1. Wirtszelle Transfektion <ol><li> Seed 2 x 10 6 CHO-Zellen in T75 DXB11 Corning Zellkulturflasche in 15 ml Wachstumsmedium (MEMA mit Nukleotide und Nukleoside (Gibco, Katalog-Nummer 12571) ergänzt mit 10% γ-bestrahlt gekennzeichnet Rinderfötenserum (CFB) (HyClone, Katalog-Nummer SH30071.03) und 10 mL / L von 45% Glucose-Lösung (Sigma, Katalog-Nummer G8769)) einen Tag vor der Transfektion. </li><li> Zum Zeitpunkt der Transfektion, bereiten Transfektionskomplexe wie folgt: <ol class="lalpha"><li> Verdünnen 8 pg DNA in 800 ul des Wachstums Medium ohne Serum in ein steriles Reaktionsgefäß. Vorsichtig mischen. </li><li> Verdünnen Sie 40 ul Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) in 800 ul des Wachstums Medium ohne Serum in einem Polystyrol-Röhrchen. </li><li> Fügen Sie die verdünnte DNA, um die verdünnte Lipofectamine ™. Vorsichtig mischen und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Wachstumsmedium von den Zellen in T75 und ersetzen mit 6,4 ml Wachstumsmedium ohne Serum. Fügen Sie die 1,6 ml Transfektionskomplexe in den Kolben. Vorsichtig mischen durch Schwenken der Platte. </li><li> Inkubieren Zellen bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator für 6 Stunden. </li><li> Add 8 ml Nährmedium in den Kolben und bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator über Nacht. </li><li> Entfernen Medium durch Absaugen und fügen frisches Wachstumsmedium in den Kolben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator über Nacht. </li><li> Ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit Selektionsmedium (MEMA-Medium ohne Nukleotide oder Nukleoside (Gibco, Katalog-Nummer 12561) ergänzt mit 10% γ-bestrahlten dialysiert fötales Rinderserum (DFBs) (HyClone, Katalog-Nummer SH30079.03) und 10 mL / L 45 % Glucose-Lösung (Sigma, Katalog-Nummer G8769)). </li><li> Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator für 2-3 Wochen. </li></ol> 2. Das Klonen mittels Durchflusszytometrie Activated Cell Sorting <ol><li> Verdrängen Zellen aus dem Kolben und Zentrifuge bei 800 rpm für 5 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in Selektionsmedium mit 2% Rinderserumalbumin und fluoreszenzmarkierten anti-human IgG-Antikörper bei 1:20 Verdünnung ergänzt. </li><li> Inkubieren auf Eis für 15-30 Minuten und dann zweimal mit kaltem PBS. Die Zellen in 1x PBS in einem Polypropylen-Rohr. </li><li> Bereiten Sie für die aseptische Art auf einer BD FACSAria ™. Bereiten 96-well Zellkulturplatte, die 200 ul Selektionsmedium in jede Vertiefung enthält. </li><li> Aseptisch Belastung der Röhre mit Zellen und zu analysieren, auf BD FACSAria ™, notieren Sie die Ergebnisse für gefärbten und ungefärbten Zellen. </li><li> Setzen Sie den Toren und Einstellungen auf einzelne Zellen des gewünschten Fluoreszenzfärbung Profil in 96-Well-Platte (n) zu sortieren. <ol class="lalpha"><li> Die transfizierten Zellen werden zunächst auf der Grundlage Vorwärtsstreuung gegenüber side scatter analysiert. Ein Tor für die lebenden Zellen basiert auf forward scatter, die eine Zelle der Größe und side scatter, die eine Zelle die Komplexität oder Granularität Maßnahmen Maßnahmen gemacht. </li><li> Die Zellen, die innerhalb dieses Tor fallen, sind dann für PE-Färbung untersucht. PE negative Gate ist für ungefärbte transfizierten Zellen oder gebeizt Wirtszellen gesetzt. Als gebeizt transfizierten Zellen durch FACS untersucht werden, ist die &quot;High PE&quot; gate dann abgegrenzt zu den Top 5% aller Zellen, die positiv für PE-Färbung umfassen. </li></ol></li><li> Die Inkubation bei 37 ° C Inkubator für zwei Wochen. </li></ol> 3. Dokumentation der Koloniebildung durch CloneSelect ™ Imager Document Koloniebildung in 96-Well-Platten auf CloneSelect Imager ™ am Tag 0, Tag 3, Tag 7 und Tag 13 nach FACS-Sortierung. Die Bilddokumentation wird dafür sorgen, Selektion von Klonen aus einer einzigen Zelle