Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Proteindynamik in vivo innerhalb des intakten Zentralnervensystems, um Fragen in der Neurowissenschaft und Immunologie zu beantworten. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind eine ausgezeichnete Bewegungsstabilität für die Bildaufnahme, kurze chirurgische Zeit, reduzierte Bedienerexposition gegenüber gasförmiger Anästhesie und kostengünstige anpassbare Backplates. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, den Knochen zu entfernen, ohne das eng darunter liegende Gewebe des Nervensystems während der Laminektomieschritte des Verfahrens zu beschädigen.
Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, verwenden Sie die vom 3D-Computer unterstützte Entwurfssoftware, um ein Modell für die angegebenen Dimensionen zu erstellen. Wir haben also ein Objekt, das das dreidimensionale Objekt ist, mit dem wir beginnen können. Was ich dann tun kann, ist, dass wir Einstellungen für die Druckversion setzen können.
Wenn ich also dies bearbeiten öffne, gehe in Erweitert, öffne ein Fenster, in dem ich alle diese Einstellungen anzeigen kann. Stellen Sie die Düsentemperatur auf 205 Grad Celsius, die Betttemperatur auf 45 Grad Celsius und die Druckgeschwindigkeit auf 45 Millimeter pro Sekunde auf einem 3D-Drucker ein. Verwenden Sie eine 0,4 Millimeter heiße Düse und eine Schichthöhe von 0,2 Millimetern, um die hinteren Platten zu drucken.
Bewerten Sie dann die bedruckten Rückplatten visuell auf ihre strukturelle Integrität. Grobe Strukturelle Fehler deuten auf Druckfehler hin. Wenn die Hinterplatten fertig sind, legen Sie den Kopf einer acht bis zwölf Wochen alten anästhesierten Maus auf ein Heatpad zwischen den Ohrstangen eines chirurgischen Restrainers und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.
Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, verwenden Sie eine Nummer 11 Klinge, um eine 1,5 Zentimeter rostrale zu kaudalen Mittellinie Schnitt über die untere Thorax-Oberlumkörper-Bereich zu machen und trennen Sie die Haut von der Peritoneum. Verwenden Sie Zangen, um das verbleibende transparente Bindegewebe unter der Haut zurückzuziehen, um die oberflächliche Muskulatur freizulegen. Verdrängen Sie die Muskeln mit einem Schaum chirurgischen Speer zusammen mit der verbleibenden tieferen Muskulatur des Zielwirbels.
Um einen Sitz für die Rückenplatte zu schaffen, löschen Sie den Muskel vom hinteren Aspekt der Brust 11 und dem vorderen Aspekt von Thorax 13. Mit Zangen, um den verbleibenden Muskel von den Sehnen zu entfernen, wenn nötig. Wenn der gesamte Muskel entfernt wurde, schneiden Sie die Sehnen vorsichtig mit Zangen, bis genügend Platz für die Visualisierung und Manipulation des Rückenmarks erreicht ist.
Bestätigen Sie, dass die Dura mater des Intervertebral-Raums, der halbtransparente laminare Knochen, das zentrale oberflächliche Blutgefäß unter dem Knochen und die anterior estrahlende Arterie deutlich sichtbar sind. Befeuchten Sie den Bereich mit warmer künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit und verwenden Sie einen Mikrobohrer, um den laminaren Knochen mit geraden Strichen parallel zur langen Achse des Rückenmarks zu verdünnen. Sanft den oberflächlichen Spinnprozess mit Zangen erfassen, den Wirbel heben.
Der Knochen sollte leicht wegheben. Verwenden Sie Nummer vier Zangen, um alle Knochenscherben zu entfernen, jede Blutung mit einem chirurgischen Speer und sanften stetigen Druck bei Bedarf zu kontrollieren. Dann spülen Sie das Gewebe mit warmer künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit ab.
Für die Abdeckung Glasimplantation, tragen Sie vorsichtig eine drei Millimeter Borosilikat Abdeckung Glas auf die freiliegende Schnur. Verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um 39 Grad Celsius erwärmt 2%Agarose an den Rand des Glases auftragen und Kapillarwirkung erlauben, um die Agarose unter die Abdeckung Glasoberfläche zu ziehen. Gewebekleber auf die exponierten knöchernen Gelenkprozesse des intakten benachbarten Wirbels auf der Brustebene 11 und 13 Wirbeldornen auftragen.
Tragen Sie zusätzlichen Gewebekleber in einem Ring um die Laminektomie-Stelle über die angrenzende Sehne und den Querprozess auf. Als nächstes verwenden Sie einen neuen Spachtel, um Zahnzement mit Beschleuniger gemischt auf die Gewebeklebeschicht aufzutragen und legen Sie eine Rückplatte auf das chirurgische Feld zentriert über dem Abdeckungsglasfenster. Das Auftragen mehrerer dünner Schichten von Zahnzement führt zu einer stärkeren Rückplattenhaftung, aber achten Sie darauf, die Hinterplatte schnell zu platzieren, bevor der Zahnzement zu trocknen beginnt.
Nachdem Sie den Zahnzement für 10 Minuten aushärten lassen, füllen Sie die Innenbasis und die Unterseite des hinteren Platzes mit zusätzlichem Klebstoff. Das Auftragen des Zahnzements in dünnen Schichten kann dazu beitragen, das Risiko einer Zementausbreitung auf das Deckglas und die Agarose zu reduzieren, was das gesamte Protokoll gefährden kann. Wenn der Zahnzement getrocknet ist, einen gegabelten Rückblechhalter an die entsprechende Position über dem Fenster auftragen und die Rückplatte in den hinteren Plattenhalter schrauben.
Dann tragen Sie Kochsaline auf die Hinterplatte auf, um auf Leckage zu testen. Das Tier und die Operationsplattform können dann auf den optischen Tisch eines zwei Photonenmikroskops zur Bildgebung durch das Deckglasfenster übertragen werden. In diesem repräsentativen Experiment wurde EGFP-positives Claudin-5 innerhalb der fluoreszierend dichten Knoten in einem Gefäßplexus visualisiert.
Die klare Abgrenzung der engen Anschlussstrukturen in der Z-Projektion zeigt an, dass nach einer erfolgreichen Laminektomie, Fensterplatzierung und Rückplattenimplantation eine minimale XY-Bildverschiebung entsteht. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Mikrochirurgie schwierig ist und einige Zeit in Anspruch nehmen kann. Nach der Beherrschung kann diese Operation jedoch in ca. 30 Minuten durchgeführt werden.
Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie zwei Photonenmikroskopie und In-vivo-Bildgebung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über neurovaskuläre Remodellierung und andere Krankheitsprozesse mit dem Rückenmark zu beantworten.
