Diese Arbeit wurde vom Office of Naval Research über US Naval Research Laboratory Kern Mitteln gefördert.

1. LNA-Sonden und experimentelles Design <ol><li> Design-LNA-Sonden, die die umgekehrte Ergänzung Ihres transkribiert sRNA / mRNA sind oder sie an kundenspezifische <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Wenn Sie die benutzerdefinierte Design-Option, werden Sie wissen, die Reihenfolge, nicht aber die LNA spiking Muster. Die Zugabe von jeweils LNA Rückstand in eine DNA-oder RNA-Oligonukleotid führt zu einem Anstieg in T m zwischen zwei und 10 ° C für eine LNA-RNA-Hybridisierung Duplex-14. Idealerweise sollte die entworfen LNA-Sonden zwischen 20-25 Nukleotide lang (länger Sonden sind schwieriger zu synthetisieren) sein und eine T m zwischen 85-90 ° C für die RNA-Hybridisierung. </li><li> Nach dem Entwurf der Sequenz verwenden BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> oder vergleichen Sie die Sondensequenz auf Ihre lokale Datenbank, um sicherzustellen, wird die Sonde spezifisch nur auf Ihre sRNA / mRNA des Interesses. </li><li>Bei der Bestellung der LNA-Sonde, fügen Sie ein Biotin-TEG Modifikation der 5 &#39;Ende der LNA-Oligonukleotid. Die Biotinylierung ist notwendig für Post-Hybridisierung Färbung mit einem Streptavidin-Farbstoff-Konjugat. Es ist möglich, diese Modifikation zu den 3 Add &#39;end if notwendig, aber die zusätzlich zu den 5&#39; Ende ist weniger teuer und sollte in höheren Ausbeuten führen. </li><li> Drei negative Kontrollen sollten in das Verfahren einbezogen werden: (i) a &#39;no LNA&#39; control, in dem ein LNA-Sonde nicht während der Hybridisierung wird hinzugefügt, (ii) ein &quot;Nein Farbstoff der Kontrolle, in dem der LNA-Sonde ist es, die hybridisierten Ziel sRNA aber die Hybridisierung Veranstaltung ist nicht durch das Fehlen des fluoreszierenden Fleck, erkannt und (iii) ein &quot;Nicht-Ausdruck sRNA / mRNA-Steuerelement, das ein LNA-Sonde, die eine nicht vorhandene oder nicht ausgedrückt sRNA, um Ziele nutzt Nicht-spezifische Hybridisierung zu überwachen. </li><li> Die spezifischen LNA-Sonde hier ist komplementär zu den sRNA CsrB und hat die Sequenz 5&#39;-Biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 &#39;(LNA Monomeren inGroßbuchstaben). </li><li> Nach Erhalt der lyophilisierten LNA, mit Nuklease-freiem Wasser auf 50 pg / mL und speichern resuspendieren in 10-20 ul Aliquots bei -20 ° C. </li></ol> Lösungen <ul><li> 8% paraformaldehye (PFA), 10% Essigsäure in PBS: Mix 1 mL 32% pfa, 400 ul Essigsäure, 400 ul 10X PBS, pH = 7,4 und 2,2 ml Nuklease-freies Wasser. Für gefrorenen Aliquots, in einmaligen Gebrauch bei -20 ° C ohne Essigsäure einfrieren. </li><li> 60% Dextransulfat-Lösung: add 6,0 ​​g Dextransulfat zu einem 50 ml konischen Röhrchen und Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 mL. Hitze dieses Gemisch auf 65 ° C in einem Wasserbad, bis die Dextransulfat gelöst ist (konnte 1-2 Stunden dauern). Zusätzliches Wasser Möglicherweise müssen Sie während der Solubilisierung hinzugefügt werden, um eine 10 ml Volumen zu erhalten. Aliquot der 60% Dextransulfat-Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li></ul> 2. Fixierung <ol><li> Ernte 1x10 8 Zellen der Biolumineszenz <em&gt; Vibrio campbellii oder Ihre Bakterien von Interesse und übertragen Sie sie in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. Diese Menge von Zellen bietet genügend Ausgangsmaterial für vier Flow-FISH-Proben (eine bestimmte LNA-Sonde Probe und drei negative Kontrollen). Zusätzliche 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Aliquots sollten dann erhoben, wenn andere sRNA / mRNA-Spezies getestet werden müssen. </li><li> Pellet die Bakterienzellen durch Zentrifugation bei 2300 xg für 5 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette, und Zellen in 400 