ab. Ein entscheidender Schritt in dieser Dokumentation ist immer der Brennebene richtig für den Tag 0 Messung eingestellt, da es nur eine Zelle in jedem gut an diesem Punkt. Es ist sehr wichtig, dass die Bilder von den einzelnen Zellen im Mittelpunkt stehen und versuchen, den Fokus auf sie einstellen können im besten Fall irreführend sein. Die Brennebene kann erheblich variieren zwischen den Marken von Platten und möglicherweise sogar von Charge zu Charge der gleichen Marke. So einer vorgegebenen Brennebene verwendet werden muss. Dies kann durch die Konzentration auf Test-Mikroperlen oder High-Density-Zellen auf Platten aus der gleichen Charge verwendet hinterlegt erreicht werden. Alternativ können ausgewachsen Platten aus der gleichen Charge für diesen Zweck verwendet werden. Nach FACS-Sorting, ist es auch wichtig, damit die Zellen für mindestens 2 Stunden vor Bildgebung zu regeln, so dass sie in der &#39;fixed&#39; in der Position auf der Platte. 4. Screening und Auswahl von hoch produktiven Klone <ol><li> Document Probenposition in der empfangenden 96-Well-Assay-Platten. </li><li> Transfer-Aliquots von 20 ul Überstand (verdünnen) in 96-Well-Assay-Platten durch die Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System. Diese flexible und in der Lage Roboteric-Plattform hat für diese und andere automatisierte Zellkultur Arbeit angepasst. Spezielle Programme wurden geschrieben, um bestmöglich zu nutzen und zur Verbesserung der Freedom EVO Roboter-Fähigkeiten für die Entwicklung von Zelllinien. Ein Beispiel dafür ist die Einstellung der Tecan CloneSelect ™ Imager Daten zur Probenahme Brunnen mit einzelnen Kolonien zu interpretieren. Andere Programme erforderlich waren, um zusätzliche Zellkultur Aufgaben wie durchführen, um die geeigneten Verdünnungen der Proben, zu interpretieren, Katalog und Probe manuell markiert Platten zu machen, wenn erforderlich, zu skalieren hohe produzierende Klone, etc. Viele dieser Programme leicht angewendet, um 384-Well-Platten sowie die ursprüngliche 96-Well-Format. </li><li> Antikörper-Produktion in den Proben wird durch ein Sandwich menschliche IgG Nachweis ELISA (Pierce, Rockford, IL) auf dem Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System analysiert. <ol><li> Proben und Standard (Human Myelom IgG1, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) wurden auf vorbeschichtete Bio Coat Anti-Human IgG Assay-Platten (BD Biosciences, San Jose, CA) geladen. </li><li> Die Platten wurden bei Raumtemperatur für zwei Stunden durch drei PBS gewaschen, gefolgt inkubiert. </li><li> ImmunoPure Goat Anti-Human IgG (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) wurde die Platte in einer 1:2000-Verdünnung zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen, bevor Sie ABTS Substrat (Pierce, Rockford, IL) und wurden auf einem Teller Leser mit Absorption bei 405 nm zur Detektion lesen. </li></ol></li><li> Wählen Sie hochproduktive Klone und bewerten die Produktivität in Suspensionskultur. Für Fed-Batch-Kultur wurden die Zellen bei 0.3X106 Zellen / ml in Protein-freiem Medium JRH unmittelbaren Vorteil geimpft 65578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) mit 5 g / L Soja-Hydrolysat (DMV International, Katalog-Nummer SE50MAF-UF, viel ergänzt Zahl) und bei 37 ° C mit 7,5% CO 2. Die Kultur weiter und wurden mit 2 g / L Glucose (Sigma, Katalog-Nummer G8769, Losnummer 098K2329), wenn Glucose plus Laktat-Konzentration in der Kultur unter 2 g / L erreicht, und fütterte 2 mM Glutamin (Gibco, Katalog-Nummer 25030 ergänzt, Losnummer 568177), wenn Glutamin unter 200 erreichbar mg / L (Metaboliten von YSI Bioanalyzer gemessen). Fed-Batch-Kulturen wurden am Tag 14 und Antikörper-Produktion beendet wurde durch Umkehrphasen-HPLC gemessen. </li><li> Genetische Charakterisierung von Kandidaten Klone durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) 5. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Ein Beispiel der Entwicklung von Antikörper produzierende Klone mit den hohen Durchsatz Methode ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Transfizierten Zelle Pool wurde mit fluoreszenzmarkierten anti-human IgG-Antikörper (Abbildung 1A) gebeizt, analysiert und sortiert auf BD FACSAria ™ (Abbildung 1B). Colony Formation in 96-Well-Platte wurde auf CloneSelect Imager ™ (Abbildung 1C) abgebildet. Zellkulturüberstand wurde aus Brunnen, die einzige Kolonie enthalten beprobt und untersucht mittels ELISA auf die Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System (Abbildung 1D). Hochproduktive Klone wurden aus Zellen, die höhere Oberflächentemperatur Antikörperspiegel durch Färbung mit fluoreszenzmarkierten anti-human IgG wider ausgestellt gefunden. Beim Vergleich der Klone aus zwei Populationen der ursprünglichen transfizierten Zell-Pools, einen großen Unterschied in der Produktivität in Fed-Batch-Kultur beobachtet (Abbildung 2) erzeugt wurde. Für die ersten beiden Klone aus der Zellpopulation mit hoher Oberfläche Antikörper Ausdruck (PE hoch) erzeugt wird, reicht die spezifische Produktivität von 50 bis 70 pg / Zelle / Tag. Während die Antikörper-Produktivität betrug ~ 20 pg / Zelle / Tag für die ersten beiden Klone aus der Zellpopulation mit geringer Oberfläche Antikörper Ausdruck (PE niedrig) generiert. Darüber hinaus sind Zelllinien durch FACS-Sortierung entwickelt stabiler in Bezug auf Antikörper-Produktion als solche, die durch manuelle Kalkung Verdünnung (Abbildung 3A) geklont wurden. Die spezifische Produktivität der Top-Klon, &quot;Clone 1&quot;, durch manuelle Kalkung Verdünnung erzeugten fiel von ~ 30 pcd um ~ 10 nach Kultivierung für 80 Zellverdopplungen pcd. Auf der anderen Seite, oben Subklon durch FACS-Sortierung, &quot;Clone 2&quot; erzeugt werden, konnte die spezifische Produktivität um rund 20 pcd für mindestens 100 Zellverdopplungen aufrecht zu erhalten. Durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) haben wir gezeigt, Klon 1 zeigte eine gemischte Population von Phänotyp A (85%) und Phänotyp B (15%). Im Gegensatz dazu FACS Klon sortiert (Klon 2) zeigte, um eine homogene Bevölkerung, mit 99,5% der Zellen erwies sich als Phänotyp A (Abbildung 3B). <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Entwicklung von Fertigungs-Zelllinien für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern aus CHO-Zellen. A) Oberfläche Färbung der ersten transfizierten Zelle Pool mit fluoreszenzmarkierten anti-human IgG-Antikörper. B) Die Sortierung der Zellpopulation mit hoher Fluoreszenzintensität (PE hoch) und niedrige Fluoreszenzintensität (PE low) in 96-Well-Platte. C) Dokumentation KolonieBildung von Tag 0 bis Tag 13 post Aussaat auf CloneSelect Imager ™. D) Screening-Klone mittels ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Oberfläche verbunden Antikörpertiter korreliert mit Antikörper-Produktivität der Zelle. Klone mit hoher und niedriger Fluoreszenzfärbung waren beide in Zelllinien entwickelt und evaluiert in Fed-Batch-Kultur. Volumetrische Titer und die spezifische Produktivität wurden zwischen top 2 Klone jeder Population verglichen. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Klone aus FACS-Sorting weisen sie eine höhere genetische Homogenität und Stabilität Klon erzeugt. A) Antikörper-Produktion Stabilität in Batch-Kultur für ~ 80 Zellverdopplungen Kultur verstrichene Zeit. Δ, wurde der Klon durch limitierende Verdünnung, bei der Zellen bei 2000 Zellen ausgesät wurden / well, 1000 Zellen / Well und 500 Zellen / well erzeugt. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Schwarzes Dreieck" /> , Wurde der Klon durch FACS bei 1 Zelle / well erzeugt. B) Transgene Integration vor Ort in CHO-Zellen-Chromosom wird durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung identifiziert.

