Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Mikrobiologie zu beantworten, wie z. B. wie Der Flüssigkeitsfluss das Wachstum und die Entwicklung von Pilzbiofilmen verändert. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es uns ermöglicht, die Auswirkungen des Flusses auf das Wachstum und die Entwicklung von Biofilmen in Echtzeit quantitativ zu bewerten. Beginnen Sie dieses Experiment mit der Montage des Strömungsgeräts, wie im Textprotokoll beschrieben.
Befestigen Sie am Tag des Experiments die Blasenfalle, die Temperatursonde und alle Einzelkomponenten. Um den Filter zu montieren, entfernen Sie den Kolben aus einer Ein-Milliliter-Spritze, um ihn zu einem Adapter zu machen. Zwingen Sie die Schläuche aus der Filterflasche in dieses Ende und befestigen Sie einen 2 Mikron Filter an den Schläuchen, die zum Wachstumskolben führen.
Tragen Sie Silikonvakuumfett um die Widerhaken des Schiebeadapters auf, bevor Sie ihn anschließen, da dies hilft, Luftlecks in das System zu verhindern. Füllen Sie den Befestigungskolben mit 100 Milliliter YPD und füllen Sie den Wachstumskolben mit 200 Milliliter yPD. Stellen Sie sicher, dass der grüne Seitenschlauch die Medien in jedem Kolben erreicht.
Stellen Sie sicher, dass alle Ventile geöffnet sind. Befestigen Sie die Blasenfalle an einem Vakuum, und schließen Sie die Pumpe an den grünen Seitenschlauch nach der Blasenfalle an. Pumpen Sie die Flüssigkeit mit einer Durchflussrate von 3,3 Milliliter pro Minute, um die grüne Seite vollständig zu füllen.
Dann geben und entsorgen Sie etwa ein bis zwei Milliliter der Medien, da die ersten Paar Milliliter oft abgestorbene Zellen oder zufällige Trümmer enthalten. Stellen Sie sicher, dass die grüne Seite des Schlauches mit Medien gefüllt ist und keine Blasen unterhalb der Blasenfalle hat, bevor Sie fortfahren. Füllen Sie den Kanalschlitten und das Reservoir mit YPD, wobei Darauf geachtet wird, keine Blasen einzuführen.
Schließen Sie die Folie an das Durchflussgerät an. Dann pumpen Sie mehr Flüssigkeit, um einen Puffer von etwa 5 Metern auf der orangen Seite zu schaffen. Dadurch soll verhindert werden, dass bei Rückfluss versehentlich Luft in der Rutsche eingefangen wird.
Bereiten Sie nun das Strömungsgerät für den Transport zum Mikroskop vor, indem Sie zuerst den Ein- und Auslass der Blasenfalle geschlossen pflanzen. Dann klemmen Sie die grünen und orangen Seitenbefestigungsventile geschlossen. Stellen Sie sicher, dass die Schraubverschlüsse für den Pulsationsdämpfer und die Filterflasche dicht sind, da sie sich während der Autoplatierung lösen können.
Trennen Sie die Pumpe von den Schläuchen, um den Transport zu erleichtern. Dann verschieben Sie alle Komponenten, einschließlich des Heißplattenrührers, in einen sekundären Behälter in der Nähe des Mikroskops. Befestigen Sie den Temperaturfühler am Heißplattenrührer und beginnen Sie mit dem Erhitzen des Befestigungskolbens auf 37 Grad Celsius.
Rühren Sie die Medien bei 300 RPM, und halten Sie dies für das gesamte Experiment aufrecht. Montieren Sie das Dia am Mikroskop, und verwenden Sie ggf. Klebeband, um es fest zu befestigen. Befestigen Sie dann die Blasenfalle an einem Vakuum.
Schließen Sie nun die Pumpe an das Durchflussgerät an. Starten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 3,3 Milliliterpro Minute, und lassen Sie sie etwa fünf bis zehn Sekunden laufen. Dann entfernen Sie die Blasenfalle im ausgelassenen Deckel-Clan.
Lassen Sie die Pumpe weiterlaufen, während sich der Befestigungskolben erwärmt. Sobald der Befestigungskolben und die Inkubationskammer bei 37 Grad Celsius sind, fügen Sie genügend Nachtkultur der Pilzzellen zum Befestigungskolben hinzu, um eine Million Zellen pro Milliliter zu erreichen. Warten Sie 15 Minuten, damit sich die Zellen akklimatisieren.
Öffnen Sie sowohl grüne als auch orange Seitenbefestigungsventile, während Sie beide Wachstumskolbenventile schließen, um den Zellfluss zu starten. Warten Sie etwa fünf Minuten, bis Zellen die Folie erreichen können. Während dieser Zeit konzentrieren Sie das Mikroskop und passen Sie es an die gleichen bildgebenden Parameter an, die in früheren Experimenten verwendet wurden.
Beginnen Sie mit der Bildaufnahme für die Anlagenphase. Überprüfen Sie nach etwa fünf und zehn Minuten, um sicherzustellen, dass der Fokus beibehalten wurde. Wenn dies nicht der Fall ist, versuchen Sie, den Fokus unmittelbar nach dem Abgleich des nächsten Bildes anzupassen.
Speichern Sie die Datei unmittelbar nach Abschluss der Anlagenphase. Öffnen Sie dann sowohl grüne als auch orange Seitengmuschelventile, während Sie beide Befestigungskolbenventile schließen. Achten Sie darauf, die Bühne nicht zu stoßen, wenn sich Ventile in der Inkubationskammer befinden.
Ziehen Sie die Thermometersonde ab, und ersetzen Sie den Befestigungskolben durch den Wachstumskolben. Konfigurieren Sie nun die Software so, dass sie alle 15 Minuten über 22 Stunden ein Bild abruft, und beginnen Sie mit der Bildaufnahme für die Wachstumsphase. Sobald die Erfassung der Wachstumsphase abgeschlossen ist und die Datei gespeichert wurde, öffnen Sie die grünen und orangen Seitenbefestigungskolbenventile, die ein Geräusch machen können, wenn der Druck auf der orangen Seite abgibt.
Ziehen Sie auf den grünen Seitenschläuchen, die von beiden Medienkolben kommen, bis sie mindestens mehrere Zentimeter über den Medien liegen. Führen Sie dann die Pumpe mit hoher Geschwindigkeit aus, um alle Medien aus dem Schlauch zu entfernen, was die Reinigung erheblich erleichtert. Schließlich quantifizieren Sie die Videos, wie im Textprotokoll beschrieben.
Dieses Zeitraffer-Dunkelfeldmikroskopie-Video zeigt die Befestigung von Wild-Candida-Albican-Zellen an den Substratunterlauf während der Anhaftungsphase, gefolgt von dem anschließenden Wachstum und der Entwicklung während der Wachstumsphase, die zur Biofilmbildung führt. Die Daten aus diesen Videos können für die Raten der Zellanhaftung und Ablösung und Biomasse im Laufe der Zeit analysiert werden, hier zeigt die gesamte Biomasse innerhalb des Bildgebungsbereichs, die durch densitometrie-Analyse bestimmt wird. Die kumulative Rate der Zellanhaftung und die prozentuale Biomasseablösung im Laufe der Zeit werden ebenfalls angezeigt.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die gleichen bildgebenden Bedingungen für alle Experimente zu verwenden, da dies quantitative Vergleiche zwischen ihnen ermöglicht.
