Die Autoren danken dem menschlichen Gehirn und Rückenmarksflüssigkeit Resource Center (Los Angeles, CA) für die Bereitstellung von normalen Gehirn Muster. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, der CJD-Stiftung, Alliance biologisch sicher, sowie die University Center on Aging und Gesundheit mit Unterstützung der McGregor-Stiftung und des Präsidenten Discretionary Fund (Case Western Reserve University) unterstützt .

Ein. Vorbereitung der Hirnhomogenat und Waschmittel-Soluble (S2) und-unlöslich (P2) Fraktionen <ol><li> Nehmen 100 mg gefrorenes menschliches Gehirngewebe und 100 ul Lysepuffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4). </li><li> Homogenisieren auf Eis mit Pistill durch ein schnurloses angetrieben, frieren sie in Trockeneis für 5 min und homogenisieren Sie es erneut mit Pistill durch die Hände und dann durch einen Motor angetrieben, und 300 ul oder 800 ul Lysepuffer (dies ist entweder die 20 % oder 10% insgesamt Hirnhomogenat, jeweils). </li><li> Zentrifugieren 20% oder 10% Gesamt-Hirnhomogenisat bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C bis Überstand (S1) unter Verwendung einer Tischzentrifuge sammeln. </li><li> Ultrazentrifuge 10% S1 bei 35.000 rpm (100.000 × g) in einem SW55 Rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) für 1 Stunde bei 4 ° C. Die Überstände (S2), die das Detergens-löslichen Fraktion in ein sauberes Röhrchen enthalten. Resuspendieren der Pellets, die Detergens-unlöslichen enthaltenFraktion (P2) in 100 ul oder 200 ul Lysepuffer bis 10 machen - oder 5-fach konzentrierte Zubereitung. </li><li> Für PK-Verdauung, inkubieren der Probe mit den gleichen Mengen an PK bei 50 pg / ml bei 37 ° C für 1 Stunde für beide S2 und P2 Fraktionen. Hinzufügen Phenylmethylsulfonylfluorid bei einer Endkonzentration von 5 mM und gleiche Volumina von SDS-Probenpuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 50 mM Tris, pH 6,8), um die PK Verdau beenden. Man kocht die Proben für 10 Minuten und kühlen diese bei Raumtemperatur für 5 min. Sie sind bereit, für Western-Blot. </li></ol> 2. Velocity Sedimentation in Sucrose Stufengradienten <ol><li> Inkubieren 450 ul 20% S1 mit einem gleichen Volumen von 2% Sarkosyl in H 2 O für 30 min auf Eis. </li><li> 0,5 ml jeder von 60%, 30%, 25%, 20%, 15% und 10% Saccharose in ein Rohr mit einem Beckman maximal 5 ml Inhalt. </li><li> Geladen 0,4 ml S1 auf die Oberseite der 10-60% Saccharose Stufengradienten. </li><li> Zentrifuge bei 48000 Upm (200.000 × g, SW55 Rotor) für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Collect 283 ul Fraktion jeweils von oben auf das Rohr und 12 Fraktionen erhalten insgesamt. </li><li> Nehmen Sie 20 ul jeder Fraktion zu einem neuen Eppendorf-Röhrchen, fügen Sie 20 ul Probenpuffer, und kochen für 10 min. </li><li> Coole Proben für 4 min in der Kapuze, bei 1.000 xg für 1 min und Vortex sie zentrifugieren. Legen Sie die Proben auf einer pre-cast-Gel. </li></ol> 3. Size Exclusion Chromatography <ol><li> Verwenden Superdex 200 HR-Perlen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in einem 1 x 30 cm Säule, um die oligomeren Zustand von PrP Molekülen zu bestimmen. </li><li> Sieben Molekularmasse Marker (Sigma, St. Louis, MI) einschließlich Dextran blau (2000 kDa), Thyroglobulin (669 kDa), Apoferritin (443 kDa), β-Amylase (200 kDa), Alkoholdehydrogenase (150 kDa), Albumin ( 66 kDa) und Carboanhydrase (29 kDa) sind unabhängig voneinander in den Konzentrationen von Sigma in 200 ul Probenvolumina empfohlen geladen. </li><li> Das Elutionsvolumen von blauen dextran wird verwendet, um das Hohlraumvolumen (V 0 = 8,45 ml) und das Gesamtvolumen (V t = 24 ml) wird durch das Produkt der Anweisung für bestimmen. Die Peak-Elutions-Volumina (V e) von dem Chromatogramm und fraktionierte Retentionen berechnet. K av, der Verteilungskoeffizient (Definition Probe Verhalten), berechnet unter Verwendung der Gleichung: K av = (V E - V 0) / (V t - V 0). Die Kalibrationskurve durch Auftragen der K av der Proteinstandards gegen den log MG des Standards 8 bestimmt. </li><li> Das Molekulargewicht (MW) der einzelnen Spezies in verschiedenen PrP FPLC Fraktionen gewonnen wird gemäß einer Eichkurve mit dem Gelfiltration verschiedener Standards erzeugt ausgewertet. </li><li> Inject 200 ul S1 in Lysepuffer mit 1% Sarkosyl in die Spalte für jeden