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1. Kompilieren einer Bibliothek von Bait und Prey-Plasmid-Expressionsvektoren <ol><li> Stellen Sie eine Liste von Zelloberflächen-Rezeptor und sezernierte Proteine ​​von Interesse für die Wechselwirkungen abgeschirmt werden und rufen ihre Sequenzen aus einem geeigneten Protein-Sequenz-Datenbank. Die meisten Proteine ​​mit einer N-terminalen sekretorisches Signalpeptid geeignet sind (diese sind vom Typ I, GPI-linked und sekretierte Proteine). Typischerweise würde ein Protein-Familie (zB Immunoglobulin-Superfamilie oder alle Rezeptoren beschränkt auf einen spezifischen Zelltyp wie die Erythrozyten) ausgewählt werden. </li><li> Bestimmen des Ausmaßes der extrazellulären Regionen durch Identifizieren der Stelle des Signalpeptids und Transmembran-Region unter Verwendung von Protein-Funktion Vorhersage-Software. Wir verwenden in der Regel SignalP v3.0 5 und 6 TMHMM v2.0. </li><li> Design-Primer-Sets, die den gesamten Ektodomäne Fragment für jeden Rezeptor verstärken. Wir haben eine Reihe von Bait und Prey-Vektoren, die für diesen Zweck geeignet sind, die eine sindvailable aus Addgene ( <a href="http://www.addgene.org/">http://www.addgene.org/~~V</a> ). Entwerfen der Sense-Primer um das Start-Methionin eine NotI Restriktionsenzym und eine optimale Kozak-Sequenz umfassen, das um 25 Basenpaare genaue Übereinstimmung Gen-spezifischen Sequenz (2A) gefolgt. </li><li> Entwerfen des Antisense-Primers an Typ I-Rezeptor-Proteine ​​unmittelbar vor der vorhergesagten Transmembrandomäne, um so die gesamte Ektodomäne als lösliches rekombinantes Protein zu exprimieren abzuschneiden. Einschließen einer AscI Restriktionsstelle in diesem Primer, die dann in demselben Raster mit einer C-terminalen Ratte Cd4d3 4 Protein-Tag 7 (2A) sollte übersetzen. </li><li> Verstärken der Ektodomäne Fragmente aus allen Genen unter Verwendung dieser Primer und zu klonen in den Köder und Beute-Vektor. Wir finden es manchmal hilfreich, zuerst zu klonen sie in Shuttle-Vektoren vor Subklonierung in einen geeigneten Säugerexpressionsvektor wir ein Derivat des Vektors pTT3 3,4 zu verwenden. Sowohl die Köder und Beute Vektoren Contain C-terminalen Protein-Tags wie folgt (Abb. 2B). <ol><li> Köder: Ein Etikett mit Domänen 3 und 4 der Ratten-CD4 (Cd4d3 +4)-Protein durch eine Peptidsequenz, die ein Substrat für die E. coli BirA Enzym gefolgt und kann daher zu einem bestimmten Lysinrest monobiotinylierte werden (2B) . Die Cd4d3 4-Tag wird vom OX68 monoklonalen Antikörper erkannt wird und verwendet wird, um die Expression der Köderproteine ​​durch ELISA quantifiziert. Die Köder-Proteine ​​sind daher monomeren und monobiotinylierte. Zusätzliche Köderprotein Vektoren, wo die biotinylatable Peptid, das durch eine 6-His-Tag zur Aufreinigung ersetzt ist, sind verfügbar. </li><li> Beute: Die Beute auch eine Ratte Cd4d3 4-Tag durch eine Peptidsequenz aus der Ratte Knorpel oligomere Matrix-Protein (COMP) und einer C-terminalen β-Lactamase-Enzym an. Die COMP-Peptid sorgt die Beute Formen Pentamere einmal zum Ausdruck gebracht (Abb. 2B). </li></ol></li></ol> 2. Prey-und Bait-Protein-Expression Wir verwendenein bequemer Expression auf hohem Niveau unter Verwendung Suspensionskultur der HEK293-Zelllinie 4 an unsere Protein-Bibliotheken zu erzeugen, sondern auch jedes Säuger-Expressionssystem geeignet sein. Eine handelsübliche Alternative ist die Freestyle-System. Die Zellen werden routinemäßig auf einem Schüttler (125 rpm) bei 37 ° C, 5% CO 2 bei 70% relativer Luftfeuchtigkeit. Sowohl positive als auch negative Kontrolle Proteine ​​müssen ebenfalls angegeben werden. Die Ratte Cd4d3 4-Tag-nur-Fragment ist sowohl als Köder und Beute und eignen sich negative Kontrollen. Ebenso sind Köder und Beute-Vektoren, die eine positive Kontrolle kodieren verfügbar (Addgene); wir verwenden in der Regel die Ratte CD200-Interaktion CD200R 8. <ol><li> Saatgut den HEK293 Zellen am Tag vor der Transfektion in einer Dichte von 2,5 x 10 5 Zellen ml -1. Wir routinemäßig Kultur der Zellen in Volumina von 50 ml in Freestyle293 Medien nach den Empfehlungen des Herstellers. Um eine effiziente Biotinylierung zu