This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. Ionenselektive selbst verweisende Mikroelektroden-Vorbereitung <ol><li> Herstellung von ionenselektiven Mikro <ol><li> Wärme dünnwandigen Borosilikatglas Kapillaren zu ziehen, ohne Filament (1,5 mm Außendurchmesser, 1,12 mm Innendurchmesser) mit einem Mikroelektroden-Abzieher. Hinweis: Diese gibt Tipps 3-4 &amp; mgr; m im Durchmesser. Kleinere Spitzen haben höhere Widerstand, der Mikroelektroden anfälliger für elektronisches Rauschen macht und ist auch mit einer langsameren Reaktion auf eine Änderung in der Ionenkonzentration verbunden. Nützliche Informationen finden Sie in dem von Smith et al. 26 veröffentlichte Papier gefunden werden. </li><li> Silanisiert werden die Elektroden, die Innenfläche hydrophobe Retention des lipophilen lonophor Cocktail Hilfe zu leisten. Platzieren der Mikroelektroden in einem Metallgestell und Wärme O / N in einem Ofen bei&gt; 100 ° C zu trocknen. Die Zahnstange ist eine Metallplatte mit 2 mm Durchmesser Bohrungen einen Teil des Weges durch. Platzieren Sie die Elektroden in die Löcher Spitze nach oben mit einem 250 ml glass Becher über sie. </li><li> Am Morgen, schalten Sie den Backofen ausschalten und während isolierte Handschuhe tragen, entfernen Sie vorsichtig die Metallgestell mit den Elektroden und Becher in Position. Schließen Sie die Ofentür, um die Wärme zu halten. </li><li> Anlegen von Latex oder Nitril Handschuhe, Kittel und Schutzbrille. Mit einem Kunststoff-Pasteurpipette einen Tropfen Silanisierung Lösung, die ich an der Basis jeder Elektrode (halten den Becher in Ort, verwenden Sie den Ausguss für Pipettenzugang). Die Silanisierung Lösung durch die Heizplatte verdampft und silanizes die Innenseite der Elektroden. Verwenden Sie einen chemischen Dunstabzugshaube für diese Stufe. Platzieren Sie die Zahnstange / Becher / Elektroden wieder in den heißen Ofen für ein paar Stunden, damit der verbleibende Silanisierung Lösung zu verdampfen. Hinweis: Aus Sicherheitsgründen nicht drehen Sie den Ofen wieder ein. Legen Sie ein Etikett auf dem Ofen anzeigt, muss nicht eingeschaltet werden, da es schädlich und entzündbare Dämpfe enthalten. </li><li> Nach dem Abkühlen, speichern Sie die Mikroelektroden in einem Mikroelektroden-Vorratsglas inside ein Glas Exsikkator mit 400 g Trockenmittel. Mikroelektroden kann somit für viele Wochen gelagert werden. Hinweis: Eine alternative Methode der Silanisierung ist in Smith et al 26. </li><li> Zutückgeben die Mikroelektrode mit 50 bis 100 ul (eine Länge von etwa 1 cm) einer Lösung, die 100 mM des Ions gemessen werden (siehe Tabelle 1 und 1B). Verwenden Sie eine Einweg-Kunststoff-Pasteurpipette Wärme in einem Bunsenbrenner zog zu einem feinen Faden. Spülen Sie die Pipette in dH 2 O danach zur Verstopfung zu verhindern. Hinweis: Alternativ Einstellen der Ionenkonzentration der Verfüllung Lösung, die Konzentration der Ionen in der externen Lösung 27 entsprechen. </li><li> Beachten Sie die Mikroelektrode unter einem Binokular, um die Abwesenheit von Luftblasen sicherzustellen. <ol><li> Wenn Luftblasen vorhanden sind, tippen Sie auf die Mikroelektrode leicht mit einem Fingernagel, während die Elektrode senkrecht halten (Spitze nach unten) und / oder drücken Sie die Blases die Spitze, indem Gegendruck unter Verwendung einer Spritze mit einem Silikonschlauch Auswechseln der Nadel geändert. </li></ol></li><li> Tip-füllen die Mikroelektrode mit 15 bis 20 nl (eine Länge von 30-50 um) der ionenspezifischen Ionophor-Cocktail (siehe