Lauf. </li><li> Chromatographie in einem FPLC-System (GE Healthcare) bei einer Flussrate von 0,25 ml / min und Fraktion durchgeführts von 0,25 ml werden gesammelt, indem ein Fraktionssammler (Amersham Biosciences, RediFrac). </li><li> Inkubieren 0,125 ml jeder Fraktion mit 0,5 ml vorgekühltes Methanol bei -20 ° C für 2 Stunden. </li><li> Zentrifuge Proben bei 13.000 × g für 30 min bei 4 ° C in einer Tisch-Mikrozentrifuge. Überstand verwerfen und das Pellet in 20 ul SDS-Probenpuffer wie oben erwähnt, Kochen für 10 min, auf Raumtemperatur abkühlen lassen, laden Sie sie auf einen pre-cast-Gel. </li></ol> 4. Erfassung von PrP durch g5p <ol><li> Die g5p Moleküls (100 ug) (freundlicherweise von Drs. Geoff Kneale und John McGeehan von der University of Portsmouth, UK zur Verfügung gestellt) konjugiert ist 7 x 10 8 Tosyl aktiviert magnetische Kügelchen durch Inkubation 100 ug g5p und 350 ul g5p Perlen in 1 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) bei 37 ° C für 20 Stunden. Attract g5p-Perlen an der Seitenwand des Eppendorf-Röhrchen durch externe magnetische Kraft und entfernen Sie dann alle Lösung. Waschen der Kügelchen mit 1 ml PBS, enthaltend0,1% Rinderserumalbumin (BSA) für dreimal. </li><li> Inkubieren g5p-konjugierte Kügelchen in 1 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 mit 0,1% BSA bei 37 ° C für 5 Stunden um nicht-spezifische Bindung zu blockieren und dann Waschen der Kügelchen mit 1 ml PBS, enthaltend 0,1% BSA für dreimal wie oben erwähnt. Entfernen Sie die Lösung und 1 ml PBS in die Perlen. Die vorbereiteten g5p Perlen sind für mindestens 3 Monate stabil bei 4 ° C. </li><li> Die Einnahme von PrP durch g5p wird durch Inkubieren 100 ul S1 Fraktionen oder P2 mit 60 ul g5p konjugierte Kügelchen (10 ug Protein / 6 x 10 7 Kügelchen) in 1 ml Bindungspuffer (3% Tween-20, 3% NP-durchgeführt 40 in PBS, pH 7,5). </li><li> Nach Inkubation mit ständiger Rotation für 3 Stunden bei Raumtemperatur werden die PrP-haltigen g5p Kügelchen an der Seitenwand des Eppendorfröhrchen durch externe Magnetkraft angezogen, so dass für die einfache Entfernung aller ungebundenen Moleküle in der Lösung. </li><li> Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (2% Tween-20 und 2% NP-40 in PBS, pH 70,5) werden g5p Kügelchen gesammelt und bei 95 ° C für 5 min in der SDS-Probenpuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% Glycerin, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8). </li><li> Nach Abkühlen Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur werden die Proben bei 1000 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Überstände sind bereit für Western-Blot. </li></ol> 5. Western Blot <ol><li> Last Proben in der SDS-Probenpuffer auf 15% Tris-HCl-Criterion vorgegossenen Gelen (Bio-Rad) bei 150 V gekocht für ~ 80 min. </li><li> Die Proteine ​​auf dem Gel auf eine PVDF werden für 2 h bei 70 V überführt. </li><li> Nach Blockieren Membranen in 5% Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,01% Tween-20 (TBS-T) werden die Membranen für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit primären monoklonalen oder polyklonalen Antikörper 3F4 (1:40.000) inkubiert, 1E4 (1 : 1000), Anti-N 8 (1:6000) oder anti-C 8 (1:6.000) zum Sondieren der PrP Molekül. </li><li> Nach Inkubation mit HRP-konjugiertem Schaf-anti-Maus-IgG an1:3000 oder Esel-Anti-Kaninchen-IgG bei 1:3000 die PrP Bänder sind auf Kodak-Film mit ECL Plus visualisiert, in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Verglichen mit sporadischer CJD Proben wurde eine kleine Menge an C IPRP im P2-Fraktion in normalen Gehirnen erkannt, obwohl die meisten von PrP C in der S2-Fraktion (Abbildung 1) wurde gewonnen. Wie zuvor angedeutet 8, IPRP macht etwa 5-25% des gesamten PrP einschließlich voller Länge und N-terminal verkürzten Spezies. Analysen unter Verwendung von Saccharose Stufengradienten Sedimentation zeigte, dass die meisten von PrP C von nicht CJD Gehirne in den Kopffraktionen 1-3 zurückgewonnen wurde, geringe Mengen an PrP wurden auch in den unteren Fraktionen 9-11 enthalten, die normalerweise große Aggregate 8 (Abbildung detektiert 2). Eine Vielzahl von PrP Sc Arten läuteteten aus Monomeren wurden kleine Oligomere zu größeren Aggregaten durch Gelfiltration im Gehirn mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (3A) isoliert. Jedoch wurde