gewährleisten, zu ergänzen ter Zellkulturmedium verwendet, um Köderproteine ​​mit D-Biotin zu einer Endkonzentration von 100 pM zu erzeugen. Medium verwendet, um die Beute-Proteine ​​zu exprimieren muss nicht mit zusätzlichen D-Biotin ergänzt werden. </li><li> Am folgenden Tag Transfektion von Zellen mit einer geeigneten Transfektionen Reagenz (zB 293fectin). Verwenden 25 ug des Köders oder Prey-Plasmids Konstrukte, um eine 50 ml-Kultur zu transfizieren. An die biotinylierten Köder zu erzeugen, Co-Transfektion der Plasmid, welches das Köder mit einem Plasmid, das eine sekretierte Form des E. coli-Protein-Biotin-Ligase kodiert Konstrukt ( BirA), die vom Addgene ist. Co-Transfektion von Plasmiden Köder bei einem Verhältnis von 10:1 (2,5 ug) des Plasmid, welches das sezernierte Protein BirA. </li><li> Ernte Kulturen fünf Tage nach der Transfektion durch erste Pelletierung der Zellen durch Zentrifugation bei 3000 × g für 20 Minuten durch Filtration des Überstands durch einen 0,22 uM Filter. </li></ol> [Tipp: Bait und Prey-Proteins sollte unverdünnt gelagert bei 4 ° C und als eine allgemeine Richtlinie sollten innerhalb eines Jahres verwendet werden können. Fügen Sie Bakteriostatika wie 50 pg / ml Polymyxin B Sulfat oder 10 mM NaN 3, eine bakterielle Kontamination der Überstände zu verhindern.] 3. Die Normalisierung des Bait und Prey Proben Eines der wichtigsten Merkmale des AVEXIS Test ist, dass, weil die rekombinanten Proteine ​​sezerniert werden sie verdünnt werden kann oder konzentriert (normalisiert), um innerhalb von festgelegten Schwellenwert Aktivitäten, bevor sie in den Test eingesetzt. Wir haben gefunden, dass die Ebenen, auf denen die rekombinanten Proteine ​​exprimiert werden eine breite Palette erstrecken - bis 4 Größenordnungen - und so die Normalisierung Schritt reduziert signifikant die Anzahl von Fehlalarmen in den Bildschirmen. 3,1 Bait Normalisierung Hinweis: Freies D-Biotin muss von den Medien (typischerweise durch Dialyse) entfernt werden, da es mit dem biotinylierten bai konkurriertt-Protein für die Bindung an Bindungsstellen Streptavidin. <ol><li> Übertragen Köder Überstände in Dialyseschlauch, Labels, sicher befestigen und Dialyse umfassend gegen einen geeigneten Puffer wie PBS zu freiem Biotin zu entfernen. </li></ol> [Tipp: Wir haben festgestellt, dass eine ausreichende Dialyse wird normalerweise für 6 x 50 ml Köder Überstände gegen ein Volumen von 4,5 l PBS mit 4 Veränderungen über einen Zeitraum von 24 Stunden erreicht. Unzureichende Dialyse kann durch eine Hemmung der Protein-Bindung bei niedrigen Verdünnungen bei der Köder Schritt der Normalisierung beobachtet werden (Abb. 3A). <ol start="2"><li> Führen eines ELISA, um die relativen Ebenen, auf denen die Proteine ​​exprimiert werden Köder zu bestimmen. Herstellung einer Verdünnungsreihe der biotinylierten Köderproteine ​​und fangen sie an einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte. Verwenden Sie die Ratte Cd4d3 4 tag zur Feststellung und Quantifizierung der aufgenommenen Köder-Proteine ​​mit einem monoklonalen Antikörper (OX68). Konzentrierter oder verdünnter Köderproteine ​​dem Mindestbetrag erforderlich ist, um alle zu sättigen Biotin Bindungsstellen in die Vertiefung einer Streptavidin-beschichteten Platte. </li><li> Block die Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten Platte mit Phosphat-gepufferter saline/0.1% Tween-20 (PBST) / 2% Rinderserumalbumin (BSA) für 15 Minuten. </li><li> In einer separaten Platte, um eine Verdünnungsreihe (vier 1.03 Verdünnungen sind normalerweise ausreichend) der Köderproteine ​​in PBST / 2% BSA und Übertragung in die Vertiefungen einer mit Streptavidin beschichteten Platte. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen in PBST 3x. Geben Sie 100 ul 2 ug / ml Maus-anti-Ratte IgG Cd4d3 4 (OX68) Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen in PBST 3x. Fügen Sie 100 ul Anti-Maus-alkalische Phosphatase bei 1:5.000-Verdünnung in PBST / 2% BSA und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen in PBST 3x und Erfüllung eines letzten Waschen in PBS, um das restliche Reinigungsmittel zu entfernen. Geben Sie 100 ul 1 mg / ml Substrat in Diethanolamin-Puffer (10% Diethanolamin (v / v), 0,5 mM MgCl 2, 10 mM NaN 3, pH9.8, gespeichert vor Licht geschützt bei 4 104° C). </li><li> Nach einer Stunde messen Absorption bei 405 nm. Repräsentative Köder Normalisierung Ergebnisse sind in 3A gezeigt. </li><li> Köder-Proteine, die auf einem Niveau, das ausreicht, um alle Biotin-Bindungsstellen eines Streptavidin-beschichteten Platte sättigen sind ausgedrückt werden, wenn unverdünnt verwendet, sollte konzentriert mit Vivaspin Konzentratoren (Vivascience, 10 kDa MWCO) werden. Als Richtwert schätzen wir, dass ~ 5 ug eines typischen Köderprotein (~ 80 kDa) ausreichen, um eine 96-Well-Platte zu sättigen ist. <ol><li> Köder-Proteine ​​in großen Mengen exprimiert in PBST / 2% BSA auf eine Konzentration ausreicht, um die Streptavidin-beschichtete Platte zu sättigen verdünnt werden. Die Aktivität der Köder sollte nach Verdünnung oder Konzentration nachgeprüft werden, um sicherzustellen, dass sie all die Biotin-Bindungsstellen in der Streptavidin-beschichteten Platte zu sättigen. </li></ol></li></ol> 3,2 Prey Normalisierung <ol><li> Quantifizierung der relativen Ebenen, auf denen die Beute-Proteine ​​exprimiert werden mit dem β-LactamaseEnzymaktivität. </li><li> Stellen Sie zunächst eine Verdünnungsreihe der Überstand, der die Beute Proteine ​​in PBST / 2% BSA-Puffer. Dann fügen Sie 20 ul der Verdünnung auf 60 ul einer 242 uM (0,125 mg / mL) Nitrocefin Lösung (Calbiochem). </li><li> Sofortige Umsetzen der Platte zu einem Mikrotiterplatten, die eine Absorptionsmessung bei 485 nm pro Minute für 20 Minuten bei Raumtemperatur erfolgt. Repräsentative Beute Normalisierung Ergebnisse sind in 3B gezeigt ist. </li><li> Konzentrat Proben unter Verwendung Zentrifugalkonzentratoren oder verdünnter sie in PBST / 2% BSA, einen Schwellenwert-Aktivität von ~ 2 nmol min -1 Umsatz von Nitrocefin erreichen. Praktisch wird dies erreicht, wenn alle Nitrocefin innerhalb von ~ 7 Minuten hydrolysiert wird. </li></ol> 4. AVEXIS Screening Procedure <ol><li> Waschen Sie eine Streptavidin-beschichtete Platte in PBST. </li><li> Geben Sie 100 ul PBST / 2% BSA in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 30 Minuten, um alle störenden Protein-Bindungsstellen innerhalb jeder gut zu blockieren. </li&gt; </ol> [Tipp: auf jeden Waschpufferrückstände nach Waschschritte entfernen, wird die Platte geklopft - kräftig - auf Küchenpapier] <ol start="3"><li> Blocking-Lösung mit einer Smart-Flick von der Platte über einem Waschbecken und 100 ul normalisierte biotinylierten monomeren Köder in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren und für 1 Stunde bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen Sie die Köder Proben aus der Platte durch Umdrehen der Platte und elegant flicking über ein Waschbecken, und 3 x waschen in PBST. </li><li> Geben Sie 100 ul der normierten pentamerized Beute in jede Vertiefung konstruieren und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 Stunde, waschen, wie in Schritt 4.4 und führen Sie eine letzte Waschung mit PBS nur. </li><li> In 60 ul 242 uM Nitrocefin-Lösung (5 mg auflösen Nitrocefin in 500 l DMSO, gut durchmischen und dann weiter verdünnen Nitrocefin in 40 ml PBS und durch ein 0,22 um Filter zu passieren, bevor Sie zu den Platten) und bei Raumtemperatur inkubieren . Positive Interaktionen beobachtet werden kannmit dem Auge, da die gelbe Nitrocefin wird zu einer roten Farbe hydrolysiert. Quantifizierung durch Messung der Absorption bei 485 nm mit einem Platten-Lesegerät. Eine typische Platte und Quantifizierung ist in Abb. 4. </li></ol> [Tipp: Positive Interaktionen sind in der Regel innerhalb von 2 Stunden bei Raumtemperatur beobachtet, obwohl Platten sollte bei 4 ° C für 16 Stunden angeordnet werden, um sicherzustellen, dass alle potenziellen Wechselwirkungen erkannt werden. Wir haben auch festgestellt, dass gefällte Nitrocefin und Unvollkommenheiten auf dem Kunststoff der Mikrotiterplatte wie Kratzer / Fingerabdrücke können gelegentlich zu artifizielle Fehlalarme bei 485 nm führen trotz keiner offensichtlichen Nitrocefin Hydrolyse. Es ist daher ratsam, Fotos von den Platten zu ergreifen, um visuell aufzuzeichnen Nitrocefin Umsatzes in die Vertiefungen geben.] 5. Repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel eines repräsentativen AVEXIS Abschirmblech ist in 4 gezeigt. Man sollte Hydrolyse (gelb bis rot) des Nitrocefin Substrat in das beobachtenpositiven Kontrollvertiefungen (sowohl der Antikörper-vermittelten Kontrolle Beutefang und auch positive Kontrolle Interaktion) innerhalb von etwa zehn Minuten. Einige Wechselwirkungen innerhalb des Bildschirms werden darüber hinaus in dieser Zeitskala beobachtet, aber andere können länger dauern (einige Stunden) zu erscheinen. Typischerweise ist eine Hit-Rate von rund 0,4 bis 0,6% (eine positive Wechselwirkung für jeweils 150-250 Interaktionen durchleuchtenden) typisch, abhängig von den Protein-Bibliotheken werden gezeigt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig1.jpg" /> Abbildung 1. Identifizierung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen vermitteln zelluläre Prozesse mit Hilfe AVEXIS Anerkennung. Das Schema zeigt zwei interagierenden Zellen (A und B) Austausch von Informationen durch Wechselwirkungen zwischen Membran-Embedded-Rezeptor-Proteine ​​hergestellt. AVEXIS ist eine skalierbare Protein-Interaktions-Test speziell für die neuen Rezeptor-Ligand-Paaren, die durch sehr schwache Wechselwirkung Stärken auszeichnen zu identifizieren. Rekombinante soUnlöslich Protein-Bibliotheken, die die gesamte Ektodomäne des Zelloberflächenrezeptor Repertoire der beiden Zellen werden entweder als pentamere β-Lactamase-markierte Beute kompiliert (Zelle A) oder Biotin-markierten monomeren Köder (für die Zelle B). Die pentamerisation der Beute erhöht die lokale Konzentration der Ektodomänen zu einem Gesamtbild Avidität Verstärkung zu bewirken, so dass sogar sehr kurzlebige Wechselwirkungen detektiert werden kann. Der Köder Bibliothek wird auf Streptavidin-beschichteten Platten angeordnet sind und systematisch sondiert auf Wechselwirkungen mit den Beuteproteine. Nach einer kurzen Waschung, werden alle erfassten Beute unter Verwendung der β-Lactamase-Aktivität mit der Beute zugeordnet. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bait-und Prey-Konstruktes Design. (A) Die Ratte CD200-Rezeptor-Protein wird als ein Beispiel dafür, wie die gesamte Ektodomänen von Zelloberflächen-Rezeptorproteinen bestimmt und Primer werden entworfen, um sowohl Köder zu bereitgestelltund Beute Expressionskonstrukte. Die cDNA und translatierten Proteinsequenz aus der N-terminalen Signalpeptid der Membran-überspannenden Transmembranregion von Ratten-CD200 gezeigt. Ein Sense-Primer wurde entwickelt, um eine 5&#39;-NotI-Restriktionsenzym-Stelle und eine optimale Kozak-Sequenz von 25 Basen der Sequenz genaue Übereinstimmung der CD200-cDNA-Sequenz umfassen, gefolgt. Die Antisense-Primer enthält eine AscI Ort und 25 Basen genaue Übereinstimmung Sequenz unmittelbar stromaufwärts des ausgewählten Ektodomäne Abschneiden Rückstand. Um die Ektodomäne in Rahmen mit der Ratte Cd4d3 4 Tag halten, sollte die AscI Standort wie Gly-Ala-Pro übersetzen. (B) schematische Darstellungen der Köder und Beute Expressionskonstrukte. Jeder Rezeptor enthält Ektodomänen durch NotI und AscI Standorten und einem 4-Tag Cd4d3 flankiert. Die Köder enthalten eine C-terminale Peptid-Sequenz, die spezifisch durch Co-Transfektion kann mit einem Plasmid die Expression eines sezernierten BirA Enzym monobiotinylierte. Die Beute von der Sequenz folgt pentamerisationaus dem Knorpel oligomere Matrix-Protein (COMP) und der β-Lactamase-Enzym. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Normalisierung der Köder und Beute-Proteine. (A) Repräsentative Beispiele für Köder Normalisierung. Eine Verdünnungsreihe von vier verschiedenen dialysiert Köder Überstände wurden durch ELISA unter Verwendung eines Anti-CD4-Tag monoklonaler Antikörper ist. Die vier Köder werden auf verschiedenen Ebenen 1&gt; 2&gt; 3&gt; 4 ausgedrückt. Köder sollte auf einen Schwellenwert, der die Biotin-Bindungsstellen in jeder Vertiefung sättigt normalisiert werden. Absolut ausgedrückt-Köder können verdünnt werden, um Protein zu erhalten (zB Köder 1 könnte ~ 1:100 verdünnt werden), und schlecht exprimiert Köder eingeengt. Verminderte Werte bei niedrigen Verdünnungen werden manchmal in einigen Köder (zB Köder 2), die auf das Vorhandensein von nicht-konjugiertem D-Biotin durch unvollständige Dialyse beobachtet. (B) Die Ebenen, auf denen Proteine ​​Beute sind exgedrückt wird quantifiziert mit der Hydrolysegeschwindigkeit von einem β-Lactamase-Substrat, Nitrocefin. In dem gezeigten Beispiel sind die drei Beute auf verschiedenen Ebenen ausgedrückt: Beute 1&gt; 2&gt; 3. Preys sollte auf eine Aktivität von ca. 2 nmol min -1, die Hydrolyse von 14,5 nmol Nitrocefin in ~ 7 Minuten zu vollenden (zB Beute 1) entspricht normalisiert werden. Die andere Beutetiere in diesem Beispiel sollten vor der Verwendung in Screening konzentriert werden. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3881/3881fig4.jpg" /> Abbildung 4. Vertreter AVEXIS Screening-Ergebnisse. (A) Ein Foto von einem Vertreter AVEXIS Abschirmblech. Ein Beute-Protein wird gegen 41 verschiedene Köder sondiert und eine positive Wechselwirkung ist in gut E2 erkannt. Kontrollen in den Screening-Platten verwendet werden, umfassen: ein biotinylierter Anti-CD4-Antikörper, alle Prey-Protein zu erfassen zugegeben, um das Bohrloch (G6), eine Steuereinheit Wechselwirkung: Ratten CD200 (Köder)-CD200R (Beute) mit dem CD200R der Schwelle Verdünnung Beute verwendet (H3), 1.10 (H4) und 1:100 (H5). Negative Kontrollen waren: a Cd4d3 4 Köder sondiert mit der Prey-Protein das gesiebt (H1) und der CD200R Beute (H2). (B) Quantifizierung der Extinktionswerte des gleichen Bildschirms in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Datenpunkte sind der Durchschnittswert ± SD.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bei lebenden Zellen in vivo beobachtet werden, zeigen ihre Plasmamembranen hochdynamische Verhalten: Ein-und Ausfahren Membranverfahren, wie sie und wenden sich mit ihren Nachbarn 2. Die physikalische Wechselwirkungen zwischen der Membran eingelagerten Rezeptorproteine, die viele dieser Kontakte zu vermitteln haben sich als äußerst schwach, so dass diese sehr beweglichen Verhalten zu ermöglichen. Es wurde geschätzt, dass monomere Stärke der Wechselwirkung so schwach wie 50 uM könnte ausreichend sein, um spontane Interaktionen bei physiologischen Rezeptor Dichten 9, die Erkennung neuartiger Interaktionen extrem herausfordernd 2,10 macht zu fahren. Die AVEXIS hier beschriebene Methode stellt eine empfindliche Methode zum Nachweis von transienten extrazellulären Protein-Protein-Interaktionen, die in eine skalierbare Art und Weise mit einer niedrigen Rate an falsch positiven umgesetzt werden können. Während andere skalierbare Verfahren wurden entwickelt, um auf extrazelluläre Wechselwirkungen 11-15,Ein Vorteil der AVEXIS ist, dass die experimentellen Parameter wie die Köder und Beute Aktivitäten wurden quantifiziert, um selbst die schwächste von Interaktionen (t 1/2 ≤ 0,1 s) unter Beibehaltung eines niedrige False-Positive-Rate 3. Darüber hinaus haben sich die schlanke und robuste Verfahren zur Probenaufbereitung, diesen Test aktivieren, damit Sie auf einem viel größeren Maßstab als andere Assays durchgeführt werden, und wir haben vor kurzem eine systematische Interaktion Bildschirm im Gesamtwert von über 16.500 potentielle Wechselwirkungen ~ 16 beschrieben. Der Assay kann auf jedem Protein, für das es möglich ist, ein lösliches rekombinantes Protein-Fragment exprimieren durchgeführt werden. Umfasst werden also Proteine, die eine N-terminale Signalpeptid wie Typ I, GPI-linked und sekretierte Proteine ​​enthalten. Wir haben kürzlich eine Reihe von Vektoren, die uns nun ermöglichen, Typ-II-Proteine ​​als Köder 17 Express konzipiert. Der Test ist im Allgemeinen nicht geeignet für Multipass Membranproteine ​​wie Ionen-Transporters oder Pumpen, da sie wahrscheinlich nicht vollständig außerhalb des Kontextes eines Plasmamembran gefaltet werden. Wir führen dies auf eine Vielzahl von unterschiedlichen Systemen angewandt und haben erfolgreich exprimiert extrazelluläre Proteine ​​aus Zebrafisch 3,16,18, von Mensch, Maus und S. falciparum für die Interaktion Bildschirme. Im Hinblick