<ol>
	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

Die Autoren dieses Artikels sind die Mitarbeiter von Merck &amp; Co., Inc., die Verwendung dieser Methode für die großtechnische Herstellung von Protein-Therapeutika von Säugetier-Zelllinien.

Wir präsentierten eine automatisierte Fertigung zur Entwicklung von Zelllinien-Plattform, die Isolierung von hoch produktiven Klonen ermöglicht, und in der Zwischenzeit, während sichergestellt, Klonalität und Klon Stabilität. Das Engagement der Oberfläche Antikörper-Färbung von FACSAria ™ cell sorting gefolgt ist der Schlüssel zum Erhalt einzelner Klone mit hohen Antikörper-Produktivität. Unsere Ergebnisse und weitere Berichte 2-4 zeigen, dass die Antikörper-Ebene vorübergehend auf der Zelloberfläche angezeigt und mit der Produktivität der Zelle korreliert. So kann ein Fluorescein-konjugierten Antikörper verwendet, um die Membran zugehörigen Produkt zu erkennen und Hilfe zur Isolierung von hoher Produzenten werden. Alternativ haben Koexpression von Reporter-Genen und Gel microdrop Technologie eingesetzt, um die Auswahl an High-produzierende Klone durch FACS 6-8 erleichtern. Zusätzlich zu isolieren hohe produzierende Klone via FACS, haben andere Technologien entwickelt, um das gleiche Ziel zu erreichen. Dazu gehören Trellis Bioscience CellSpot Technologie, microspere Antikörper-Detection-Systeme und Laser-Screening-Technologie nutzt, um hochproduktive Klone zu identifizieren und zu eliminieren unerwünschte Zellen, Genetix ClonePix FL und StemCell Technologies ClonaCell EasyPick Plattform, die das Hochdurchsatz-Screening der Produktion Zelllinien mit Hilfe eines Fluoreszenz-Antikörper-Nachweis-System durchführen . Wir entschieden uns für die FACS Klonen Methode an der Oberfläche verbunden Antikörperspiegel Basis implementieren, da es die Einfachheit der Bedienung, Selektivität auf die Produktivität und Klonalität verbindet. Die Beschäftigung von Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System deutlich erhöht Screening-Durchsatz, der die Möglichkeit, sich für High-Yield-Klone aus einer viel größeren Zellpool wählen können. Andere Instrumente zur Analyse, wie HTRF, Bioforte Oktett, HPLC, etc, sind alle möglichen Mittel zur Auswahl Hochproduzenten und Screening niedrigen Produzenten. Durch die Verfolgung Klon Formation mit CloneSelect Imager ™ erwirtschafteten wir erforderlichen Unterlagen Klonalität mit digitalisierten Zelllinie Geschichte zu beweisen. Klonalität wird durch genetisch charakterisieren einzigen Transgen-Integration vor Ort auf dem Chromosom bestätigt. Eine Subklonierung Schritt, der in der Regel getroffen werden, um Klonalität zu gewährleisten, kann somit entfallen. Dies wird 4-8 Wochen Zeit für die Entwicklung von Zelllinien zu speichern. Zusammenfassend zeigten die Qualität Zelllinien durch die High-Throughput-automatisierte Plattform generiert eine hohe Produktivität, Produktion Stabilität und dokumentiert Zelllinie Geschichte, dass die Nachfrage für eine groß angelegte Produktion und aktuellen regulatorischen Anforderungen erfüllen sollte.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ Cell Sorter </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System </td><td> Tecan Group </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