ul 1X PBS. </li><li> Zu dieser Mischung werden 400 ul einer 8% paraformaldehye (pfa) und 10% Essigsäure in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (1X PBS), gut mischen und inkubieren für 10 Minuten bei 25 ° C Mischen einmal nach fünf Minuten. Alle Inkubationen, sofern nicht anders angegeben, sind in einem beheizten Rohr Halter durchgeführt. Die pfa Lösung sollte frisch zubereitet werden oder verwendet werden von gefrorenen Aliquots nach der Zugabe von Essigsäure. Paraformaldehyd ist ein Vernetzer Fixativ, dass hELPS zu bewahren Zellmorphologie und behalten intrazellulären RNA. </li><li> Pellet die Zellen aus diesem Gemisch durch Zentrifugation bei 4500 xg für 2 Minuten und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Alle künftigen Schritte, die Zentrifugation benötigen, sollten die gleichen Einstellungen (7K, 2 min). Es ist wichtig, dass nach Zentrifugation beachten Sie die Überstände durch Pipettieren und Dekantieren nicht entfernt werden sollte. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit 400 ul 1X PBS resuspendieren und die endgültige Zellpellet in 400 ul 1X PBS. Die Zellen sind nun behoben und kann bei 4 ° C in 400 ul 1X PBS für bis zu sieben Tage gelagert werden. </li></ol> 3. Diethylpyrocarbonat Behandlung <ol><li> Bereiten Sie 400 ul einer 0,1% igen Lösung von Diethyl-(DEPC) in 1X PBS (400 ul dieser Lösung ist für jede zu untersuchende Probe so Skala entsprechend werden benötigt). Die DEPC-Lösung sollte frisch zubereitet von einem DEPC Lager sein. DEPC-Behandlung inaktiviert RNasen durch carbethoxylation und verringert dieHintergrund-Signal. </li><li> Zugabe von 400 ul der 0,1% DEPC-Lösung in jede feste Bakterienzelle Probe und mischen Sie gut durch Pipettieren. Inkubieren dieser Mischung bei 25 ° C für 12 Minuten. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 400 ul 1X PBS, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li></ol> 4. Permeabilisierung <ol><li> Add 1,0 mg Lysozym auf 1 ml Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) für eine 1,0 mg / ml Lösung. Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden. Add 800 ul der 1 mg / mL Lysozym-Lösung zu den Zellen, mischen durch Pipettieren und Inkubieren bei 25 ° C für 30 Minuten unter gelegentlichem Mischen. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Lysozym wirkt als Permeabilisierung Reagenz durch Hydrolyse der Peptidoglycan in bakteriellen Zellwänden. </li><li> Bereiten Sie eine 3,0 pg / ml-Lösung von Proteinase K in TE-Puffer. Diese Lösung sollte hergestellt aus einer 20 mg / ml Proteinase K Aktie, die bei -20 ° C gelagert wird frischProteinase K ist eine Serin-Protease, die eine Vielzahl von Proteinen verdaut und hilft die Zugänglichkeit der Sonden und Reagenzien an die RNA. </li><li> Add 800 ul des 3,0 ug / ml Proteinase K-Lösung auf das Zellpellet und gründlich durch Pipettieren. Inkubation bei 25 ° C für 15 Minuten mit Vortexen auf halbem Weg durch die Inkubation. </li><li> Pellet der Zellen (7K, 2 min), entfernen Sie den Überstand und die Zellen werden einmal mit 400 ul 1X PBS. Nach dem Entfernen der Wäsche Überstand, die Zellen in 400 ul 1X PBS und 100 ul der Resuspension in vier neue 1,5 ml Reaktionsgefäße. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li></ol> 5. Hybridisierung <ol><li> Bereiten Sie 100 ul Hybridisierungspuffer (HB) für jede Probe. Das HB ist von 50% Formamid nach Volumen, 10% Dextransulfat Masse (add 16,7 ul der 60% Dextransulfat-Lösung für alle 100 ul), 1X Denhardt-Lösung, 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 gestellt,2X Natriumcitrat (SSC), 20 ug gescherte Lachssperma-DNA (SSSD) und 20 ug Hefe-tRNA. </li><li> Jede der Komponenten des HB hat einen anderen Zweck. Formamid senkt die Schmelztemperatur von Nukleinsäureduplexe dabei helfen, mit Denaturierung