Hier beschreiben wir eine Lehrmethode, die auf einer schnellen Wärmeinaktivierung der Protease basiert, um natürliche intrazelluläre Peptide zu erhalten, den Abbau in Zellen und Geweben zu vermeiden, gefolgt von einer relativen Quantifizierung von Peptiden mittels Isotopenmarkierung. Diese Etikettiermethode hat so viele Vorteile. Die Reagenzien sind kommerziell erhältlich, kostengünstig, chemisch stabil und ermöglichen die Analyse von bis zu fünf Proben in einem einzigen Serum.
Beginnen Sie mit der Kultivierung menschlicher Neuroblastomzellen in einer 15-Zentimeter-Schale in DMEM, die 15% FBS und 1% Penicillin Streptomycin enthält. Halten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, fügen Sie dann 10 Milliliter PBS hinzu, kratzen Sie die Zellen und sammeln Sie sie in einem 15-Milliliter-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 mal G für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter ultragereinigtem entionisiertem Wasser bei 80 Grad Celsius und übertragen Sie dann den Inhalt des Röhrchens in ein Zwei-Milliliter-Mikrofugenröhrchen. Nach der Hitzeinaktivierung des Zebrafisches das gesamte Gehirn in einem zwei Milliliter großen Mikrofugenröhrchen sammeln und bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.
Resuspendieren Sie die Gewebeprobe in einem Milliliter ultragereinigtem deionisiertem Wasser bei 80 Grad Celsius und beschallen Sie mit einer Sonde mit 30 Impulsen einer Sekunde. Inkubieren Sie das zelluläre Lysat- oder Homogenatgewebe bei 80 Grad Celsius für 20 Minuten und kühlen Sie es dann 10 bis 30 Minuten auf Eis ab. Für jeden Milliliter Probenvolumen werden 10 Mikroliter einer molaren Salzsäure-Stammlösung zugegeben.
Mischen Sie durch Wirbeln für 20 Sekunden und inkubieren Sie auf Eis für 15 Minuten. Zentrifugieren Sie das zelluläre Lysat oder das Homogenatgewebe bei 12.000 mal G in vier Grad Celsius für 15 Minuten. Sammeln Sie den Überstand in niedrig bindenden Protein-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.
Reinigen Sie die Ultrafiltrationsgeräte mit Wasser und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 2.300 mal G und entsorgen Sie dann das Wasser aus dem Ultrafiltrationsgerät. Den Überstand in einen vorgewaschenen 10 Kilodalton-Trennfilter pipettieren und in einer gekühlten Zentrifuge bei vier Grad Celsius drehen. Überprüfen Sie den pH-Wert der Probe.
Die Säule mit einem Milliliter 100% Acetonitril ausgleichen und dann mit einem Milliliter 5% Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure waschen. Laden Sie das gesamte Volumen der Probe in die Säule und waschen Sie die Säule mit einem Milliliter 5% Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure. Eluieren Sie die Peptide aus der Säule mit 1,8 Millilitern 1% Acetonitril mit 0,15% Trifluoressigsäure in proteinarme Mikrozentrifugenröhrchen.
Trocknen Sie die Probe vollständig in einer Vakuumzentrifuge bei 30 Grad Celsius und überwachen Sie die angezeigte Konzentrationszeit. Lagern Sie die Probe bei minus 80 Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Peptidproben in 100 bis 200 Mikroliter ultragereinigtem Wasser und pipettieren Sie 2,5 Mikroliter der Standardpeptidkonzentrationen und Proben auf die weiße 96-Well-Platte.
Fügen Sie 25 Mikroliter 0,2 molaren Phosphatpuffer und 12,5 Mikroliter Fluorescamin hinzu. Homogenisieren Sie vorsichtig für eine Minute auf dem Orbitalrotator. Als nächstes fügen Sie 110 Mikroliter Wasser hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
Passen Sie die Einstellungen am Spektrofluorometer an und lesen Sie dann die Platte ab. Fügen Sie 1/10 Volumen eines molaren Trimethylammoniumbromids zu jeder Peptidprobe mit bis zu 25 Mikrogramm des Peptids hinzu. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert zwischen fünf und acht liegt, und stellen Sie ihn bei Bedarf mit Salzsäure oder Natriumhydroxid ein.
