Das Prototyping synthetischer Gennetzwerke wird durch den Einsatz zellfreier Genexpressionssysteme erheblich verbessert. Unser Protokoll beschreibt den Herstellungsprozess für mehrschichtigen mikrofluidischen Durchflussreaktor und zeigt, dass ein solches Gerät für eine längere zellfreie Expression von GFP verwendet werden kann. Zellfreie Proteinausdrücke in Kombination mit mikrofluidischen Durchflussreaktoren bieten die Rapid Prototyping Plattform für die Entwicklung synthetischer biologischer Geräte.
Dieses gesamte Setup ist sehr vielseitig und kann für die Leitung von biochemischen oder chemischen Reaktionen angepasst werden, die ein hohes Maß an Kontrolle erfordern. Die Gewährleistung der Stabilität der zellfreien Reaktionslösung ist entscheidend und schwer zu erreichen. Achten Sie darauf, sich auf die Bereitstellung einer ausreichenden Kühlung zu konzentrieren und die in diesem Protokoll angegebenen Schläuche zu nutzen.
Die Herstellung und Vorbereitung der experimentellen Plattform erfordert die Verbindung zahlreicher Einzelkomponenten, ein Prozess, der ohne Sehhilfen nur schwer zu verfolgen ist. Zunächst folgen Sie dem begleitenden Textprotokoll, um das mikrofluidische Gerät herzustellen und die pneumatische Steuerung und Durchflussdruckregelung einzurichten, die zur Steuerung der für dieses Gerät kritischen Ventile verwendet wird. Um die Off-Chip-Kühlung einzurichten, beginnen Sie mit dem Aufwickeln einer Länge von PTFE-Schläuchen auf die kaltwandige Fläche eines Peltier-Elements und sichern Sie die Spule mit Klebeband.
Stellen Sie sicher, dass ein Ende des PTFE-Schlauchs mit den Reservoirs des Durchflussschichtdruckregelsystems verbunden ist und dass das andere Ende nicht mehr als einen Zentimeter von der Peltier-Oberfläche ragt. Als nächstes legen Sie eine fünf bis zehn Zentimeter lange PEEK-Schläuche in das hervorstehende Ende des PTFE-Schlauchs ein. Tragen Sie eine ausreichende Menge an thermischer Verbindung auf die heiße Fläche des Peltier-Elements auf und legen Sie es auf die kalte Platte des Wasserblocks.
Stellen Sie sicher, dass der Schlauch, das Peltier-Element und der Kühlblock jederzeit in direktem Kontakt miteinander stehen. Schließen Sie das Peltier-Element über einen seriellen Busstecker an den Temperaturregler an, damit die dem Peltier zugeführte Spannung reguliert werden kann. Platzieren Sie dann sicher einen Thermistor auf der Peltier-Oberfläche und schließen Sie dessen Ausgang an den Temperaturregler an.
Nach dem Einschalten des Wasserkühlers passen Sie die dem Peltier zugeführte Spannung an, bis die Temperatur bei vier Grad Celsius stabil ist. Für jeden Steuerkanal des mikrofluidischen Geräts schneiden Sie eine Länge von Standardschläuchen, die einen Meter lang ist. Legen Sie an einem Ende den Stift eines 23-Messgeräts, einen halben Zoll Luer-Stub und am anderen Ende einen Edelstahl-Anschlussstift ein.
Verbinden Sie den Luer-Stub mit einem 3/32 Zoll langen Luer-Barbed-Nylon-Stecker und stecken Sie den Widerhaken des Steckers in eine Länge von Polyurethan-Schläuchen. Dann legen Sie diese Polyurethan-Schläuche direkt in eines der Magnetventile ein. Als nächstes einen 23 Gauge halb Zoll Luer-Stub an einer Spritze befestigen und in ein drei bis vier Zentimeter langes Stück Standardschläuche einlegen.
Legen Sie das offene Ende dieser Schläuche in ein Reservoir mit reinem Ultrawasser und füllen Sie die Spritze mit ultrareinem Wasser. Nummeren Sie jeden Steuerkanal des mikrofluidischen Geräts, wie hier gezeigt. Für die Kanäle vier bis 29 den entsprechenden Schlauch finden und den Metallstift in das offene Ende des an der Spritze befestigten Schlauchs einlegen.
