Wir danken Sergei Demin und Tatjana Karamysheva für ihre Hilfe bei Chromosom Vorbereitung und FISH auf Anopheles. Wir danken auch David Severson für die Bereitstellung Aedes und Culex genomische DNA BAC-Klone und Melissa Wade für die Bearbeitung des Textes. 1R21 AI88035-01 bis Maria V. Sharakhova und 1R21 AI094289-01 bis Igor V. Sharakhov: Diese Arbeit wurde durch zwei Zuschüsse aus dem National Institutes of Health unterstützt.

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	<li>Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V., Verrity, J. F., Abbington, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome Mapping Research Developments. , (2008).</li><li>Holt, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae.">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li><li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+of+the+Anopheles+gambiae+PEST+genome+assembly.">Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly.</a> Genome biology. 8, R5 (2007).</li><li>Campos, J., Andrade, C. F., Recco-Pimentel, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+preparing+polytene+chromosomes+from+Aedes+aegypti+(Diptera,+Culicinae).">A technique for preparing polytene chromosomes from Aedes aegypti (Diptera, Culicinae).</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 98, 387-390 (2003).</li><li>Campos, J., Andrade, C. F., Recco-Pimentel, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malpighian+tubule+polytene+chromosomes+of+Culex+quinquefasciatus+(Diptera,+Culicinae).">Malpighian tubule polytene chromosomes of Culex quinquefasciatus (Diptera, Culicinae).</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 98, 383-386 (2003).</li><li>McAbee, R. D., Christiansen, J. A., Cornel, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detailed+larval+salivary+gland+polytene+chromosome+photomap+for+Culex+quinquefasciatus+(Diptera:+Culicidae)+from+Johannesburg,+South+Africa.">A detailed larval salivary gland polytene chromosome photomap for Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) from Johannesburg, South Africa.</a> J. Med. Entomol. 44, 229-237 (2007).</li><li>Nene, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+Aedes+aegypti,+a+major+arbovirus+vector.">Genome sequence of Aedes aegypti, a major arbovirus vector.</a> Science. 316, 1718-1723 (2007).</li><li>Arensburger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+of+Culex+quinquefasciatus+establishes+a+platform+for+mosquito+comparative+genomics.">Sequencing of Culex quinquefasciatus establishes a platform for mosquito comparative genomics.</a> Science. 330, 86-88 (2010).</li><li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaginal+discs--a+new+source+of+chromosomes+for+genome+mapping+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti.">Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS neglected tropical diseases. 5, e1335 (2011).</li><li>Brown, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+physical+map+of+Aedes+aegypti.">Toward a physical map of Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 4, 161-167 (1995).</li><li>Steiniger, G. E., Mukherjee, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+chromosome+banding:+technique+for+G-+and+Q-banding+pattern+in+the+mosquito+Aedes+albopictus.">Insect chromosome banding: technique for G- and Q-banding pattern in the mosquito Aedes albopictus.</a> Can. J. Genet. Cytol. 17, 241-244 (1975).</li><li>Garimberti, E., Tosi, S., Bridger, J. M., Volpi, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence in situ hybridization (FISH). , (2010).</li><li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+the+polymerase+chain+reaction.">Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 49, 520-529 (1993).</li><li>Trifonov, V. A., Vorobyeva, N. N., Rens, W., Leiehr, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorescence in situ hybridization (FISH). , (2009).</li><li>Collins, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ribosomal+RNA+gene+probe+differentiates+member+species+of+the+Anopheles+gambiae+complex.">A ribosomal RNA gene probe differentiates member species of the Anopheles gambiae complex.</a> The American journal of tropical medicine and hygiene. 37, 37-41 (1987).</li><li>Kumar, A., Rai, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+localization+and+copy+number+of+18S+28S+ribosomal+RNA+genes+in+evolutionary+diverse+mosquitoes+(Diptera,+Culicidae).">Chromosomal localization and copy number of 18S+28S ribosomal RNA genes in evolutionary diverse mosquitoes (Diptera, Culicidae).</a> Hereditas. 113, 277-289 (1990).</li><li>Brown, S. E., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISH+landmarks+for+Aedes+aegypti+chromosomes.">FISH landmarks for Aedes aegypti chromosomes.</a> Insect Mol. Biol. 6, 197-202 (1997).</li><li>Brown, S. E., Severson, D. W., Smith, L. A., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+the+Aedes+aegypti+mosquito+genetic+linkage+and+physical+maps.">Integration of the Aedes aegypti mosquito genetic linkage and physical maps.</a> Genetics. 157, 1299-1305 (2001).