eine kleine Menge von größeren Aggregaten mit einem Molekulargewicht von mehr als 2.000 kDa auch in unlöslichen Fraktionen von normalen Gehirnen (3C) detektiert. Außerdem wurden Dimere und Tetramere von PrP C nicht nur in unlöslichen Fraktionen, aber auch in löslicher Fraktionen (3B und 3C) detektiert. Nach PK und PNGase Behandlung wurde das PrP durch g5p eingefangen mit dem 1E4 Antikörper, der gegen PrP97-105 8 detektiert. Drei PK-resistentem Kern Fragmenten gefasst PrP * 20, * 19 PrP und PrP * 7 erkannt wurden, wandern bei ~ 20 kDa, 19 kDa und ~ ~ 7 kDa (Abb. 4, linke Tafel). Es wurde jedoch kein PrP erkannt, wenn der 1E4 Antikörper wurde mit einem synthetischen Peptid, das eine Sequenz hat ident vorinkubiertschen dem 1E4-Epitop (Abbildung 4, Mitte), was darauf hinweist, dass Bands von 1E4 erkannt PrP-Fragmente sind. Zudem ergab die anti-C Antikörper zwei verschiedenen PrP-Fragmente Migration bei ~ 18 kDa (PrP * 18) und ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), zusätzlich zu PrP * 20 (Abbildung 4, rechts). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> Abbildung 1. Erkennung von IPRP C und IPRP Sc. Nach der Behandlung mit PNGase F auf 1/10 des gesamten Reaktionsvolumens bei 37 ° C für 1 Stunde an Glykane vom Protein in voller Länge oder N-terminal verkürzte PrP Spezies in den löslichen und unlöslichen Fraktionen (S2 und P2) getrennt zu entfernen durch Ultrazentrifugation im Gehirn Proben von normalen Kontrolle (CTL) und sporadische CJD (sCJD) wurden mit 3F4 gegen PrP106-112 (links), Anti-N gegen PrP23-40 (Mitte) erkannt wird, und Anti-C gegen PrP220-231 (rechts). In CTL-Proben wird eine kleine Menge von PrP in P2 detektiert, während eine große Menge vorhanden ist in S2. Im Gegensatz dazu wird in mehr PrP P2 als in S2 in sCJD Proben nachgewiesen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> Abbildung 2. Sedimentation von PrP in Saccharose Stufengradienten. PrP in einzelnen Fraktionen aus 1 bis 11 der nicht-CJD Hirnprobe S1 wurde durch Western-Blotting mit 3F4 detektiert. Obwohl die meisten von PrP C in Kopffraktionen 1-3 detektiert wurde, wurden kleine Mengen an PrP auch im unteren Fraktionen 9-11 beobachtet. Darüber hinaus ist das Bandenmuster von PrP von oben und unten unterschiedliche: PrP in den Kopffraktionen zurückgewonnen hat eine dominante oberen Bandes, während PrP in den unteren Fraktionen zurückgewonnen hat eine dominante unteren Band. Ein PK-behandelten PrP Sc wurde als Kontrolle auf der rechten Seite der Blot geladen. <img alt = &quot;Abbildung 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Nachweis von löslichen und unlöslichen PrPC Oligomere. Lösliche und unlösliche PrP C von normalen menschlichen Gehirne wurden durch Ultrazentrifugation getrennt und anschließend einer Gelfiltration unterworfen sind. Die molekularen Größen von einzelnen Fraktionen wurden durch Ausführen einer Gruppe von Molekularmasse Marker gemessen. (A) PrP Sc Arten aus sCJD Hirnproben. Zwei Populationen von PrP Arten wurden entdeckt: Gelfiltrationsfraktionen 49 bis 65 enthalten Monomere und kleine Oligomere, während Fraktionen 27-33 große Aggregate enthalten. Die PrP C Spezies aus löslichen Fraktion (S2) (B) und unlösliche Fraktion (P2) (C) von normalen Kontrollen gefunden wurden. PrP wurde mit dem 3F4-Antikörper sondiert. Dimere (Fraktion 55) und Tetramere (Fraktion 51) von PrP wurden nicht nur in P2 aber auch in S2 von normalen Gehirn detektiert sampln (B und C). Große Aggregate wurden nur in P2 des normalen Proben (C) detektiert wird. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> Abbildung 4. Erkennung von verschiedenen PK-resistente IPRP Fragmente in g5p angereicherte Präparate aus normalen menschlichen Gehirnen. Proben durch g5p angereichert wurden mit PK und PNGase F vor Westernblotting Sondieren mit 1E4 (linke Tafel), 1E4 mit einem synthetischen Peptid, das eine Sequenz identisch mit dem Epitop 1E4 (Mitte) hatte vorinkubiert behandelt und Anti-C ( rechts). 1E4 erkannt drei PK-resistente PrP-Fragmente genannt PrP * 20, PrP * 19 und PrP * 7 (links). Nach der Blockierung der 1E4 mit dem Peptid wurden keine PrP res erkannt (Mitte), was darauf hinweist, dass die Bänder mit 1E4 erkannt PrP-Fragmente sind. Anti-C ergab zwei zusätzlich PK-resistente PrP-Fragmente genannt PrP * 18 und PrP-CTF12 /13, zusätzlich zu PrP * 20.