Dann wasser in den Steuerkanalschlauch injizieren, bis die Hälfte der Länge gefüllt ist. Trennen Sie anschließend den Schlauch von der Spritze und stecken Sie den Edelstahl-Steckerstift in das entsprechende Loch des mikrofluidischen Geräts. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Steuerkanäle.
Verwenden Sie nun die Steuerschnittstelle, um alle Magnetventile zu öffnen. Dadurch wird die Flüssigkeit innerhalb des Steuerkanalrohres unter Druck gesetzt, die sie in das mikrofluidische Gerät zwingt und alle membranbasierten Ventile innerhalb des Geräts schließt. Für jeden der ungekühlten Reagenzien schneiden Sie eine MeterLänge von Standardschläuchen, um den Behälterauslass mit den einlässen mikrofluidischen Geräten zu verbinden.
Nehmen Sie ein Ende des Schlauches und legen Sie diese in das Reservoir ein, um sicherzustellen, dass der Schlauch die Basis des Reservoirs erreicht. Der Behälterrohrauslass sollte so angezogen werden, dass eine luftdichte Abdichtung erreicht wird. Setzen Sie dann einen Rostanschlussstift in das offene Ende des Schlauches ein.
Als nächstes befestigen Sie einen 23 Gauge halben Zoll Luer-Stub am Ende einer Ein-Milliliter-Spritze. Fügen Sie dem Luer-Stub eine kurze Länge von Standardschläuchen hinzu. Legen Sie das Ende des Schlauches in die gewünschte Reagenzlösung und füllen Sie die Spritze mit dem Reagenz.
Legen Sie dann den Edelstahl-Steckverbinderstift in den mit der Spritze verbundenen Polyurethanschlauch ein und füllen Sie den Schlauch mit dem Reagenz. Bei Verwendung kleiner Reaktionsvolumina gelangt das Reagenz nicht in das Reservoir und der Schlauch selbst fungiert als Reservoir. Trennen Sie nach Fertigstellung die Spritze, und stecken Sie den Steckerstift in eine der Einlasslöcher der Mikrofluidanlage.
Dann drücken Sie auf jedes reservoir mit der Druckregler-Software, um die Reagenzien in das mikrofluidische Gerät zu zwingen. Stellen Sie sicher, dass die Wasserkühler und Peltier-Elemente eingeschaltet wurden, wobei die Oberflächentemperatur des Peltier auf vier Grad Celsius eingestellt ist. Montieren Sie das Kühlsystem so nah wie möglich am mikrofluidischen Gerät, um das ungekühlte Volumen zwischen dem Peltier und dem Geräteeinlass zu minimieren.
Dann verbinden Sie die eine die ein Milliliter Spritze mit einem 23 Gauge halb Zoll Luer Stub mit einer kurzen Länge der Standard-Schläuche am Ende befestigt. Ziehen Sie das zu kühlende Reagenz ein, um die Spritze zu füllen. Als nächstes verbinden Sie den PEEK-Schlauch über den Bindeschlauch mit der Spritze und drücken Sie konstant auf die Spritze, die das Reagenz durch den PEEK-Schlauch und in den PTFE-Schlauch zwingt.
Trennen Sie schließlich den PEEK-Schlauch von der Spritze und legen Sie ihn direkt in die Durchflusskanaleinlässe des mikrofluidischen Geräts ein. Wenn Druck ausgeübt wird, wird das gekühlte Reagenz in das mikrofluidische Gerät gedrückt. Stellen Sie sicher, dass das mikrofluidische Gerät auf der Mikroskopbühne sicher ist, wobei alle Kontroll- und Durchflussschichtschläuche befestigt sind und alle Öffnungen am Inkubator schließen.
Als nächstes stellen Sie die Umgebungstemperatur des Inkubators auf 29 Grad Celsius. Stellen Sie dann sicher, dass das Kühlsystem eingeschaltet ist und auf vier Grad Celsius eingestellt ist, bevor Sie das Experiment einschalten. Prüfen Sie, ob die auf den Durchflussdruckregler ausgeübten Drücke auf 800 Millibar eingestellt sind, und stellen Sie mit der Software den Ausgangsdruck jedes einzelnen Durchflusskanals auf 20 bis 100 Millibar ein.