der RNA und die Minimierung von Zellschäden. Dextransulfat ist als Volumen-ohne Polymer, um die Sonde zu konzentrieren und steigern die Hybridisierung Rate verwendet. Denhardts Lösung, Hefe-tRNA und SSSD als Blocker dienen, um unspezifische Bindung zu reduzieren. </li><li> In jedem der Zelle Resuspension-Gehalt von 1,5 mL Reaktionsgefäße, fügen Sie 95 ul HB und 5,0 ul der sRNA / mRNA-spezifische LNA [20 pmol der spezifischen LNA Endkonzentration] oder Wasser (für die keine LNA Negativ-Kontrolle). Zum Beispiel: <ol class="lalpha"><li> Rohr 1 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA / mRNA-spezifische Sonde </li><li> Rohr 2 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA / mRNA-spezifischen Sonde (&quot;kein Farbstoff&quot; Negativ-Kontrolle) </li><li> U-Bahn 3 bis 95 ul HB + 5,0 ul sRNA/ MRNA-Sonde (&quot;non-Ausdruck sRNA / mRNA&quot; Negativ-Kontrolle) </li><li> Rohr 4 bis 95 ul HB + 5,0 ul Wasser (&#39;no LNA &quot;Negativ-Kontrolle) </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Inkubieren Sie alle vier Proben bei 60 ° C für 60 Minuten. Die Hybridisierung ist abhängig von der LNA-Sonde (n) T m und sollte bei ca. 30 ° C eingestellt werden unterhalb der prognostizierten T m für die RNA-Glühen. Sowohl die erhöhte Hybridisierungstemperatur und Formamid im HB sorgt für die Denaturierung von Sekundärstruktur des sRNA oder mRNA des Interesses. </li></ol> 6. Post-Hybridisierung wäscht <ol><li> Nach der Hybridisierung 1,0 ml 0,1 × SSC mit 0,1% Tween-20 (SSCT), um die Hybridisierung Mischung. Dies ist notwendig, damit die Zellen aus der zähen Hybridisierungslösung entfernt werden. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li><li> Geben Sie 200 ul von 50% Formamid, 2X SSC, 0,1% Tween-20, die Zellpellets, gründlich mischen und incubaß für 30 Minuten bei 65 ° C in einem Heizblock. </li><li> 1 ml 0,1 × SSCT auf die Mischung, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li><li> Add 500 ul 0,1 X SSCT, um die Zellen zu resuspendieren, Inkubation für 40 Minuten bei 65 ° C in einem Heizblock. Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li></ol> 7. Blocking und Färbung <ol><li> Bereiten Sie die Blocking-Puffer (BB) und die Streptavidin-Farbstoff-Färbelösung. Bereiten Sie eine 1X BB-Lösung aus einer 5fach-Aktie (im Handel erhältlich, siehe Reagenzien). Für jede Gruppe von vier Röhren, bereiten 1,2 ml 1X BB. </li><li> Geben Sie 200 ul 1X BB auf die Zellpellets, resuspendieren und Inkubation für 30 Minuten bei 25 ° C. </li><li> Ein Streptavidin-konjugierten Farbstoff wird verwendet, um die biotinylierten LNA-Sonden erkennen. Während blockieren, bereiten eine Lösung von 2 pg / mL DyLight 488 Streptavidin oder die gewünschte Farbstoff-Streptavidin-Konjugat in 1X BB für 30 min (für drei Proben, machen 300 ul). </li><li> Nach incubarbeit mit 1X BB-, Pellet-Zellen (7K, 2 min) und Überstand. Dann werden 50 ul der Streptavidin-Farbstoff-Lösung, die Zellpellets, mischen und inkubieren für 12 Minuten bei 25 ° C unter ständigem Mischen auf einem Vortex oder in einem Thermomixer. Für die &quot;keinen Farbstoff der Kontrolle, mit 50 ul 1X Blockierungspuffer nur. Für den Rest des Protokolls zum Schutz der Rohre von Licht mit Aluminiumfolie. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal mit 500 ul 0,1 X SSCT Puffer und einmal mit 400 ul 1X PBS mit 0,1% Tween-20 (PBST). Pellet der Zellen (7K, 2 min) und Überstand. </li><li> Nach der ersten Streptavidin-Konjugat-Färbung, wird das Signal durch die Einführung eines biotinylierten Anti-Streptavidin Antikörpers an die Streptavidin-Farbstoff-Konjugat und dann Färbung ein zweites Mal mit dem Streptavidin-Farbstoff erhöht so die Signalausgabe pro hybridisierte LNA-Sonde (Abbildung 2) verstärkt . </li><li> Geben Sie 100 ul von 1 pg / mL biotinylierten