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Nichtfluoreszierenden in situ Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen von Moskitos wurde erstmals 1990 von A. Kumar und K. Rai 17 durchgeführt. In dieser Studie ribosomalen 18S und 28S-DNA-Gene, zusammen in einem Plasmid kloniert wird, wurden auf den Chromosomen 20 Stechmückenarten platziert. Die DNA-Sonde wurde radioaktiv markiert und hybridisiert an die Chromosomen aus Gehirn Ganglien. Zwischen drei Moskito Gattungen wurde eine FISH-Technik nur für mitotischen Chromosomen von der Zelllinie von Ae entwickelt. aegypti 10,18,19 und hat noch nie auf mitotische Chromosomen von Live-Mücken durchgeführt. Kürzlich entwickelten wir eine einfache, robuste Technik für den Erhalt hochwertiger Chromosom Zubereitungen aus IDs von 4 th Larven 9. Diese Methode ermöglicht eine hohe Anzahl von Chromosomen in eine Folie erhalten werden und ist universell für alle Arten von Stechmücken verwendet werden. Die Notwendigkeit der Verwendung von nur Larven, nicht Puppen oder Erwachsener stages von Mücken, zum Präparat ist wahrscheinlich die einzige Einschränkung des Verfahrens. Die Standard-FISH-Methode 12 wurde für die Verwendung von genomischen BAC-Klon und IGS rDNA als Sonden für den mitotischen Chromosomen Aedes, Culex und Anopheles optimiert. Zusätzlich zu diesen spezifischen Anwendungen können die FISH-Protokolle hier beschriebenen auch für andere Zwecke verwendet werden. Die fortgeschrittene FISH-Protokoll, das C 0 t DNA Fraktionen zur Blockierung unspezifischer Hybridisierung verwendet, können auch für die Hybridisierung von BAC-Klonen oder anderen großen DNA-Fragmente in heterochromatischen Regionen Anopheles aufgebracht werden. Heterochrome Regionen mit Transposons und andere Wiederholungen angereichert und Sonden aus diesen Regionen produzieren normalerweise starken Hintergrund auf den Chromosomen 3. Verwendung unmarkiert C 0 t DNA Fraktionen werden dazu beitragen, unspezifische Hybridisierung der Sonde an die Chromosomen reduzieren. Die einfache Version des FISH protocol kann für jede rDNA oder sich wiederholende DNA-Sonden auf mitotischen Chromosomen von Mücken und anderen Insekten verwendet werden. Darüber hinaus kann es auch für die Hybridisierung von DNA-BAC-Klons in Spezies mit geringem repetitiven DNA-Gehalt in euchromatischen Regionen wie Anopheles oder Drosophila angewendet werden. Die hier vorgeschlagene Protokoll wird dazu beitragen, hoch fertigen Chromosom Genom-basierten Baugruppen für Mücken zu erhalten, und können allgemein für verschiedene zytogenetische Anwendungen in anderen Gruppen von Insekten verwendet werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> MZ6 Leica Stereomikroskop </td><td> Leica </td><td> VA-OM-E194-354 </td><td> Eine andere Stereomikroskop benutzt werden </td></tr><tr><td> Olympus CX41 Phasenkontrastmikroskop </td><td> Olymp </td><td> CX41 </td><td> Eine andere Phase Mikroskop kann verwendet werden </td></tr><tr><td> Olympus BX61 Fluoreszenzmikroskop </td><td> Olymp </td><td> BX61 </td><td> Eine andere Fluoreszenzmikroskop benutzt werden </td></tr><tr><td> ThermoBrite Slide Denaturierung / Hybridization System </td><td> Abbott Molecular </td><td> 30-144110 </td><td> Dient als Heizblock und einer feuchten Kammer </td></tr><tr><td> Präpariernadeln </td><td> Feine ScienceTools </td><td> 10130-10</td><td></td></tr><tr><td> Nadelhalter </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26018-17 </td><td></td></tr><tr><td> Präparierschere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-03 </td><td></td></tr><tr><td> 75x25 Doppel frosted micro gleitet </td><td> Corning </td><td> 2949-75x25 </td><td></td></tr><tr><td> 22x22 mm Mikroskop Deckgläser </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-10 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> Rubber Cement </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50-949-105 </td><td></td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> A491-212 </td><td></td></tr><tr><td> Alcohol 200 Proof </td><td> Decon Laboratories </td><td> 2701 </td><td></td></tr><tr><td> Propionsäure </td><td> Sigma-ALDRIch </td><td> 402907 </td><td></td></tr><tr><td> Salzsäure </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumcitratdihydrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumacetattrihydrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP334-500 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchlorid </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tris-Base </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP152-1 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> P5493 </td><td></td></tr><tr><td> 10% NBF (neutral gepuffertes Formalin) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> 99% Formamid </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP227500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextransulfat-Natriumsalz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8906 </td><td></td></tr><tr><td> 20x SSC-Puffer </td><td> Invitrogen </td><td> AM9765 </td><td></td></tr><tr><td> 1 mM YOYO-1-iodid (491/509)-Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> Y3601 </td><td></td></tr><tr><td> Antifade verlängern Gold-Reagenz </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=P36930" target="_blank">P36930</a> </td><td></td></tr><tr><td> dATP, dCTP, dGTP, dTTP </td><td> Fermentas </td><td> R0141, R0151, R0161, R0171 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3-dUTP, Cy5-dUTP </td><td> GE Healthcare </td><td> PA53022, PA55022 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> DNA-Polymerase I </td><td> Fermentas </td><td> EP0041 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Fermentas </td><td> EN0521 </td><td></td></tr><tr><td> S1 Nuclease </td><td> Fermentas </td><td> EN0321 </td><td></td></tr><tr><td> Taq-DNA-Polymerase </td><td> Invitrogen </td><td> 18038-042 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 9001-99-4 </td><td></td></tr><tr><td> Pepsin </td><td> USB </td><td> 9001-75-6 </td><td></td></tr><tr><td> Lachssperma-DNA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D7656 </td><td></td></tr><tr><td> Nonidet-P40 (NP40) </td><td> US Biological </td><td> NC9375914 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Blood and Cell Culture Maxikit </td><td> Qiagen </td><td> 13362 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen Large Construct Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12462 </td&gt; <td></td></tr></tbody></table>

