Diese Arbeit wurde von der Ontario Institute of Cancer Research (OICR), die Terry Fox Stiftung und der American Association of Neurological Surgeons finanziert.

Ein. Culture of Brain Tumor Tissue <ol><li> Fügen Sie 200 ul aufgetaut Liberase (Roche Applied Science) auf 15 ml künstlichem CSF (aCSF-siehe Tabelle 1) und Platz in 37 ° C Wasserbad. Liberase TM ist eine Mischung aus proteolytischen Enzymen verwendet, um primäre Gewebeproben sowie kultivierten tumorspheres distanzieren. Im Gegensatz zu Trypsin-EDTA, bewahrt die Liberase Methode das Oberflächen-Antigen CD133. Für eine Gewebeprobe von etwa 0,5 cm 3, verwenden wir 200 ul Liberase. Wenn das Gewebe kleiner ist, verwenden wir 100 ul. </li><li> Bringen Ammoniumchloridlösung (Stammzell-Technologien) auf Raumtemperatur. Ammoniumchlorid-Lösung vorsichtig lysiert roten Blutkörperchen mit minimalen Auswirkungen auf die anderen Zellen. Es enthält keine Fixativ. </li><li> In sterile biologischen Sicherheitswerkbank, 5 ml aCSF um Probenbehälter, wirbeln um Gewebe abspülen, dann abpipettieren. Dieser Schritt hilft, um rote Blutkörperchen (RBC) zu entfernen. </li><li> Übertragen Gehirn Tumorgewebe zu einer sterilen 100 mm Petri dish. </li><li> Mit feinen Schere oder Skalpell und Pinzette, zerlegen Gewebe Gülle Konsistenz. </li><li> Sammle Probe unter Verwendung einer 10 ml regelmäßigen Pipette oder einer Pinzette und Transfer-Fragmente in das Röhrchen mit vorgewärmten aCSF mit Liberase. </li><li> Am Inkubator-Schüttler (30 rpm) und auf 37 ° C für 15 min. </li><li> Filtern Sie die Gewebelysat bis 70 um Zellsieb in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen. </li><li> Drehen Sie das Filtrat nach unten bei 280 xg für 5 min. </li><li> Überstand entfernen sorgfältig und evaluieren Größe und Farbe der resultierende Zellpellet: Pellets, die rosa oder rot sind anzugeben wachsende Zahl von roten Blutkörperchen. </li><li> Pellet in 1 ml PBS. </li><li> Hinzufügen einer geeigneten Menge von Ammoniumchloridlösung (4-12 ml) auf Pelletgröße und roten Zellkontamination bezogen (der Ammoniumchloridlösung ist sehr schonend und erhöhte Mengen sind nicht schädlich für andere Zellen als Erythrozyten). </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Spin-ZellenFestlegung bei 280 × g für 5 min. </li><li> Waschen einmal mit 10 ml sterilem PBS. </li><li> Resuspendieren in 5 ml NSC Vollmedium (Tabelle 2) und Transfer zu einem ultra-low-Bindung 60 mm Gewebekulturplatten (Corning). Wir verwenden ultra-low-Bindung Petrischalen mit kovalent gebundenen Hydrogel Oberflächen, die hydrophile und neutral geladen, um Zelladhäsion-vermittelte Differenzierung zu minimieren. </li></ol> Für die ersten Tage in der Kultur, nicht ändern, die Medien: top-up nur mit 1-2 ml Medium je nach Bedarf, dann weiter zu Kultur und Change-Medien zu beobachten, wenn die Farbe der Medien wird leicht gelblich. 2. Tumorsphere Dissoziation für die Durchflusszytometrie <ol><li> Bewerten tumorspheres unter dem Mikroskop: Wenn die Kugel Größe&gt; 100 um, Dissoziation wird empfohlen, da größere Kugeln kann nekrotisch in der Mitte. </li><li> Übertragen Kultur 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Fügen Sie 2-3 ml sterile PBS auf die Platte gründlich und fügen Sie konischen Rohr. </li><li> Zentrifuge bei 280 × g für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren in 1 - 2 ml steriler PBS. </li><li> Fügen Sie 10 ul Liberase. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C-Wasserbad für 3 min. Entfernen und visuell auswerten Aufhängung, wenn mehrere Klumpen zu sehen, sanft verreiben mit einem 1.000 ul Pipettenspitze. </li><li> Wenn Verklumpung auftritt, weiterhin Inkubation für eine zusätzliche 1-2 min. </li><li> Waschen der Zellen durch Zugabe von 5 ml sterilem PBS und Zentrifugieren bei 280 × g für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren in 500-1,000 ul sterilem PBS 2 mM EDTA. </li><li> Bewerten Zellzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von Trypanblau. </li><li> Passen Zellzahl zu 1 Million / ml in PBS + 2 mM EDTA. </li></ol> 3. Oberflächenfärbung <ol><li> Übertragen Sie 100 ul von 1x10 6 / ml Zellsuspension pro Test 12x75 mm Strömungsrohre. </li><li> Fügen Sie entsprechende Menge von Antikörpern. Abgestimmt Isotyp Kontrollen sollten für jeden verwendet werdenAntikörper (siehe Tabelle 3). </li><li> Inkubieren für 30 min auf Eis. </li><li> 2 ml PBS 2 mM EDTA zu jedem Strömungsrohr. </li><li> Zentrifugation bei 200 xg für 4 min, dekantieren und Blot. </li><li> Pellet in 300 ul PBS 2 mM EDTA. </li><li> Fügen Sie 10 ul 7AAD Lebensfähigkeit Farbstoff in jedes Röhrchen pipettieren und für mindestens 15 Minuten auf dem Eis. </li><li> Analysieren mittels Durchflusszytometrie. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie und-analyse Die Einzelheiten der Erfassung und Analyse von Flow Daten Gerät abhängig. Vertreter negativen Proben laufen und Geräteeinstellungen für Forward (Größe) und Side (Granularität) streuen etabliert. Diese Streuung Muster ermöglicht dem Endbenutzer, um alle Zellen in der Probe zu sehen, darunter Schutt. Eine Region wird in der Regel um die Zellen von Interesse gezogen. (Abbildung 4a) Die Einstellungen werden dann für alle Fluoreszenz-Detektoren erforderlich, um die negativen Zellen innerhalb der ersten Dekade des AF-Position aufgebautluorescence Intensitätsverteilung. Wenn mehr als ein Farbstoff oder Fluorochrom verwendet wird, muss einzigen gefärbten Steuerelemente auszuführen, um Farbe Korrekturwerte (Subtraktion störende Fluoreszenz-Emissionen) zu etablieren. Beim Ausführen von lebenden Zellen eine Lebensfähigkeit Farbstoff wie 7-AAD (7-Amino-Actinomycin D - Anregung 488/emission 655) verwendet wird, und einem zweiten Bereich gezogen, um abgestorbene Zellen (Abb. 4b) auszuschließen. Beide Bereiche werden zu keiner weiteren Analyse der Proben aufgebracht. 