Tabelle 1). Setzen Sie einen kleinen Tropfen der Ionophor-Cocktail an der kurzen Seite eines Objektträgers. Beachten Sie die Mikroelektrodenspitze unter einem Binokular und verschieben Sie sie in Richtung der Objektträger, bis der Mikroelektrodenspitze das Ionophor Cocktail berührt nur etwa eine halbe Sekunde. Zeichnen Sie das Ionophor Cocktail in der Mikroelektrode durch Kapillardruck. Hinweis: Vermeiden Sie eine lange Kolonne von Ionophor Cocktail, da dies erhöht die elektrische Widerstand der Sonde die sie anfällig für elektronische Störungen (Rauschen) machen können und verlangsamt auch die Reaktionszeit. </li><li> Montieren Sie die Mikroelektrode in einer geraden Mikroelektrodenhalter mit einem gold 1 mm Stecker und AgCl (Ag +) Draht (1B). &lt;/ Li&gt; <li> Bringen Sie den Mikroelektrodenhalter auf den Kopf der Bühne auf einem dreidimensionalen computergesteuerten elektronischen Mikropositionierer (Abbildung 1A) montiert. </li><li> Setzen Sie den Mikroelektrodenspitze in Messlösung angemessen, dass die zu messende Probe (physiologische Kochsalzlösung, Kulturmedium, etc.), damit der Mikroelektroden, für eine oder zwei, oder sogar über Nacht hr stabilisieren. </li></ol></li><li> Herstellung der Referenzelektrode <ol><li> Referenzelektroden (1C) sind die gleichen wie oben Kapillaren. Schneiden Sie die Kapillare mit einem Diamantstift in 5 cm Länge und an jedem Ende für 1-2 sec in einer Bunsenflamme feuerpoliert. </li><li> Füllen dieser Elektroden mit ~ 200 &amp; mgr; l einer 3 M Lösung von NaCl, CH 3 CO 2 K (Kaliumacetat) oder KCl mit 2% Agarose ist. Wählen Sie die Lösung in Abhängigkeit von der zu messenden Ions (der Bezugselektrode nicht den Ionen gemessen enthalten, siehe Tabelle 1). Mischendie Agarose und die Lösung und Wärme fast Kochen in der Mikrowelle. Rühren Sie die Agarose aufzulösen (die Lösung geht klar). </li><li> Befestigen Sie die Referenzelektrode auf einem Kunststoffpasteurpipette und zeichnen Sie die heiße Lösung in die Kapillare. </li><li> Löschen Sie die Elektrode in kaltem 3 M NaCl, CH 3 CO 2 K oder KCl-Lösung und speichern Sie in diesem 3-M-Lösung in verschlossenen Röhrchen vor der Verwendung. Entsorgen Sie alle Referenzelektroden mit Luftblasen. </li><li> Montieren Sie die Referenzelektrode in einer geraden Mikroelektrodenhalter (vorgefüllt mit 3 M Lösung) mit einem AgCl (Ag +) Pellet im Inneren und eine Gold 2 mm-Stecker (1C) und befestigen Sie die Elektrode und den Halter an einer manuellen Mikrostellungs auf einem Magnetständer montiert. </li></ol></li></ol> 2. Ionenselektive selbst verweisende Mikroelektroden-Kalibrierung <ol><li> Vorbereiten der Kalibrierung Lösungen, die die Ionen von Interesse als in der Referenzlösung; siehe Tabelle 1 </strong&gt;. Halterung Die Konzentration, die in der Lösung wird die Probe in (zB Kulturmedien, physiologische Kochsalzlösung) ist. Das heißt, eine Kalibrierungslösung muß eine niedrigere Ionenkonzentration als in der Messlösung enthalten, und eine höher. <ol><li> Verwenden Sie beispielsweise Kochsalzlösung, die 1 mM K + enthält. Um diese Konzentration einklammern auflösen KCl-Pulver in entionisiertem Wasser auf eine Konzentration von 10, 1 und 0,1 mM in seriellen Verdünnungen. Verwenden Sie diese Kalibrierungslösungen. Alternativ können mindestens zwei dieser Lösungen. </li></ol></li><li> Tauchen Sie die ionenselektiven Mikroelektroden und der Referenzelektrode in die Eichlösungen und lassen Sie den Spannungswert für 1 bis 3 Minuten stabilisieren, bevor die Aufzeichnung der