auf die erforderlichen Ressourcen zur Einrichtung eines AVEXIS Bildschirm haben wir festgestellt, dass ein erheblicher Engpass die Auswahl, den Bau und die vollständige Sequenzierung der Expressionsplasmide ist. Dieser Aspekt des Verfahrens kann bis zu einem Jahr auf ~ 100 Bait und Prey-Konstrukte machen, jedoch mit der sinkenden Kosten für Gensynthese haben wir jetzt im Handel begünstigen Auslagerung dieser Aspekt des Projekts. Die Säuger-Expression System zusammen mit einer großen Schütteln Gewebekultur-Inkubator (wir verwenden eine INFORS HT Multitron Cell) ermöglicht einem einzelnen Forscher zu äußern und zu normalisieren bis ~ 100 Köder und Beute-Proteine ​​im Monat. Sobald die Proteine ​​produziert werden und normiert, screening für Wechselwirkungen ist schnell mit bis zu zwölf 96-well Platten in bequemer pro Tag verarbeitet. Die einzige maßgeschneiderte Ausrüstung, die wir entwickelt haben, um die Herstellung einer solchen großen Anzahl von Proteinen erleichtern, ist eine Druckluft-Kolbenmotor, die verwendet werden, um bis zu fünf übergeben Überstände durch einen 0,22 &amp;mgr; m Filter parallel ist. Die Hauptklasse der Interaktionen, die vielleicht entgehen würden, wenn die Wechselwirkungen aus der Literatur (falsch negativ) erwartet im Vergleich sind homophile Interaktionen, obwohl einige dieser Interaktionen 3 nachgewiesen werden kann. In den Fällen, in denen zu erwartenden Wechselwirkungen nicht erkannt werden, glauben wir, dass dies auf die Bildung von homophile Interaktionen von den Beute-Proteine ​​(a Beute &quot;Maskierung&quot;-Effekt), die dann verhindert die weitere Interaktionen mit Proteinen immobilisiert Köder ist. Die Frequenz, bei der Interaktionen erfasst hängt von dem Gehalt der Protein-Bibliothek gescreent werden. Als Leitfaden für den Leser, ein Bildschirm von&gt; 30, 000 Wechselwirkungen innerhalb der Zebrafisch-Immunglobulin-Superfamilie resultierte in 188 Positives - eine Frequenz von 0,6% 3,16,18. Eine sehr schnelle Überprüfung vorgenommen, um die positive gespielt werden kann, ist zu überprüfen, um festzustellen, ob die Interaktion in beiden Köder-Beute-Orientierungen erfasst werden kann, dh, kann der gleiche Effekt unabhängig davon, ob die bindenden Proteine ​​vorhanden sind detektiert werden entweder als ein Köder oder eine Beute. Wenn wir diese Hin und Herbewegung Verhalten beobachtet, hat die Bindung erfolgt wurde gezeigt, dass durch den Nachweis spezifischer direkten gesättigte Bindung der gereinigten Proteine ​​mit Oberflächenplasmonresonanz. Es sollte betont werden, dass, weil wir Bindungsavidität erhöhen künstlich die pentamerising Beuteproteine, wir sind nicht der Ansicht des Tests für den Vergleich quantitativ Interaktion Stärken werden. Um biophysikalischen Bindungsparameter der Interaktionen verwenden wir monomeren Proteinen und Oberflächen-Plasmon-Resonanz erhalten. Schließlich, wenn eine Wechselwirkung identifiziert worden ist, die hallogh Durchsatz Art des Assays ist es relativ einfach, den Test zum Screening auf Reagenzien wie Antikörper oder kleine Moleküle, die die Interaktion blockiert anzupassen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Cat. Anzahl </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Freestyle Medien </td><td> Invitrogen </td><td> 12338018 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocefin </td><td> Calbiochem </td><td> 484400 </td><td></td></tr><tr><td> SA-beschichteten Mikrotiterplatten </td><td> Nunc </td><td> 734-1284 </td><td></td></tr><tr><td> OX68 Antikörper </td><td> AbDSerotec </td><td> MCA1022R </td><td></td></tr><tr><td> Dialyseschlauch </td><td> Durchstechen </td><td> PN68100 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxin B </td><td> Sigma </td><td> P4932 </td><td></td></tr><tr><td> D-Biotin </td><td> Sigma </td><td> B4639-5G </td><td></td></tr><tr><td> Substrat-104 </td><td> Sigma </td><td> 1040-506 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin-20 Zentrifugalkonzentratoren </td><td> Sartorius </td><td> VS2002 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 um Filter </td><td> Nalgene </td><td> 190-2520 </td><td></td></tr></tbody></table>