5. Selbst-Erneuerung Assay Der Schlüssel-Assay, die sich stark durch klonale Wachstum Kugel erleichtert ist die in-vitro-Test der Selbsterneuerung Kapazität, der Grenzverdünnung Assay. Tumorspheres dissoziiert und verteilt in Verdünnungen bis zu einer einzelnen Zelle pro Vertiefung, und die Geschwindigkeit der nachfolgenden Bereich Bildung über 7 Tagen in Kultur berechnet. Am Tag 7, wird der Prozentsatz der Vertiefungen ohne Gehalt Kugeln für jede Zelle Plattierungsdichte (F 0) berechnet und gegengegen die Anzahl der Zellen pro Vertiefung (x). Die Anzahl der Zellen erforderlich ist, um mindestens eine in jedem gut tumorsphere bilden wird aus dem Punkt, an dem die Leitung kreuzt die 0,37 Niveau (F 0 = e-x) bestimmt. In einer Poisson-Verteilung von Zellen, F 0 = 0,37 entspricht der Verdünnung von einer Zelle pro Napf, so dass diese Berechnung (der 37% schneiden) die Frequenz des klonogenen Stammzellen in der gesamten Zellpopulation (Abbildung 5) reflektiert. 6. Single Cell RT-PCR Einzelne Zellen aus verschiedenen Populationen von Beckman Coulter MoFlo XDP auf Reaktionsstellen auf einem AmpliGrid Schieber (Beckman Coulter cat # AG480F) sortiert. Einzelne Zelle RT-PCR unter Verwendung AmpliGrid Single One Step RT-PCR-System (Beckman Coulter cat # OAX04515) nach den Angaben des Herstellers. Kurz gesagt, wird eine einzelne Zelle in jede Reaktionsstelle eines AmpliGrid Objektträger aufgebracht; die Anwesenheit einer einzelnen Zelle in jedemReaktionsstelle durch Mikroskopie bestätigt. Reverse Transkription (RT) wird unmittelbar nach dem Sortieren, um die Probe nicht beeinträchtigt wird durchgeführt. Die RT Master Mix wird frisch zubereitet, nach Testvorschrift (Tabelle 4). Wir verwendeten 0,03 ul 25 uM Zufallsprimern (Promega) pro Reaktion; 1 ul Mastermix ist an der Mitte jeder Reaktionsstelle zugegeben. Dies wird sofort mit 5 ul Versiegelungslösung (Beckman Coulter cat # OAX04503) beschichtet. Verwendung einer Folie AmpliSpeed ​​Zykluseinrichtung (Beckman Coulter, cat # OAX04101), Objektträger werden bei 25 ° C für 10 min, 42 ° C für 10 min und 55 ° C für 45 min. Nach der reversen Transkription, 3 ul DNAse / RNAse-freiem Wasser ist jedem Reaktionsstelle zugegeben und die gesamte Mischung zu einem PCR-Röhrchen (1 Röhre / Stelle) übertragen. 8 ul qPCR Master Mix (5 ul Sybr Green (Quanta), 1 ul Wasser, 1 ul 10 uM vorwärts und rückwärts Primer mix) plus 2 &amp;: In einer PCR-Platte wird eine Reaktion Volumen von 10 ul für die quantitative PCR verwendetmu; l des RT Mischung. Für Echtzeit-Quantifizierung, Proben auf einem BioRad Cycler ausgeführt mit folgendem Programm: 95 ° C für 10 min, 45 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 60 ° C für 60 sec, 72 ° C für 60 sec, gefolgt von 10 min bei 72 ° C und Schmelzkurvenanalyse. Ct-Werte wurden mit Opticon Monitor 3 (BioRad). Drei Gene pro Zelle beurteilt werden, einschließlich GAPDH als Housekeeping-Gen. Genexpression zu GAPDH normalisiert Expression, nach Anspruch 2-ACt. Mindestens ein Dutzend einzelne Zellen des gleichen Bevölkerung von der gleichen Art verwendet werden, wie biologische Replikate aus Mangel an technischen Replikate zu kompensieren. 7. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt eine Magnetic Resonance Imaging (MRI)-Scan eines repräsentativen Patienten mit GBM. Hirntumor Proben aus mündigen Patienten sofort nach der Operation erhalten, als genehmigt von der Hamilton Health Sciences / McMaster Health Sciences Research Ethics Board. Ein Teil jeder Probe wird der Neuropathologe für die klinische Routinediagnostik gegeben. Der verbleibende Probe wird verarbeitet, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Tumorzellen, einmal in völliger neuralen Stammzelle Medien mit Wachstumsfaktoren, Form tumorspheres ausplattiert wie in Abbildung 3 dargestellt. Die Tumorzellen werden mit neuronalen Oberfläche Stammzellmarkern CD133 und CD15 etikettiert und durch Durchflusszytometrie analysiert, wie in Abbildung 4 dargestellt. Einzelne Zellen aus verschiedenen Populationen für zB CD15 + / CD133 +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- werden dann in 96-Well-Platten (5a) oder in AmpliGrid Dias (6a) sortiert. In der 96-Well-Platte können einzelne Zellen, die Selbst-Erneuerung Kapazität (zB CD133 + Zellen), (5b) besitzen, bilden tumorspheres (Abbildung 5c) nach incubation. Ein Selbsterneuerung Graph kann aufgetragen (Figur 5d) durch Zählen der Anzahl von Kugeln pro Vertiefung ausgebildet werden. Einzelzellen in die Reaktionsstelle der AmpliGrid Schlitten (6a) sortiert. Die RNA aus Zellen extrahiert einzigen revers transkribiert werden kann unter Verwendung des Advalytix AmpliSpeed ​​(Abbildung 6b). Die erhaltene cDNA wird verwendet, um in Echtzeit RT-PCR (6c) durchzuführen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig1.jpg" /> Abbildung 1. Magnetresonanztomographie (MRI) eines Patienten GBM. MRT des Gehirns eines 16-jähriges Mädchen mit einer einmonatigen Geschichte der Kopfschmerzen und einer Woche Geschichte Erbrechen, Lethargie und visuelle Unschärfe. Axial FLAIR-Sequenz zeigt eine große bi-hemisphärische (&quot;Schmetterling&quot;) GBM. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig2.jpg" /> Abbildung 2. Hirntumor Verarbeitung. Hirntumor Proben sind obtaINED vom mündigen Patienten sofort nach der Operation. Sie sind mechanisch dissoziiert als (a) gezeigt und sind dann enzymatisch dissoziiert aCSF mit Liberase durch Inkubation in einem 30 min-Rocking-Inkubator bei 37 ° C für 15 min (b). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig3.jpg" /> Abbildung 3. BTIC Populationen bilden tumorspheres in der Kultur. Dissoziierte Hirntumorzellen in völliger neuralen Stammzellen Medien mit Wachstumsfaktoren beschichtet bilden tumorspheres. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die durchflusszytometrische Analyse der BTIC Populationen. (A) Forward gegenüber Seitwärtsstreuung Eigenschaften bereitzustellen ein Bild von allen Zellen, einschließlich Schmutz (b) Zellen, die mit der Lebensfähigkeit Farbstoff 7-AAD Flecken werden von der Analyse ausgeschlossen. (C) Die Position der statistischen Quadranten bestimmt wird unter Verwendung geeigneter Steuerungen Isotyp (d) Tumorzellen mit Oberflächen ma angefärbtrkers CD15-PE und CD133-APC. (D) MoFlo XDP Zellsortierer. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4111/4111fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig5.jpg" /> Abbildung 5. Grenzverdünnung Analyse BTICs offenbart ihre Selbsterneuerung Kapazität. (A) Zellen der unterschiedlichen Verdünnungen in 96 Vertiefungen, enthaltend 200 ul NSC zu (b) einer einzelnen Zelle pro Well sortiert werden. (C) Nach einer 7-tägigen Inkubationszeit wird ein tumorsphere gebildet. Die Morphologie der sekundären tumorspheres ist identisch mit der primären tumorspheres. (D) Die mittleren x-Achsenabschnitt Werte können aus Grenzverdünnung Analyse für jeden Tumorsubtyp um die Anzahl der Zellen erforderlich ist, um mindestens einen tumorsphere pro Vertiefung bilden offenbaren berechnet. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig6.jpg" /> Abbildung 6. Genexpressionsanalysen aus einer einzigen Zelle BTICwiederholen, indem einzelne Zelle RT-PCR-Technologie. (a) Einzel-Zellen aus einer Population kann auf BTIC AmpliGrid Folien sortiert werden. (B) cDNA-Synthese wird auf einzelne Zellen auf AmpliGrid Dias mit dem Advalytix AmpliSpeed ​​durchgeführt. (C) Quantitative Realtime PCR basiert auf der cDNA von einzelnen BTIC Zellen synthetisiert durchgeführt. <table border="1"><tbody><tr><td> 2 M NaCl </td><td> 62 ml </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> 155 mM NaHCO 3 </td><td> 169 ml </td></tr><tr><td> 1M Glucose </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl 2 </td><td> 0,9256 ml </td></tr><tr><td> PURELAB Ultra-H 2 0 </td><td> 749,84 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Artificial Liquor (aCSF) -. 1.000 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Lager Basal Medien </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> 01.01 DMEM: F12 </td><td> 480 ml </td></tr><tr><td> N2 Ergänzung </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 3,0 g </td></tr><tr><td> N-Acetylcystein (60 ug / ml) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Neural Überleben factor-1 (NSF-1) </td><td> 10 ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Neuralen Stammzellen Medien. NSC komplette Medien (frisch zubereitet vor der Verwendung): NSC Grundmedien + 20 ng / ml EGF (epidermal growth factor) + 20 ng / ml bFGF (basic fibroblast growth factor) + 10 ng / ml LIF (Leukämie inhibierender Faktor) * + 10 ul / ml Antibiotikum-Antimykotikum * Leukemia inhibitory factor (LIF): Dieses Reagenz von Millipore enthält ein Interleukin 6 Klasse Cytokin, ein protein die spontane Differenzierung von Stammzellen zu fördern längerfristige Wartung der Stammzell-Kulturen unterdrückt. <table border="1"><tbody><tr><td> Antikörper </td><td> Lieferant / CAT # </td><td> ul / test (in 100 ul) </td></tr><tr><td> CD133 / 2 APC (293C3) </td><td> Miltenyi Biotec/130-090-854 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2b APC (Isotyp-Kontrolle) </td><td> Miltenyi Biotec/130-092-217 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CD15PE </td><td> Beckman Coulter/IM1954U </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2a PE (Isotyp-Kontrolle) </td><td> Beckman Coulter/A09141 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> Beckman Coulter/A07704 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Durchfluss Antikörper. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Volume (1 Reaktion) </td><td> Volume (48 Reaktion) </td></tr><tr><td> 2x Single Cell RT Reaktionspuffer </td><td> 0,50 ul </td><td> 30,0 ul </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (10 U / ul) </td><td> 0,02 ul </td><td> 1,2 ul </td></tr><tr><td> 5X Single Cell RT-Enhancer </td><td> 0,15 ul </td><td> 9,00 ul </td></tr><tr><td> Single Cell RT Enzyme Mix </td><td> 0,04 ul </td><td> 2,4 ul </td></tr><tr><td> Advablue (OAX04227) </td><td> 0,1 ul </td><td> 6,00 ul </td></tr><tr><td> Nuclease freies Wasser </td><td> bis zu 1 ul </td><td> machen bis zu 60 ul </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Zusammensetzung des RT Master Mix für Single Cell RTPCR (cat # OAX04515).