fluorescent in situ hybridization on mitotic chromosomes of mosquitoes

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine Technik, die routinemäßig von vielen Labors verwendet werden, um die chromosomale Position von DNA und RNA-Sonden zu bestimmen. Eine wichtige Anwendung dieser Methode ist die Entwicklung von hochwertigen physischen Karten nützlich für die Verbesserung der Genom-Baugruppen für verschiedene Organismen. Die natürliche Bandenmuster polytene und mitotische Chromosomen enthält Leitlinien für die präzise Anordnung und Ausrichtung der genomischen supercontigs. Unter den drei Gattungen Moskito, nämlich Anopheles, Aedes und Culex, ein gut etabliertes Chromosomen-Mapping-Technik ist nur für Anopheles, deren Mitglieder besitzen lesbaren Polytänchromosomen 1 entwickelt worden. Als Ergebnis der Bemühungen Genomkartierung, 88% der Ein. gambiae Genoms hat eine präzise Chromosom Positionen 2,3 gelegt. Zwei weitere mosquito Gattungen Aedes und Culex, haben schlecht Chromosomen b polytenizedeil der signifikante Überrepräsentation von Transposons in ihrem Genom 4, 5, 6. Nur 31 bzw. 9% der genomischen supercontings haben ohne Ordnung und Orientierung an Chromosomen Ae zugewiesen wurde. aegypti 7 und Cx. quinquefasciatus 8 auf. Mitotischen Chromosomen Vorbereitung für diese beiden Arten zuvor auf Gehirn Ganglien und Zelllinien beschränkt. Allerdings Chromosom Dias aus dem Gehirn Ganglien Mücken vorbereitet enthalten in der Regel geringe Zahl von Metaphase Platten 9. Außerdem, obwohl eine FISH-Technik wurde für mitotischen Chromosomen aus einer Zelllinie von Ae entwickelt. aegypti 10, macht die Ansammlung von mehreren chromosomalen Umlagerungen in Zelllinie Chromosomen 11 sie nutzlos für die Genom-Mapping. Hier beschreiben wir eine einfache, robuste Technik zur Gewinnung hochwertiger mitotischen Chromosomen Präparationen aus Imaginalscheiben (IDs) von 4 th Larvenstadium die ceine für alle drei Gattungen von Moskitos verwendet werden. Ein Standard-FISH-Protokoll 12 ist für die Verwendung von BAC-Klone von genomischer DNA als eine Sonde auf mitotischen Chromosomen Ae optimiert. aegypti und Cx. quinquefasciatus, und zur Verwendung einer intergenischen Spacer (IGS) Region der ribosomalen DNA (rDNA) als Sonde auf einem. gambiae Chromosomen. Neben physikalische Kartierung, kann die entwickelte Technik zur Bevölkerung Zytogenetik und Chromosom Taxonomie / Systematik der Mücken und andere Insekten Gruppen angewandt werden.

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Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Unter den drei Gattungen Moskito, nämlich<em&gt; Anopheles,</em&gt;<em&gt; Aedes</em&gt;, Und<em&gt; Culex</em&gt; Wurden physikalische Kartierung des Genoms Techniken nur für etablierte<em&gt; Anopheles</em&gt; Besitzen, deren Mitglieder lesbar Polytänchromosomen. Für den Gattungen<em&gt; Aedes</em&gt; Und<em&gt; Culex</em&gt; Bleibt jedoch zytogenetische Zuordnung wegen der schlechten Qualität der Polytänchromosomen Herausforderung. Hier präsentieren wir ein universelles Protokoll für den Erhalt hochwertiger Präparate von mitotischen Chromosomen und eine optimierte FISH-Protokoll für alle drei Gattungen von Mücken.

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

25.5K Aufrufe.  Virginia Tech. Unter den drei Gattungen Moskito, nämlich Anopheles, Aedes, Und Culex Wurden physikalische Kartierung des Genoms Techniken nur für etablierte Anopheles Besitzen, deren Mitglieder lesbar Polytänchromosomen. Für den Gattungen Aedes Und Culex Bleibt jedoch zytogenetische Zuordnung wegen der schlechten Qualität der Polytänchromosomen Herausforderung. Hier präsentieren wir ein univ...