avidity-based extracellular interaction screening (avexis) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions

Extrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen sezernierten oder Membran-gebundene Proteine ​​sind entscheidend für die Einleitung sowohl Kommunikation und die Kohäsion in vielzelligen Organismen. Vorhergesagten Proteine ​​zu bilden extrazelluläre Interaktionen um rund ein Viertel der menschlichen Gene 1 kodiert sind, aber trotz ihrer Bedeutung und Fülle, die Mehrzahl dieser Proteine ​​haben keine Bindungspartner dokumentiert. In erster Linie ist dies auf Grund ihrer biochemischen Widerspenstigkeit: Membran-Proteine ​​eingebettet sind schwer in nativer Konformation solubilisieren und enthalten strukturell wichtige posttranslationale Modifikationen. Auch sind die Interaktion Affinitäten zwischen Rezeptor-Proteine ​​oft durch äußerst geringe Stärke der Wechselwirkung (Halbwertszeiten &lt;1 Sekunde) entgegensteht, ihr Nachweis mit vielen häufig verwendeten Hochdurchsatzmethoden 2 gekennzeichnet. Hier beschreiben wir einen Test, AVEXIS (Gier-basierte extrazellulärenlar Interaction Screen), die diese technischen Herausforderungen ermöglicht die Detektion von sehr schwachen Protein-Wechselwirkungen (t 1/2 ≤ 0,1 sec) mit einer niedrigen Rate an falsch positiven 3 umgeht. Der Assay wird in der Regel in einem Format mit hohem Durchsatz durchgeführt, um die systematische Screening von vielen Tausenden von Wechselwirkungen in einem geeigneten Mikrotiterplatten-Format (1) zu ermöglichen. Es stützt sich auf die Produktion von löslichem rekombinanten Protein-Bibliotheken, die die Ektodomäne Fragmente von Zelloberflächenrezeptoren oder sekretierte Proteine ​​in dem für Wechselwirkungen zu screenen, um enthalten, daher ist dieser Ansatz für Typ I, Typ II, GPI-gebundene Rezeptoren auf der Zelloberfläche und sezernierte Proteine, nicht aber für Multipass-Membranproteine ​​wie Ionenkanäle oder transporter. Die rekombinanten Protein-Bibliotheken werden unter Verwendung eines bequemen und High-Level-Säuger-Expressionssystem 4, an, dass wichtige posttranslationale Modifikationen wie Glycosylierung gewährleistention und Disulfidbindungen hinzugefügt werden. Ein biotinylierter Köder, an einer mit Streptavidin beschichtete feste Phase für das Screening geeignet erfasst werden kann, und einer enzymmarkierten pentamerisierten (β-Lactamase) Beute: exprimierten rekombinanten Proteine ​​in das Medium und produziert in zwei Formen sezerniert. Die Bait und Prey-Proteine ​​sind miteinander in einer binären Weise direkten Wechselwirkungen zwischen ihnen, ähnlich einem herkömmlichen ELISA (Abb. 1) zu erfassen dargestellt. Die pentamerisation der Proteine ​​in der Beute durch eine Peptidsequenz aus dem Knorpel oligomere Matrix-Protein (COMP) erreicht und erhöht die lokale Konzentration der Ektodomänen damit eine signifikante Avidität Gewinne zu ermöglichen, auch sehr kurzlebige Wechselwirkungen zu detektieren. Durch die Normierung der Aktivitäten sowohl der Köder und Beute zu vorgegebenen Niveaus vor dem Screening, haben wir gezeigt, dass Wechselwirkungen mit monomeren Halbwertszeiten von 0,1 s mit niedrige False-Positive Raten 3 erkannt werden können.