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	<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions.+Proc.">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li><li>Oesch, B., Westaway, D., W&#228;lchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein.">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li><li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion.">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li><li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods.">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li><li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+(SAF)+has+the+same+size,+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+(PrP).">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li><li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein.">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li><li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+prions+lying+in+wait:+a+two-hit+model+of+prion/amyloid+formation+and+infection.">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li><li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains.">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li><li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions.">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein.">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li><li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease.">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li><li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variably+protease-sensitive+prionopathy:+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein.">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li><li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain.">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li><li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G., Potter, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+prion+proteins.">Characterization of prion proteins.</a> Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. , 305-314 (2002).</li><li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes.">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Kombination von Ansätzen über die hier berichtet isoliert konsequent unlöslichen PrP C Aggregate und löslichen PrP C Oligomere aus dem normalen menschlichen Gehirns. Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für eine Stunde ist eine klassische Methode, die in großem Maße für die Trennung der unlöslichen PrP Sc von der löslichen PrP C 14 verwendet. Während es effizient ist, eine der Verwarnung ist, um eine Verunreinigung während des Ziehens den Überstand (S2) nach d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Phenylmethylsulfonylfluorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM in 2-Propanol </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml in H 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrazentrifuge LE-80K, SW55 Rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> Art.-Nr. 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR Kügelchen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC-System </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Molekulargewichtsmarker </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Variiert </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Magnetkügelchen </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 Antikörper </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4-Antikörper </td><td> Cell Sciences </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Gel bereit 15% Tris-HCl vorgegossenen Gelen </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of soluble and insoluble prp oligomers in the normal human brain