Anti-Streptavidin-Antikörper in 1X PBS, resuspend die Zellen, und Inkubieren bei 25 ° C für 30 Minuten unter gelegentlichem Mischen. Pellet der Zellen (7K, 2 min), entfernen Sie den Überstand und waschen zweimal mit 400 ul 1X PBST. </li><li> Dann werden 50 ul der 2 pg / mL Streptavidin-Farbstoff-Lösung zu den Zellen, mischen und inkubieren für 12 Minuten bei 25 ° C unter ständigem Mischen auf einem Vortex oder in einem Thermomixer. Für die &quot;keinen Farbstoff der Kontrolle, mit 50 ul 1X Blockierungspuffer nur. </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal mit 500 ul 0,1 X SSCT Puffer und einmal mit 400 ul 1X PBST. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 200 ul 1X PBST und lagern bei 4 ° C, bis sie zur Durchflusszytometrie. Für kleinere Bakterienzellen stellen Sie den Durchfluss zu langsam, um den Kern verkleinern. Darüber hinaus ist für Durchflusszytometer mit Vorwärtsstreuung Schwelle Abschaltungen, muss die Grenzfrequenz so niedrig wie möglich eingestellt werden, um sicherzustellen, dass die kleinen bakteriellen Zellen erkannt werden. </li><li> Für DyLight 488 Erkennung, sollte das Durchflusszytometer mit einem 488 nm Laser-und Standard-Emission ausgestattet werdenFilter für FITC. Mindestens 2x10 4 Ereignisse gesammelt werden sollten. Um die Kompatibilität mit Durchflusszytometer mit verschiedenen Lasern ausgestattet ist, können andere Streptavidin-konjugierte Fluorophore für dieses Protokoll verwendet werden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für Zellen, die fixiert und permeabilisiert effektiv in der Durchflusszytometrie Dot-Plot in Abbildung 3A gezeigt. Bei Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen zur Permeabilisierung ist die Zellpopulation kleine und homogene zeigt einige Zellaggregate. Bei höheren (5 mg / ml) Konzentrationen von Lysozym verwendet werden, werden die Zellen mit größerer Wahrscheinlichkeit zu aggregieren und zu zeigen erhöhte Vorwärtsstreuung Werte indikativ für größere Partikel (Abbildung 3B). Ein Beispiel für die Durchflusszytometrie Daten aus einer erfolgreichen LNA Flow-FISH Experiment ist in Abbildung 4 dargestellt. Das Histogramm zeigt die spezifische Detektion eines Targets sRNA zusammen mit drei negativen Kontrollen.Die &quot;keinen Farbstoff&quot; Negativ-Kontrolle produziert am wenigsten Fluoreszenz, die von der &#39;no LNA &quot;und&quot; non-Ausdruck sRNA &quot;negativen Kontrollen folgen. Schließlich erzeugt der Probe mit dem sRNA-spezifische LNA-Sonde der größte Fluoreszenz. Sobald die Methode und LNA-Sonden auf diese Weise validiert sind, können zusätzliche Experimente entwickelt, um Veränderungen in der sRNA Signals über die Zeit zu überwachen, in Reaktion auf Mutationen oder vielfältige Kultur Bedingungen, etc. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Abbildung 1. Darstellung des Gesamtkonzepts eines LNA Flow-FISH Experiment zum Nachweis von bakteriellen sRNA. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Abbildung 2. Färbung und Verstärkung des LNA Flow-FISH-Signal. a) Hybridisierung der biotinylierten LNA-Sonde. b) Färbung mit dem fluoreszierenden DyLight 488 Streptavidinkonjugat. c) Die Bindung des biotinylierten anti-streptavidin Antikörpers an die DyLight 488 Streptavidin. Der Antikörper kann Streptavidin durch seine Antigen-Bindungsstelle binden oder durch Streptavidin durch seine Biotin-Reste gebunden zu sein. d) Verstärkung des Signals durch weitere Färbung mit dem Fluoreszenz-DyLight 488 Streptavidinkonjugat. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Abbildung 3. Durchflusszytometrie Dot-Plots zeigen uns gegenüber side scatter Ergebnisse für a) 1 mg / mL Lysozym, 3 pg / mL Proteinase K Permeabilisierung und b) 5 mg / ml Lysozym, 3 pg / ml Proteinase K Permeabilisierung. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Abbildung 4. Histogramm Analyse der LNA Flow-FISH Ergebnisse. Das Fluoreszenzsignal von jeder Probe erzeugt wird durch die vier Spuren gezeigt: schwarz - sRNA-spezifische LNA-Sonde, rot - &quot;nicht zum Ausdruck sRNA&quot; negative Kontrolle; blau - &#39;no LNA &quot;negative Kontrolle; purple -&#39;Keinen Farbstoff &quot;negative Kontrolle.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der LNA Flow-FISH-Methode vorgestellt wurde hier verwendet, um den Ausdruck einer sRNA aus dem Gram-negative marine Bakterium Vibrio campbellii deren Expression zuvor via Microarray-basierte Expression Profiling und Reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion 16 geschlossen wurde bestätigt zu erkennen. Bis heute haben wir diese Methode verwendet, um die Expression einer Vielzahl von RNAs (zB trans-codierte sRNA, sRNA, dass Protein-Aktivität, Riboschalter und mRNA modulieren) zu überwachen. Als solche sind wir zuversichtlich, dass die Methode anpassungsfähig und kann verwendet werden, um sRNA oder mRNA Ziel zu erkennen und können für die Verwendung in allen Bakterienarten oder Zelltyp modifiziert werden können. Wenn Änderung dieses Protokolls ist die für andere Zelltypen, ist die wichtigste Variable zu berücksichtigen Manipulation der Permeabilisierung Schritt. Zum Beispiel bei der Änderung der Permeabilisierung hier beschriebenen Bedingungen, sollten Veränderungen in den Konzentrationen von Lysozym und Proteinase K getestet werden. Wir fanden, dass eine Verdoppelung oderVerdreifachung der Menge an Lysozym und Proteinase K führte zu großen Veränderungen in der LNA Flow-FISH Ergebnisse. Darüber hinaus bei der Prüfung von zusätzlichen Permeabilisierung Bedingungen sollte der Zellen für die Verklumpung, Zellverlust, und die beste erhältliche Signal an Hintergrundfluoreszenz Verhältnis analysiert werden. Das Ausmaß der Zelle Verklumpung kann durch Mikroskopie und / oder Durchflusszytometrie getestet werden. Mit der Durchflusszytometrie sind Zellklumpen Gegenwart als Schwänze in einer Vorwärts-vs side scatter Dot-Plot und die richtige Methode Permeabilisierung diesem Tailing-Effekt zu minimieren. Diese Methode eignet sich auch für Multiplex sRNA Erkennung ohne größere Änderungen an den beschriebenen Protokolls als Zusatzartikel LNA-Sonden mit anderen Haptene wie Digoxigenin während der Hybridisierung hinzugefügt werden könnten und dann mit einem Anti-Digoxigenin-Antikörper und sekundären Antikörper-Fluorophor-Konjugat nachgewiesen. Derzeit ist die einzige Einschränkung, dass wir mit dieser Methode kennengelernt haben ihre Unfähigkeit, eine ausreichende Signal schwach ex erzeugengedrückt sRNA Arten und Bemühungen sind im Gange, um die Nachweisgrenze zu bestimmen (in absoluten Kopienzahl pro Zelle). Insgesamt bietet die LNA Flow-FISH-Methode die Möglichkeit, bakterielle sRNA oder mRNA-Expression bei den einzelnen Zell-Ebene in einem hohen Durchsatz Weise Erkenntnisse über das Vorhandensein und die relative Häufigkeit eines sRNA Arten und das Ausmaß, die ihren Ausdruck variiert bieten messen in einer Population.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (Nicht DEPC behandelt) </td></tr><tr><td> 32% Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> RT 15714 </td><td> Ethanol frei </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Acros Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Diethyl (DEPC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; Keep ausgetrockneten </td></tr><tr><td> Lysozym </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K (20 mg / mL) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Entionisiertes aliquotieren und einfrieren </td></tr><tr><td> Dextransulfat MW&gt; 500.000 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Aliquot 60% ige Lösung und frieren </td></tr><tr><td> Denhardt-Lösung 