 Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation das 100%ethanol ansaugen und die Scheiben kurz mit 1x PBS waschen.
Dann waschen Sie sie zweimal bei Raumtemperatur mit 1x PBS für 10 Minuten jede Wäsche. Um unspezifische Antikörper-Fixierungsstellen zu blockieren, saugen Sie die PBS an und inkubieren Sie die Scheiben in einer Lösung, die 1x PBS, 5%NGS und 0,3% nicht ionisches Reinigungsmittel bei Raumtemperatur für 30 bis 45 Minuten enthält. Als nächstes fügen Sie primäre Antikörper in der Blockierlösung verdünnt und inkubieren die Scheiben bei vier Grad Celsius über Nacht.
Nach der nächtlichen Inkubation die Scheiben dreimal mit 1x PBS für 10 Minuten waschen. Dann fügen Sie die sekundären Antikörper, in der Blockierlösung verdünnt, bei einem bis 500 Verdünnungsverhältnis und inkubieren die Scheiben bei Raumtemperatur im Dunkeln für drei Stunden. Nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper die Scheiben dreimal in 1x PBS im Dunkeln für jeweils 10 Minuten waschen.
Anschließend, unter einem binokularen Mikroskop, legen Sie 100 Mikroleter von 1x PBS auf den Schlitten und mit einem Pinsel, übertragen Sie die Scheiben in das PBS und glätten Sie sie auf dem Dia. Entfernen Sie den Zugriff auf PBS. Schließlich einen Tropfen Montagemedium direkt auf den Glasdeckelschlupf legen und die Scheiben vorsichtig bedecken.
Myelin-Immunostainings in organotypischen Kleinhirnscheiben, die aus den postnatalen Tagen 9 bis 10 C57 erhalten wurden, wurden an 11 Tagen in vitro mit Knoten von Ronvia, angereichert mit spannungsgebundenen Natriumkanälen, begleitet von der paranodalen axoglialen Kreuzungsdomäne, beobachtet. Die gleichen Ergebnisse wurden bei transgenen PLP-GFP-Mäusen beobachtet. Die Myelinisierung der parkengy Zellen wird meist nach einer Woche in der Kultur erreicht.
Die LPC-Behandlung entmyeliniert die Scheiben, die sich spontan remyeliieren und sechs Tage nach der Demyelination vollständig myeliniert werden. Dieses Verfahren sollte maximal 25 Minuten dauern. Das ist wirklich der kritischste Punkt.
Organotypische Scheibenkultur eignen sich für live bildgebende Studien der Myelinisierungsdynamik. Es kann auch für die Ausrichtung auf Drogen-Screening-Experimente verwendet werden. Diese Technik ermöglicht einen einfachen, quantitativen Ansatz zur Untersuchung von Myelinisierungs- und Remyelinationsprozessen.
Die Experimentatoren sollen die grundlegenden Sicherheitsverfahren für den Tierschutz, die übermäßige und scharfe Myelinisierung befolgen.