Prüfen Sie, ob der Druck auf die Magnetventile des Steuerkanals für die Kanäle eins bis acht und drei bar für die Kanäle 9 bis 29 einen Balken beträgt. Schließen Sie als Nächstes den Auslass des Geräts, indem Sie Kanal 29 unter Druck setzen und gleichzeitig die Steuerkanäle eins bis drei und 15 bis 28 drücken. Drücken Sie dann selektiv die Steuerkanäle des Multiplexers, damit ein einzelnes ausgewähltes Reagenz in das Gerät fließen kann.
Verwenden Sie das Mikroskop, um die Entfernung von Luft zu überwachen und anschließend sicherzustellen, dass alle Reagenzien korrekt fließen, ohne Luftblasen einzuführen. Richten Sie mit dem mitgelieferten Softwarepaket die Datenfelder zum Kalibrierungsprozess ein, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Anschließend bestimmen Sie das Flüssigkeitsvolumen, das während eines einzelnen Zulaufschritts aus jedem Reaktor verschoben wird, indem Sie das Kalibrierprotokoll ausführen.
Befolgen Sie die von der Steuerungssoftware vorgestellten Schritte, um die Analyse des Kalibrierexperiments abzuschließen und das Aktualisierungsverhältnis jedes Ringreaktors im mikrofluidischen Gerät zu bestimmen. Legen Sie schließlich die erforderlichen Werte für das gewünschte Experiment innerhalb der virtuellen Steuerungsschnittstelle fest. Initiieren Sie das experimentelle Protokoll, indem Sie die Schaltfläche "Experiment ausführen" in der Steuerschnittstelle drücken.
Während eines Kalibrierversuchs werden die Reaktoren mit einem Fluorophor gefüllt, dessen Intensität nach jeder Verdünnung aufgezeichnet wird. Die Abnahme der Fluoreszenzintensität pro Verdünnung zeigt das Volumen des Reaktorrings, der für die eingestellte Anzahl von Zulaufschritten verschoben wurde. Dieses Volumen wird als Aktualisierungsverhältnis bezeichnet.
Das durchschnittliche Aktualisierungsverhältnis und die Standardabweichung werden für jeden Verdünnungsschritt rot dargestellt. Sieben der acht Reaktoren weisen ein sehr ähnliches Verhalten auf, ein Reaktor weist jedoch Schwankungen nach dem siebten Verdünnungszyklus auf. Dies unterstreicht die Notwendigkeit einzigartiger Aktualisierungsverhältnisse für jeden Reaktor.
Die hier gezeigte verlängerte In-vitro-Transkription und Übersetzungsreaktion hatten alle 14,6 Minuten 30 % des Reaktorvolumens verschoben. Zwei Reaktoren des mikrofluidischen Geräts, wo als Rohlinge verwendet. Alle anderen Reaktoren umfassten 75% in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionslösung und 25% entweder ultrareines Wasser oder 2,5 nanomolar lineare DNA-Vorlagen, die für die Expression des DeGFP-Proteins kodiert wurden.
In allen vier Reaktoren, in denen DNA hinzugefügt wurde, gab es eine klare DeGFP-Expression. Ein Reaktor zeigt ein niedrigeres Fluoreszenzsignal an. Dies könnte durch Unterschiedliche im Durchfluss, die zu weniger DNA in den Reaktor führen, oder durch Schwankungen der Reaktorabmessungen verursacht werden.
Nach 14 Stunden ist ein plötzlicher Anstieg des Signals der DNA-haltigen Reaktoren zu beobachten. Dies wird durch eine Luftblase verursacht, die in die Strömungsschicht des mikrofluidischen Geräts eindringt. Nach Wiederaufnahme des Flusses kehrt das Experiment zu seiner vorherigen Fluoreszenzintensität zurück.
Zellfreie Reaktionslösungen unterliegen im Laufe der Zeit einer Verschlechterung, es sei denn, sie sind ausreichend gekühlt, was den in diesem Protokoll beschriebenen Kühlprozess von entscheidender Bedeutung macht. Durch die Vielseitigkeit der Plattform können eine Vielzahl biochemischer und chemischer Reaktionen präzise und kontrolliert durchgeführt werden. Die Anwendung von mikrofluidischen Durchflussreaktoren hat aufeinanderfolgende Design-Build-Testzyklen für das Prototyping von doppelten genetischen Schaltkreisen beschleunigt.