50X-Konzentrat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Aliquotieren und einfrieren </td></tr><tr><td> Natriumcitratpuffer 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; Lachssperma DNA (geschert) 10 mg / mL </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Aliquotieren und einfrieren </td></tr><tr><td> Hefe tRNA (10 mg / mL) </td><td> Life Technologies / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Aliquotieren und einfrieren </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5x in-situ-Hybridisierung Blockierungslösung </td><td> Vector Laboratories </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 Streptavidin </td><td> Vector Laboratories </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylierten Anti-Streptavidin </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA-0500 </td><td> Aliquotieren und einfrieren </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine leistungsfähige Technik, die zur Erkennung und Lokalisierung von spezifischen Nukleinsäuresequenzen in der zellulären Umgebung ist. Um den Durchsatz zu erhöhen, können FISH mit Durchflusszytometrie (flow-FISH) kombiniert werden, um den Nachweis von gezielten Nukleinsäuresequenzen in Tausenden von einzelnen Zellen zu ermöglichen. Als Ergebnis bietet Flow-FISH einen entscheidenden Vorteil gegenüber Lysat / Ensemble-basierten Nukleinsäure-Nachweisverfahren, weil jede Zelle als eine unabhängige Beobachtung behandelt wird, wodurch eine stärkere statistische und Abweichungsanalysen. Diese Attribute haben die Verwendung von FISH und Flow-FISH-Methoden in einer Reihe von verschiedenen Anwendungen aufgefordert werden, und den Nutzen dieser Methoden wurde erfolgreich in Telomerlänge Bestimmung 1,2, zelluläre Identifikation und Genexpression 3,4 nachgewiesen, Überwachung Virusvermehrung in infizierten Zellen 5 und bakterielle Gemeinschaft Analyse und Zählung6. Traditionell wurde die Spezifität der FISH-und Flow-FISH-Methoden von DNA-Oligonukleotid-Sonden wurden vermittelt. Kürzlich hat jedoch der Austausch von DNA-Oligonukleotid-Sonden mit Nukleinsäure-Analoga wie FISH und Flow-FISH-Sonden sowohl die Sensitivität und Spezifität der jeweiligen Technik aufgrund der höheren Schmelztemperaturen (T m) dieser Analoga für natürlichen Nukleinsäuren 7,8 erhöht . Locked Nucleic Acid (LNA)-Sonden sind eine Art von Nukleinsäure-Analogon, das LNA Nukleotide in einem DNA-oder RNA-Sequenz 9,10 aufgestockt. Wenn es mit Flow-FISH gekoppelt haben LNA-Sonden zuvor gezeigt, dass konventionelle DNA-Sonden 7,11 übertreffen und wurden erfolgreich eingesetzt, um eukaryotische mRNA 12 und virale RNA in Säugetierzellen 5 zu erfassen. Hier erweitern wir diese Fähigkeit und beschreiben eine LNA Flow-FISH-Methode, die den spezifischen Nachweis von RNA ermöglicht in Bakterienzelles (Abbildung 1). Insbesondere sind wir in der Detektion von interessierten kleine nicht-kodierende regulatorische RNA (sRNA), die sammelte großes Interesse in den letzten Jahren haben, wie sie gefunden wurden, um als wichtige regulatorische Elemente in vielen kritischen zellulären Prozessen 13 dienen. Allerdings gibt es begrenzte Werkzeuge, um sRNAs und die Herausforderungen zu erkennen sRNA in Bakterienzellen Studie ist zum Teil aufgrund der relativ geringen Größe (typischerweise 50-300 Nukleotide lang) und eine geringe Menge von sRNA Moleküle sowie die generelle Schwierigkeit in der Arbeit mit kleineren biologischen Zellen mit verschiedenen zellulären Membranen. Bei dieser Methode beschreiben wir Fixierung und permeabilzation Bedingungen, die die Struktur der bakteriellen Zellen zu erhalten und ermöglichen das Eindringen von LNA-Sonden sowie Signalverstärkung Schritte, die den spezifischen Nachweis von geringen Mengen vorhandenen Srna (Abbildung 2) zu ermöglichen.