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sorting:+automated+separation+of+mammalian+cells+as+a+function+of+intracellular+fluorescence.">Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.</a> Science. 166, 747 (1969).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495 (1975).</li><li>Barrett, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+does+not+predict+tumor+growth+potential+in+mouse+models+of+high-grade+glioma.">Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma.</a> Cancer Cell. 21, 11 (2012).</li><li>Venugopal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+marks+intermediate+precursors+during+differentiation+of+human+brain+tumor+initiating+cells.">Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells.</a> Stem Cell Res. 8, 141 (2012).</li><li>Gerlinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).</li><li>Gilbertson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+signalling+a+change+in+treatment.">Medulloblastoma: signalling a change in treatment.</a> Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).</li><li>Zhu, Y., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+genetic+basis+of+neurological+tumours.">The molecular and genetic basis of neurological tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).</li><li>Maher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+genetics+and+biology+of+a+grave+matter.">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15, 1311 (2001).</li><li>Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+eukaryotic+gene+expression.">Noise in eukaryotic gene expression.</a> Nature. 422, 633 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297, 1183 (2002).</li><li>Maheshri, N., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+noisy+genes:+how+cells+function+reliably+with+inherent+variability+in+gene+expression.">Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).</li><li>Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4, e309 (2006).</li><li>Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+individual+genes+in+eukaryotic+cells+occurs+randomly+and+infrequently.">Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently.</a> Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).</li><li>Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).</li><li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR.">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Krebsstammzelle Hypothese 10, auf der Arbeit bei Leukämie 21 basierend, Brustkrebs 11 und Hirnkrebs 4,5, legt nahe, dass nur ein relativ kleiner Teil der Zellen im Tumor, bezeichnet Krebsstammzellen, eine Fähigkeit, ausgiebig proliferieren und selbst besitzen erneuern. Die meisten der Tumorzellen die Fähigkeit verlieren, sich zu vermehren und selbst zu erneuern, als sie in Zellen, die die phänotypische Signatur des Tumors zu differenzieren. Den Schlüssel Zellen im Geh...