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Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS ist ein Hochdurchsatz-Protein-Interaktion Assay entwickelt, um systematisch Bildschirm für neue extrazelluläre Rezeptor-Ligand-Paare in der Zellerkennung Prozessen beteiligt sind. Es ist speziell entwickelt, um transienten Protein-Interaktionen, die schwer zu identifizieren, die mit anderen hohen Durchsatz Ansätze sind zu erkennen.

Avidität-basierte extrazelluläre Wechselwirkung Screening (AVEXIS) für die Erkennung von Scalable Low-Affinität extrazellulären Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

21.4K Aufrufe.  Wellcome Trust Sanger Institute. AVEXIS ist ein Hochdurchsatz-Protein-Interaktion Assay entwickelt, um systematisch Bildschirm für neue extrazelluläre Rezeptor-Ligand-Paare in der Zellerkennung Prozessen beteiligt sind. Es ist speziell entwickelt, um transienten Protein-Interaktionen, die schwer zu identifizieren, die mit anderen hohen Durchsatz Ansätze sind zu erkennen.

Serie: Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Forschung

Biologie

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Rasterelektronenmikroskopie von Mazerierte Gewebe zu visualisieren die extrazelluläre Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Eine schnelle, skalierbare Methode für die Isolierung, Funktionelle Untersuchung und Analyse von Zellen abgeleiteten Extrazellulärmatrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A BW Reporter System for Studying Receptor-Ligand Interactions

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native receptor and the ligand are challenging since the ligand of a specific receptor may be unknown and experimental procedures with the native ligand can be technically complicated. To address these obstacles, we describe a reporter system to detect the binding and activation of a specific receptor by a ligand of interest. In this reporter system, the extracellular domain of a specific receptor is conjugated to mouse CD3&#950; and this chimeric protein is then expressed in mouse BW cells. These transfected BW cells can then be incubated with different targets (e.g., cells or antibodies). Activation of a transfected receptor leads to the secretion of mouse interleukin-2 (mIL-2) which can be detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This reporter system has the advantages of being sensitive and specific to a single receptor. In addition, the activation level of a specific receptor can easily be quantified and can be used even in cases where the ligand of the receptor is unknown. This system has been implemented successfully in many of our studies to characterize receptor-ligand interactions. We have recently employed this system to study the activation of human Fc&#947; receptors (Fc&#947;Rs) by different monoclonal anti-CD20 antibodies in clinical use.

This protocol describes how to establish a reporter system that can be used to identify and quantify receptor-ligand interactions.

Ein BW-Reporter-System für das Studium-Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Interactions between receptors and ligands constitute a fundamental biological process. However, direct experiments with cells that express the native ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving area of research. There are many different methods for EV isolation, each with distinct advantages and disadvantages that affect the downstream yield and purity of EVs. Thus, characterizing the EV prep isolated from a given source by a chosen method is important for interpretation of downstream results and comparison of results across laboratories. Various methods exist for determining the size and quantity of EVs, which can be altered by disease states or in response to external conditions. Nanoparticle tracking analysis (NTA) is one of the prominent technologies used for high-throughput analysis of individual EVs. Here, we present a detailed protocol for quantification and size determination of EVs isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma using a breakthrough technology for NTA representing major advances in the field. The results demonstrate that this method can deliver reproducible and valid total particle concentration and size distribution data for EVs isolated from different sources using different methods, as confirmed by transmission electron microscopy. The adaptation of this instrument for NTA will address the need for standardization in NTA methods to increase rigor and reproducibility in EV research.

We demonstrate how to use a novel nanoparticle tracking analysis instrument to estimate the size distribution and total particle concentration of extracellular vesicles isolated from mouse perigonadal adipose tissue and human plasma.

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular communication in various research fields; cancer biology, neuroscience, and drug delivery. Many EV uptake assays have been reported in the literature; however, there is a lack of practical, detailed experimental methodology. EV uptake can be assessed by fluorescently labeling EVs to detect their location within cells. Distinguishing between internalized EVs in cells and the superficial EVs on cells is difficult, yet critical, to accurately determine the EV uptake. Therefore, an assay that efficiently quantifies EV uptake through three-dimensional (3D) fluorescence confocal microscopy is proposed in this work. Fluorescently labeled EVs were prepared using a nano-filtration-based microfluidic device, visualized by 3D confocal microscopy, and then analyzed through advanced image-processing software. The protocol provides a robust methodology for analyzing EVs on a cellular level and a practical approach for efficient analysis.

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular vesicles (EVs) contribute to cellular biology and intercellular communications. There is a need for practical assays to visualize and quantify EVs uptake by the cells. The current protocol proposes the EV uptake assay by utilizing three-dimensional fluorescence imaging via confocal microscopy, following EV isolation by a nano-filtration-based microfluidic device.

Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokaler Mikroskop-Bildgebungsanalyse

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...