Das zentrale Ereignis in der Pathogenese von Prion-Erkrankungen umfasst eine Umwandlung des Host-kodierten zellulären Prionen-Proteins PrP C in seine pathogene Isoform PrP Sc ein. PrP C ist Detergenz-löslichen und empfindlich gegenüber Proteinase K (PK)-Verdau, während PrP Sc bildet Detergens-unlöslichen Aggregaten und ist teilweise resistent gegen PK 2-6. Die Umwandlung von PrP C zu PrP Sc ist bekannt, einen Konformationswechsel α-Helix zu β-Faltblatt-Strukturen des Proteins beinhalten. Jedoch ist die in vivo-Weg noch wenig verstanden. Eine vorläufige endogenen PrP Sc-, Zwischen-PrP * oder &quot;silent Prion&quot;, muss noch in der nicht infizierten Gehirn 7 identifiziert werden. Mit einer Kombination von biophysikalischen und biochemischen Ansätzen haben wir festgestellt, unlösliche PrP C Aggregate (benannt IPRP C) von nicht infizierten Säugetieren Gehirn und kultivierten neuronalenZellen 8, 9. Hier beschreiben wir detaillierter Verfahren dieser Methoden, einschließlich Ultrazentrifugation in Detergenspuffer, Saccharose Stufengradienten Sedimentation, Größenausschlusschromatographie, IPRP Anreicherung durch Gen-5-Protein (g5p), die spezifisch an PrP strukturell veränderten Formen 10 und PK-Behandlung. Die Kombination dieser Ansätze isoliert nicht nur unlösliche PrP Sc und PrP C Aggregate aber auch lösliche Oligomere PrP C von der normalen menschlichen Gehirns. Da die Protokolle hier beschrieben wurden verwendet, um sowohl PrP Sc aus infizierten Gehirnen und IPRP C von nicht infizierten Gehirn zu isolieren, geben sie uns die Möglichkeit, Unterschiede in der physikalisch-chemischen Eigenschaften, Neurotoxizität und Infektiosität zwischen den beiden Isoformen zu vergleichen. Eine solche Studie wird deutlich verbessern unser Verständnis der infektiösen proteinhaltigen Krankheitserreger. Die Physiologie und Pathophysiologie der IPRP C sind derzeit unklar. Insbesondere in einem neu-identified menschlichen Prion-Erkrankung bezeichnet variabel Protease-sensitive prionopathy, fanden wir ein neues PrP Sc, die immunreaktiven Verhalten und Fragmentierung mit IPRP C 11, 12 Aktien. Darüber hinaus haben wir kürzlich gezeigt, dass IPRP C die wichtigsten Arten, die mit Amyloid-β-Protein in Alzheimer-Krankheit 13 zusammenwirkt. In derselben Studie wurden diese Methoden zur Abeta Aggregate und Oligomere in Alzheimer 13 isolieren, was nahelegt, deren Anwendung auf nicht-Prionprotein Aggregate in anderen neurodegenerativen Erkrankungen involviert.