entsprechenden Spannung mit Hilfe der speziellen Software (siehe Tabelle 1). </li><li> Da die Software speichert die Daten (Verstärkerausgang) als txt-Datei, kopieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsdatei. Zur Erstellung der Mikroelektrodenausgang (mV) gegen den Logarithmusdas molare Ionenkonzentration (2A). </li><li> Tragen Sie eine lineare Regression und berechnen die Nernst-Steilheit, abfangen und R 2 Wert. Übernehmen Sie die Mikroelektrode, wenn die Nernst-Steilheit ist 58 ± 11 mV / Dekade für einwertige Ionen und 29 ± 11 mV / Dekade für zweiwertige Ionen (Kationen ist die Nernst-Steilheit positiv, für Anionen ist negativ). Darüber hinaus sollten gute Mikroelektroden haben eine starke lineare Korrelation (R 2&gt; 0,9; 2B). Hinweis: Das mV Ausgang des Verstärkers verwendet hier gibt mV Lesung mit einem zehnfachen Gewinn. Werte um einen Faktor zehn geteilt werden. </li><li> Verwenden Sie die lineare Regression Formel, um die rohen mV-Ausgang der Mikroelektrode in tatsächliche Ionenkonzentration (2B) zu konvertieren. </li></ol> 3. Die Validierung der ionenselektiven Mikroelektroden-Technik <ol><li> Herstellung eines künstlichen Quelle <ol><li> Künstlichen Quelle Kapillaren sind die gleichen wie Kapillarenüber. Hitze ziehen die Kapillare mit einer Mikroelektrode Puller, wie in Schritt 1.1.1. </li><li> Verfüllen diese Kapillaren mit 200 ul einer 1 M Lösung von NaCl, KCl, CaCl 2 2 H 2 O oder pH 4 Puffer. Wählen Sie das künstliche Source-Lösung in Abhängigkeit von der zu messenden Ionen (siehe Tabelle 1). Hinweis: Alternativ können Elektroden mit größeren Spitzendurchmesser (~ 20 &amp; mgr; m) und ziehen Spitze seitig mit den gleichen Lösungen, sondern enthält 0,5-1% Agarose (Agarose wird jeden Großlösungsstrom zu verhindern). </li><li> Montieren Sie den künstlichen Quelle Kapillare auf einem Mikromanipulator und tauchen sie in die verwendet werden, um den Fluss der Ionen in den Proben zu messen Lösung. Verlassen die künstliche Lichtquelle in der Lösung für 30 min bis 1 h, um eine Stabilisierung des Gradienten zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Validierung der ionenselektiven Mikro <ol><li> Eintauchen der ionenselektive Mikroelektroden etwa einen Zentimeter entfernt von der künstlichen Quelle Kapillare in der Lösung verwendet, diese Maßere der Fluss von Ionen an den Proben und schließen Sie die Schaltung mit der Bezugselektrode wie zuvor. Ließ sich der Spannungswert für 1-3 min stabilisieren, bevor die Aufzeichnung der entsprechenden Spannung über das dedizierte Software für 1 bis 2 min. Dieser Wert entspricht der Pufferwert (in der Literatur auch als Referenz, Hintergrund oder Blindwert bezeichnet). </li><li> Bewegen Sie den ionenselektiven Mikroelektroden bis etwa 5 um von der künstlichen Quelle und lassen Sie den Spannungswert für 1 bis 3 Minuten stabilisieren, bevor die Aufzeichnung der entsprechenden Spannung mit Hilfe der Software für 1 bis 2 min. </li><li> Das obige Verfahren wird durch Anordnen des ionenselektive Mikroelektroden 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 und 1280 &amp; mgr; m entfernt von der künstlichen Quelle Kapillare. </li><li> Extrahieren Sie die Daten als txt-Datei und kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei. </li></ol></li><li> Berechnung der Ionenkonzentration entsprechend den mV Werte in der gleichen Weise wie für die Kalibrierungswerte. Zeichnen Sie den Wert. Neinte: Wird ein Ionenfluss vorhanden ist, erkennt der Mikroelektrode einen Unterschied in der