Fügen Sie vier Mikroliter nicht deuteriertes, deuteriertes Formaldehyd oder Kohlenstoff-13-deuteriertes Formaldehyd hinzu. Mischen Sie für fünf Sekunden durch Wirbeln. Fügen Sie der Peptidprobe vier Mikroliter Natriumcyanoborhydrid oder deuteriertes Natriumcyanoborhydrid hinzu.
Mischen Sie dann die Probe für fünf Sekunden durch Wirbeln. Inkubieren Sie die Peptidprobe in einem Abzug für zwei Stunden bei Raumtemperatur und wirbeln Sie alle 30 Minuten. Wiederholen Sie die Zugabe von nicht deuteriertem, deuteriertem oder Kohlenstoff-13-deuteriertem Formaldehyd und Natriumcyanoborhydrid oder deuteriertem Natriumcyanoborhydrid, wobei nach jeder Zugabe vorgewirbelt wird.
Die Proben im Abzug über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. 16 Mikroliter Ammoniumbicarbonat zugeben und durch Wirbeln mischen. Legen Sie die Probe auf Eis.
Fügen Sie acht Mikroliter 5% Ameisensäure hinzu und wirbeln Sie für weitere fünf Sekunden. Kombinieren Sie die Peptidproben, stellen Sie den pH-Wert zwischen zwei und vier ein und entsalzen Sie dann die kombinierten Proben auf Umkehrphasen-Reinigungssäulen mit Acetonitril und Trifluoressigsäure, wie zuvor beschrieben. Trocknen Sie die Probe vollständig in einer Vakuumzentrifuge bei 30 Grad Celsius und lagern Sie sie dann bei minus 20 Grad Celsius.
Die markierten Peptide werden anhand von Massenspektren beobachtet. Rote Pfeile zeigen das Vorhandensein von Peakpaaren verschiedener Peptide an, die mit zwei Isotopenformen, L1 und L5, zum Vergleich zwischen zwei verschiedenen Proben S1 bzw. S2 markiert sind. Das Massenspektrum eines Peptids, das in drei verschiedenen Proben, S1, S2 und S3, vorhanden ist und mit L1-, L3- bzw. L5-Tags markiert ist, ist hier dargestellt.
Eine Quadruplex-Beschriftung wurde durchgeführt. Die Kontrollproben S1 und S3 wurden mit L1 bzw. L3 markiert und mit zwei experimentellen Proben, S2 und S4, die mit L2 markiert waren, verglichen und L4.No signifikante Unterschied beobachtet wurde. Die Isotopenmarkierung wurde verwendet, um Substrate in Produkten in vitro für eine bestimmte Protease oder Peptidase zu zeigen.
Ein Peptid, das sich in Gegenwart des Neurolysin-Enzyms nicht verändert, ist hier gezeigt. Peptide, die in Gegenwart des Enzyms verschwinden oder reduzieren, sind Substrate, während diejenigen, die zunehmen, als Produkte betrachtet werden. Die Abbildung ist ein Beispiel für die Identifizierung einer Peptidsequenz, die von einer Datenbanksuchmaschine durchgeführt wird, die mit drei verschiedenen Formen von Tags gekennzeichnet ist.
Stellen Sie vor der Definition sicher, dass die Probe vollständig kühl ist, um zu vermeiden, dass die durch harte Ansäuerung verursachten Peptidbindungen gebrochen werden. Darüber hinaus ist die Reinigung von Ultrafiltrationsgeräten unerlässlich. Die Massenspektrometrie ist eine ausgezeichnete Methode zur Quantifizierung von Peptiden zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen und für Analysestudien durch Identifizierung von Peptidasesubstraten.