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Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Eine neue Art der zellulären Prion-Protein (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Wurde kürzlich in infizierten menschlichen Gehirnen mit den hier beschriebenen Methoden identifiziert worden. Diese Methoden können verwendet werden, um verschiedene PrP-Spezies zu isolieren, während einige von ihnen sind auch nützlich, um anderen fehlgefalteten Proteinaggregate aus menschlichen Gehirnen.

Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

The central event in the pathogenesis of prion diseases involves a conversion of the host-encoded cellular prion protein PrPC into its pathogenic isoform ...

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Research

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Medicine

10.7K Aufrufe.  Case Western Reserve University School of Medicine. Eine neue Art der zellulären Prion-Protein (PrP C) Wurde kürzlich in infizierten menschlichen Gehirnen mit den hier beschriebenen Methoden identifiziert worden. Diese Methoden können verwendet werden, um verschiedene PrP-Spezies zu isolieren, während einige von ihnen sind auch nützlich, um anderen fehlgefalteten Proteinaggregate aus menschlichen Gehirnen.

Serie: Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic strategies1. To overcome the issue of tumor heterogeneity, it is essential to develop assays and tools enabling phenotypic, (epi)genetic and functional identification and characterization of tumor subpopulations that drive specific disease pathologies and represent clinically relevant targets. It is now well established that tumors exhibit distinct sub-fractions of cells with different frequencies of cell division, and that the functional criteria of being slow cycling is positively associated with tumor formation ability in several cancers including those of the brain, breast, skin and pancreas as well as leukemia2-8. The fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) has been used for tracking the division frequency of cells in vitro and in vivo in blood-borne tumors and solid tumors such as glioblastoma2,7,8. The cell-permeant non-fluorescent pro-drug of CFSE is converted by intracellular esterases into a fluorescent compound, which is retained within cells by covalently binding to proteins through reaction of its succinimidyl moiety with intracellular amine groups to form stable amide bonds9. The fluorescent dye is equally distributed between daughter cells upon divisions, leading to the halving of the fluorescence intensity with every cell division. This enables tracking of cell cycle frequency up to eight to ten rounds of division10. CFSE retention capacity was used with brain tumor cells to identify and isolate a slow cycling subpopulation (top 5% dye-retaining cells) demonstrated to be enriched in cancer stem cell activity2. 
This protocol describes the technique of staining cells with CFSE and the isolation of individual populations within a culture of human glioblastoma (GBM)-derived cells possessing differing division rates using flow cytometry2. The technique has served to identify and isolate a brain tumor slow-cycling population of cells by virtue of their ability to retain the CFSE labeling.

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

This video protocol demonstrates the application of the fluorescent dye carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) for the identification and separation of different sub-populations of cells in human glioblastoma based on frequency of cell division.

Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Forschung

Medizin

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is the second most common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is the most important risk factor, cases of PD will increase during the next decades 2. Next to pathological protein folding and impaired protein degradation pathways, alterations of mitochondrial function and morphology were pointed out as further hallmark of neurodegeneration in PD 3-11.
After years of research in murine and human cancer cells as in vitro models to dissect molecular pathways of Parkinsonism, the use of human fibroblasts from patients and appropriate controls as ex vivo models has become a valuable research tool, if potential caveats are considered. Other than immortalized, rather artificial cell models, primary fibroblasts from patients carrying disease-associated mutations apparently reflect important pathological features of the human disease.
Here we delineate the procedure of taking skin biopsies, culturing human fibroblasts and using detailed protocols for essential microscopic techniques to define mitochondrial phenotypes. These were used to investigate different features associated with PD that are relevant to mitochondrial function and dynamics. Ex vivo, mitochondria can be analyzed in terms of their function, morphology, colocalization with lysosomes (the organelles degrading dysfunctional mitochondria) and degradation via the lysosomal pathway. These phenotypes are highly relevant for the identification of early signs of PD and may precede clinical motor symptoms in human disease-gene carriers. Hence, the assays presented here can be utilized as valuable tools to identify pathological features of neurodegeneration and help to define new therapeutic strategies in PD.

The Use of Primary Human Fibroblasts for Monitoring Mitochondrial Phenotypes in the Field of Parkinson&#039;s Disease

Fibroblasts from patients carrying mutations in Parkinson's disease-causing genes represent an easily accessible ex vivo model to study disease-associated phenotypes. Live cell imaging gives the opportunity to study morphological and functional parameters in living cells. Here we describe the preparation of human fibroblasts and subsequent monitoring of mitochondrial phenotypes.

Die Verwendung von primären humanen Fibroblasten zur Überwachung Mitochondriale Phänotypen auf dem Gebiet der Parkinson-Krankheit