Hirntumoren gehören zu den aggressiven und heterogene Krebsarten beim Menschen bekannt. Obwohl ihre frühere Erkennung und Diagnose von modernen bildgebenden Technik erleichtert worden, wir noch fehlt kurative Therapien für vielen Hirntumoren, insbesondere für diffuse, invasive Einsen oder diesen sich tief im Gehirn. Hirntumoren stellen die Hauptursache der Krebssterblichkeit im Kindesalter aufgrund ihrer sehr aggressiven und oft unheilbaren Natur. Glioblastom (GBM), der häufigsten primären Hirntumoren bei Erwachsenen, ist einer der aggressivsten Krebserkrankungen des Menschen, für seine gleichmäßig tödlichen Prognose 1 gefürchtet. Diese hoch-malignen astrozytären Tumor (WHO Grad 4) tritt meist in den zerebralen Hemisphären von Erwachsenen, und kann auch bei kleinen Kindern und Säuglingen auftreten. Sein Wachstum ist schnell und infiltrative und diagnostische pathologischen Merkmale sind Kernpolymorphie, mikrovaskuläre Proliferation und Nekrosen 2,3. Für adults mit neu diagnostiziertem GBM, mediane Überlebenszeit nur selten erstreckt sich über 12 Monate 1, mit allgemein schlechte Antworten auf alle therapeutischen Modalitäten. Wir haben festgestellt, dass es viele funktionale und genetische Ähnlichkeiten durch somatische Stammzellen und Krebszellen geteilt, und dass die molekularen Signalwege, die normale Entwicklung des Gehirns reguliert werden häufig in der Krebstherapie fehlreguliert. Bei der Anwendung der Stammzellbiologie Paradigmen zur Untersuchung von Hirntumoren, wir waren die ersten Forscher, die prospektiv zu identifizieren und zu reinigen eine Subpopulation von Zellen aus menschlichen GBMs, die Stammzell-Eigenschaften der Proliferation, Selbsterneuerung ausgestellt, und die Differenzierung in vitro 4 und in vivo 5. Wir wendeten Kulturbedingungen und Assays ursprünglich zur normalen neuralen Stammzellen (NSC) in vitro 6,7 charakterisieren, um mehrere Kinder-und Erwachsenen Hirntumoren und angereichert für diesen Stamm-ähnlichen Zellen durch Zellsortierung für das neuronale Vorläuferzellen Zelloberflächenmarker CD133 8 ,9. Die CD133 + Gehirntumor Fraktion enthaltenen Zellen, die eine viel höhere Frequenz als das Tumorinitiation CD133-Fraktion in NOD-SCID Mäusehirnen 5,10 hatte. Dieses formal festgestellt, dass nur eine seltene Untergruppe von Hirntumoren Zellen mit Stammzell-Eigenschaften Tumor-Initiierung, verdienen sie den Namen &quot;Gehirntumor initiierende Zellen&quot; oder &quot;BTICs&quot; sind. Der Roman Identifizierung BTICs gibt neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumorgenese, geben starke Unterstützung für die Krebsstammzellen Hypothese 10-13 als Grundlage für die vielen soliden Tumoren und stellt eine neuartige zelluläre Ziel für eine effektivere Krebstherapien 14-20. Therapien, die sich auf das Töten der Großteil des Tumors die seltene stielartigen Bruchteil verpassen kann, so dass der Tumor weiter wachsen. Therapien, die sich auf das Töten der Krebsstammzellen eine bessere Behandlung und Prognose für Patienten mit Hirntumoren vorsehen. Um BTIC Populationen zu untersuchen, haben wir unsere cultu verfeinertre Protokolle speziell für Zellpopulationen innerhalb der menschlichen Hirntumoren, die Stammzell-Eigenschaften besitzen wählen. Serumfreiem, neurale Stammzellen (NSC) Medium ermöglicht die Wartung von einer undifferenzierten Stammzellen Zustand, und die Zugabe von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) ermöglicht die Verbreitung von Multi-potent, sich selbst erneuernden und erweiterbaren menschlichen tumorspheres. Hier beschreiben wir die Methoden bei der Verarbeitung von primären Hirntumoren und Kultivierung sie in NSC Medium für BTIC Bevölkerung bereichern beteiligt. Wir nannten unsere experimentellen Modellsystem &quot;BTIC Patienten Isolate&quot;, die Tatsache, dass diese Zellen nur minimal unter Stammzellen kultiviert betonen Zelle Bedingungen für Stammzellpopulationen auszuwählen. Nachfolgende Immunmarkierung von BTIC Populationen für Schlüssel Stammzellmarkern wie CD133 und CD15 und Durchflusszytometrie-Analyse wird ebenfalls beschrieben. Dann besprechen wir die Grenzverdünnung Analyseder Beihilfen bei der Untersuchung der Selbsterneuerung Potenzial BTICs. Schließlich untersuchen wir die Genexpressionsanalyse dieser seltenen Zellen durch Sortierung einzelnen Zellen auf AmpliGrid Dias und Durchführung einzelne Zelle RT-PCR. Diese Techniken sind auch anwendbar auf andere Hirntumore wie Medulloblastom, Ependymom und pädiatrische Gliomen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> 01.01 DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> N2 Ergänzung </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Wisent </td><td> 330-050-EL </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-Acetylcystein </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A9165-25g </td></tr><tr><td> Neural Überlebensfaktor -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> Epidermal Growth Factor (EGF) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> Antibiotikum / mykotischen </td><td> Wisent </td><td> 450-115-EL </td></tr><tr><td> Liberase TM </td><td> Roche </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> Ammoniumchloridlösung </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting