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Eine neuartige High-Throughput-Verfahren beschrieben, die ermöglicht den Nachweis und die relative Quantifizierung von kleinen RNA-und mRNA-Expression von einzelnen Bakterienzellen Verwendung gesperrt Nukleinsäure-Sonden und Durchflusszytometrie-Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung.

Locked Nucleic Acid Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung (LNA Flow-FISH): Eine Methode für die bakterielle RNA-Detektion

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

locked-nucleic-acid-flow-cytometry-fluorescence-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

25.2K Aufrufe.  Naval Research Laboratory. Eine neuartige High-Throughput-Verfahren beschrieben, die ermöglicht den Nachweis und die relative Quantifizierung von kleinen RNA-und mRNA-Expression von einzelnen Bakterienzellen Verwendung gesperrt Nukleinsäure-Sonden und Durchflusszytometrie-Fluoreszenz In situ Hybridisierung.

Serie: Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

Transfektion und Mutagenese von Zielgenen in Mosquito-Zellen durch Locked Nucleic Acid-modifizierte Oligonukleotide

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent &#39;Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hybridisierung<em&gt; In-situ-</em&gt; Der Speicheldrüsen, Ovarien und Embryonen von Vektor-Mücken

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakterielle künstliche Chromosomen: A Functional Genomics-Werkzeug für das Studium der Positiv-Strang-RNA-Viren

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Quantitative Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV models are limited to hepatoma cell lines (such as HepG2 and Huh7) overexpressing a functional HBV receptor, sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP). Here, we used 293T-NE-3NRs (293T&#160;overexpressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) as model cell lines.&#160;HBV infection in these cell lines was performed either by using concentrated HBV virus particles from HepG2.2.15 or co-culturing HepG2.2.15 with the target cell lines. HBcAg immunofluorescence for HBcAg was performed to confirm HBV infection. The two methods presented here will help us study HBV infection in non-hepatic cell lines.&#160;&#160;

This manuscript describes a detailed protocol for Hepatitis B virus (HBV) infection in novel engineered 293T cells (293T-NE-3NRs, expressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and traditional hepatic cells (HepG2-NE, expressing human NTCP).

Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, could repress the expression of outer membrane proteins. To further investigate the regulation function of micC in Salmonella Enteritidis, we cloned the micC gene in the Salmonella Enteritidis strain 50336, and then constructed the mutant 50336&#916;micC by the &#955; Red-based recombination system and the complemented mutant 50336&#916;micC/pmicC carrying recombinant plasmid pBR322 expressing micC. qRT-PCR results demonstrated that transcription of ompD in 50336&#916;micC was 1.3-fold higher than that in the wild type strain, while the transcription of ompA and ompC in 50336&#916;micC were 2.2-fold and 3-fold higher than those in the wild type strain. These indicated that micC represses the expression of ompA and ompC. In the following study, the pathogenicity of 50336&#916;micC was detected by both infecting 6-week-old Balb/c mice and 1-day-old chickens. The result showed that the LD50 of the wild type strain 50336, the mutants 50336&#916;micC and 50336&#916;micC/pmicC for 6-week-old Balb/c mice were 12.59 CFU, 5.01 CFU, and 19.95 CFU, respectively. The LD50 of the strains for 1-day-old chickens were 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, and 2.54 x 108 CFU, respectively. It indicated that deletion of micC enhanced virulence of S. Enteritidis in mice and chickens by regulating expression of outer membrane proteins.

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An &#955;-Red-mediated recombination system was used to create a deletion mutant of a small non-coding RNA micC.

Eine nicht-kodierende kleine RNA MicC trägt zur Virulenz von Proteinen der äußeren Membran in Salmonella enteritidis bei

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...