Parkinson's disease (PD) is the second most  common movement disorder and affects 1% of people over the age of 60 1. Because ageing is  the most important ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are exacerbated when significant brain atrophy and age-related white matter changes (e.g. Leukoaraiosis) are present. Lesion Explorer (LE) is an accurate and reliable neuroimaging pipeline specifically developed to address such issues commonly observed on MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. The pipeline is a complex set of semi-automatic procedures which has been previously validated in a series of internal and external reliability tests1,2. However, LE's accuracy and reliability is highly dependent on properly trained manual operators to execute commands, identify distinct anatomical landmarks, and manually edit/verify various computer-generated segmentation outputs.
LE can be divided into 3 main components, each requiring a set of commands and manual operations: 1) Brain-Sizer, 2) SABRE, and 3) Lesion-Seg. Brain-Sizer's manual operations involve editing of the automatic skull-stripped total intracranial vault (TIV) extraction mask, designation of ventricular cerebrospinal fluid (vCSF), and removal of subtentorial structures. The SABRE component requires checking of image alignment along the anterior and posterior commissure (ACPC) plane, and identification of several anatomical landmarks required for regional parcellation. Finally, the Lesion-Seg component involves manual checking of the automatic lesion segmentation of subcortical hyperintensities (SH) for false positive errors.
While on-site training of the LE pipeline is preferable, readily available visual teaching tools with interactive training images are a viable alternative. Developed to ensure a high degree of accuracy and reliability, the following is a step-by-step, video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer&#039;s Disease and Normal Elderly

Lesion Explorer (LE) is a semi-automatic, image-processing pipeline developed to obtain regional brain tissue and subcortical hyperintensity lesion volumetrics from structural MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. To ensure a high level of accuracy and reliability, the following is a video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Läsion Explorer: Ein Video-geführt, standardisiertes Protokoll für genaue und zuverlässige MRI-abgeleiteten Volumetrics in der Alzheimer-Krankheit und Normale Ältere

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which disrupt normal brain function. Despite treatment with currently available antiepileptic drugs targeting neuronal functions, one third of patients with epilepsy are pharmacoresistant. In this condition, surgical resection of the brain area generating seizures remains the only alternative treatment. Studying human epileptic tissues has contributed to understand new epileptogenic mechanisms during the last 10 years. Indeed, these tissues generate spontaneous interictal epileptic discharges as well as pharmacologically-induced ictal events which can be recorded with classical electrophysiology techniques. Remarkably, multi-electrode arrays (MEAs), which are microfabricated devices embedding an array of spatially arranged microelectrodes, provide the unique opportunity to simultaneously stimulate and record field potentials, as well as action potentials of multiple neurons from different areas of the tissue. Thus MEAs recordings offer an excellent approach to study the spatio-temporal patterns of spontaneous interictal and evoked seizure-like events and the mechanisms underlying seizure onset and propagation. Here we describe how to prepare human cortical slices from surgically resected tissue and to record with MEAs interictal and ictal-like events ex vivo.

We here describe how to perform multi-electrode array recordings of human epileptic cortical tissue. Epileptic tissue resection, slice preparation and multi-electrode array recordings of interictal and ictal events are demonstrated in detail.

Multi-Elektroden-Array Recordings of Human Epileptische Postoperative Rindengewebe

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Mit Saccadometry mit Deep Brain Stimulation Normale und Pathologische Funktion des Gehirns zu studieren

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Mechanical and Controlled PRP Injections in Patients Affected by Androgenetic Alopecia

23 patients (18 male and 5 female) aged 21-70 years who displayed male pattern hair loss (MPHL) in Stage 1 to Stage 5 as determined by the Norwood-Hamilton classification scale, and female pattern hair loss (FPHL) in Stage 1 to Stage 2 as determined by the Ludwig classification scale, were treated with non-activated autologous platelet-rich plasma (A-PRP). Autologous blood (55 mL) was harvested using sodium citrate as an anticoagulant. A-PRP (23 mL) was produced for all cases using a closed system according to the transfusion service protocol. Following centrifugation (260 x g for 10 min) the A-PRP was inserted in a laser light selector device, and after the centrifugation, 9 mL of A-PRP was collected.
The scalp of the patients affected by androgenetic alopecia (AGA) was divided into four areas (frontal, parietal, vertex, and occipital); local anesthesia was not performed. Interfollicular A-PRP injections (0.2 mL x cm2) were performed by controlled and mechanical injections scheduled at a depth of 5 mm using a medical injector gun. Treatment sessions were performed with a 30-day interval. For each patient, three treatment sessions were performed.
PRP was injected in the androgen-related areas of scalp affected by hair loss. Placebo (normal saline solution) was loaded in another syringe (10 mL) and injected on the adjacent side in a similar fashion.

This paper aims to describe the interfollicular autologous platelet-rich plasma injections (0.20 mL x cm2) in the scalp of 23 patients affected by androgenetic alopecia at a depth of 5 mm using a medical injector gun equipped with a 30 gauge needle, in three sessions.