Hirntumoren sind typischerweise aus morphologisch unterschiedlichen Zellen, die eine Vielzahl von neuronalen Marker exprimieren Linie besteht. Nur ein relativ kleiner Teil der Zellen im Tumor mit Stammzelleigenschaften, genannt Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), besitzen die Fähigkeit, entlang mehrerer Abstammungslinien unterscheiden, selbst zu erneuern, und initiieren Tumoren in vivo. Wir wendeten Kulturbedingungen ursprünglich für normalen neuralen Stammzellen (NSC) an einer Vielzahl von menschlichen Gehirntumoren verwendet und festgestellt, dass diese Kultur spezifisch Verfahren wählt für stielartigen Populationen. Serum-freiem Medium (NSC) ermöglicht die Aufrechterhaltung eines undifferenzierten Stammzellen Zustand, und die Zugabe von bFGF und EGF ermöglicht die Verbreitung von Multi-potent, sich selbst erneuernden und erweiterbaren tumorspheres. Zur weiteren Charakterisierung der einzelnen Tumors BTIC Bevölkerung, werten wir Zelloberflächenmarker mittels Durchflusszytometrie. Wir können auch sortieren Bevölkerung von Interesse für die besonderen characterization. Selbsterneuerung Assays sind auf einzelnen BTICs in 96 Well-Platten sortiert durchgeführt, die Bildung von tumorspheres nach Inkubation bei 37 ° C zeigt das Vorhandensein von einem Stamm oder Vorläuferzelle. Mehrere Zellzahlen von einer bestimmten Population können auch in verschiedenen Brunnen für Grenzverdünnung Analyse sortiert werden, um sich selbst zu erneuern Fähigkeit zu analysieren. Wir können auch studieren differentiellen Genexpression innerhalb einer bestimmten Zellpopulation mit einzelnen Zelle RT-PCR. Die folgenden Protokolle beschreiben unser Verfahren zur Dissoziation und Kultivieren von primären humanen Proben zum Nachweis BTIC Populationen sowie die Dissoziation von tumorspheres anzureichern. Ebenfalls eingeschlossen sind Protokolle für die Färbung für Durchflusszytometrie Analyse oder Sortierung, Selbsterneuerung Assays und einzelne Zelle RT-PCR.