Die schnell wachsenden biopharmazeutischen Industrie fordert rasche Entwicklung von hocheffizienten und zuverlässigen Produktionssysteme auf die zunehmende Forderung nach Medikamenten versorgt gerecht zu werden. Die Erzeugung von Produktions-Zelllinien ist traditionell manuellen Operationen, die arbeits-, Low-Durchsatz und anfällig für menschliche Fehler beteiligt sind. Wir berichten hier ein integriertes High-Throughput-und automatisierte Plattform für die Entwicklung der Herstellung von Zelllinien für die Herstellung von Protein-Therapeutika. Die Kombination von BD FACS Aria ™ Cell Sorter, CloneSelect ™ Imager und Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling-System hat einen hohen Durchsatz und eine effizientere Entwicklung von Zelllinien Prozess aktiviert. In diesem Betrieb werden die Produktion Wirtszellen zuerst mit einem Expressionsvektor trägt das Gen von Interesse 1, durch die Behandlung mit einer Auswahl Agenten gefolgt transfiziert. Die stabil transfizierten Zellen werden dann mit Fluoreszenz-markierten Anti-Human-IgG-Antikörper gefärbt und sind anschließend im Rahmen Durchflusszytometrie 2-4. Hochproduktive Zellen werden auf der Grundlage Fluoreszenzintensität ausgewählt und werden von single-cell sorting auf einer BD FACSAria ™ isoliert. Colony Bildung von Einzel-Zell-Stadium wurde mikroskopisch erkannt und eine Reihe von Zeit-Runden digitalen Bilder werden von CloneSelect ™ Imager für die Dokumentation der Zelllinie Geschichte genommen. Nach einzelnen Klone gebildet haben, wurden diese Klone für die Produktivität durch ELISA auf einem Tecan Freedom EVO ® Liquid-Handling durchgeführt System gezeigt. Etwa 2.000 - 10.000 Klone können pro Arbeitstakt mit dem aktuellen System-Setup zu sehen sein. Dieser integrierte Ansatz wurde genutzt, um hohe Produktion von chinesischen Hamsters (CHO)-Zelllinien für die Herstellung von therapeutischen monoklonalen Antikörper (mAb) sowie deren Fusionsproteine ​​zu erzeugen. Mit Hilfe der verschiedenen Arten der Erfassung Sonden kann die Methode für die Entwicklung anderer Protein-Therapeutika eingesetzt werden oder in andere Produktions-Host-Systeme angewendet werden. Im Vergleich zu den herkömmlichen manuellen Verfahren zeigte diese automatisierte Plattform Vorteile von erheblich erhöhter Kapazität, gewährleistet Klonalität Rückverfolgbarkeit in Zelllinie Geschichte mit elektronischer Dokumentation und einer stark reduzierten Möglichkeit in Bedienfehler.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Ein High-Throughput-, automatisierten Plattform zur Herstellung von Zelllinien-Entwicklung für die Herstellung von Protein-Therapeutika wird beschrieben. Implementierung von BD FACS Aria Cell Sorter hat CloneSelect Imager und Tecan Freedom EVO Liquid-Handling-System deutlich erhöht Verarbeitungskapazität in Zelllinien-Entwicklung mit verbesserten Zell-Linie Qualität und hohe Reproduzierbarkeit nachgewiesen.

Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

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Research

JoVE Journal

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22.1K Aufrufe.  Merck & Co., Inc. Ein High-Throughput-, automatisierten Plattform zur Herstellung von Zelllinien-Entwicklung für die Herstellung von Protein-Therapeutika wird beschrieben. Implementierung von BD FACS Aria Cell Sorter hat CloneSelect Imager und Tecan Freedom EVO Liquid-Handling-System deutlich erhöht Verarbeitungskapazität in Zelllinien-Entwicklung mit verbesserten Zell-Linie Qualität und hohe Reproduzierbarkeit nachgewiesen.

Serie: A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Maus Eye Enukleation für Remote High-throughput Phänotypisierung

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Forschung

Medizin

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

Die Verwendung von Zystometrie in kleine Nagetiere: A Study of Bladder Chemosensorik

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

Intranasale Verabreichung von CNS Therapeutics Awake Mäuse

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex-vivo-Ansprechen auf die Behandlung von Primärtumoren und / oder assoziierten Metastasen für die präklinische und klinische Entwicklung von Therapeutika

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

Isolierung und Immortalisierung von Patienten stammende Zelllinien von Muskelbiopsie for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Hochdurchsatzanalyse optischer Mapping-Daten mit ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...