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Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Die Identifizierung von Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), die seltenen Zellen innerhalb einer heterogenen Tumor besitzt Stammzell-Eigenschaften, liefert neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumor Pathogenese. Wir haben spezifische Kulturbedingungen verfeinert für BTICs bereichern, und wir routinemäßig Durchflusszytometrie weiter bereichern diese Populationen. Selbsterneuerung Assays und Transkript Analyse durch einzelne Zelle RT-PCR kann anschließend auf diesen isolierten Zellen durchgeführt werden.

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

processing-primary-brain-tumor-tissue-for-stem-cell-assays-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

17.9K Aufrufe.  McMaster University. Die Identifizierung von Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), die seltenen Zellen innerhalb einer heterogenen Tumor besitzt Stammzell-Eigenschaften, liefert neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumor Pathogenese. Wir haben spezifische Kulturbedingungen verfeinert für BTICs bereichern, und wir routinemäßig Durchflusszytometrie weiter bereichern diese Populationen. Selbsterneuerung Assays und Transkript Analyse durch einzelne Zelle RT-PCR kann anschließend auf di...

Serie: Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Forschung

Medizin

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Halbautomatische Anpassung der Umlauftumorzellen (CTC)-Assays für die klinische und vorklinische Forschungsanwendungen

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Bewertung der Stammzelleigenschaften in Menschen Ovarialkarzinomzellen Mit Multi und Single Cell-basierte Assays Spheres

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Probenahmestrategien und Verarbeitung der Biobank Gewebeproben von porcinen biomedizinische Modelle

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...