Ionenkonzentration zwischen den zwei Positionen (3B). Wenn die künstlichen Quelle enthält mehr Ionen der gemessen wird, als die Lösung Arten sollte die Konzentration höher ist nahe an der Quelle als weit entfernt sein, die Validierung der Fähigkeit des ionenselektive Mikroelektroden, die Richtung eines Ionenflusses korrekt zu erfassen (in diesem Fall Auslauf; für eine künstliche Waschbecken, mit geringeren spezifischen Ionenkonzentration als Messmedium, sollte Zustrom sein). <ol><li> Berechnen Sie den Ionenfluss mit Fickschen Diffusionsgesetz: J = c μ (dc / dx) wobei c die Ionenkonzentration in der Lösung (mol cm -3), μ ist die Ionenmobilität (mol cm N -1 s -1) und dc die Konzentrationsdifferenz über den Abstand dx (cm) (2C). Ionenfluss-Daten werden in der Regel in pmol cm -2 s vorgestellt-1 Oder nmol cm -2 s -1. Anmerkung:.. Eine alternative Methode der von Smith et al 26 beschriebene Ionenstromberechnung verwendet werden. Hauptunterschiede sind die Verwendung des Diffusionskoeffizienten anstelle der Ionenmobilität und die Subtraktion der Hintergrundionenflusses (auch Spannungsdrift oder Korrekturfaktor) aus der Messung des Ionenflusses in Kochsalzlösung ohne Probe berechnet. </li><li> Plotten der Mittelwert der Ionenflüsse jeder Stufe gegenüber dem Abstand von der Quelle (2D). Weg von der Quelle zu beobachten eine exponentielle Abnahme der Flusswert Validierung der Fähigkeit des ionenselektive Mikroelektroden auf unterschiedliche Größe der Ionenflüsse zu erfassen. </li><li> Haben die künstlichen Quelle Validierungs einmal für jeden spezifischen Ions soll, um die korrekte Richtung und Größe Messungen mit einem großen Signal-zu-n validieren aufzuzeichnendenoise-Verhältnis. Hinweis: Ion Flussmessung des Puffers ohne Proben gibt die Hintergrundebene oder Lärm. Typischerweise Puffer Messung keine deutlichen Schwankungen der Ionenkonzentration, die zu sehr kleinen Fluß, der unterschiedlichen Richtungen zeigt. </li></ol></li></ol> 4. Vorbereitung der Messkammer Hinweis: Vor dem Versuchen, sollten die zu messende Probe und wie die Probe zu befestigen und die Mikroelektroden immobilisiert werden. <ol><li> Für Xenopus laevis Oozyten Messungen schneiden Sie ein 1 cm Quadrat einer 800 &amp; mgr; m Nylon-Mesh (Nitex mesh) und kleben Sie es in eine Kunststoff-Petrischale (1E). </li></ol> 5. Ion Flussmessung <ol><li> Messung der Ionenkonzentration in dem Puffer verwendet, um die Messungen auf der Probe in der gleichen Weise wie für die Kalibrierungslösung auszuführen vorhanden. X. laevis Oozyten benötigen Marks Modifizierte Ringer (MMR). D100 NaCl, 2 KCl, CaCl 2, 1 MgCl und 5 HEPES: issolve NaCl, KCl, CaCl, MgCl und HEPES in deionisiertem Wasser auf eine Endkonzentration (mM) zu erreichen. Den pH-Wert des Puffers auf 7,5 mit NaOH. </li><li> Legen Sie die Probe in die Messkammer und bringen die ionenselektiven Mikroelektroden in der Nähe der Probe (etwa 10 &amp; mgr; m entfernt) mit der Mikropositionierer in die geschlossene Position der Mikroelektrode (3A) zu definieren. </li><li> Starten Sie den niedrigen Frequenz (0,3 Hz) Ausflug (100 um) der Mikroelektrode zwischen der geschlossenen Position und einer Position weg von der Probe (fernen) unter Verwendung der speziellen Software. Sicherzustellen, dass die Bewegung der Mikroelektrode senkrecht zur Oberfläche der Probe. Hinweis: Der Ausflug der Mikroelektrode kann über die Software eingestellt werden. Große Auslenkung nimmt die Steigung zu lesen erlaubt eine einfachere Erkennung kleiner Flüsse während der Messung, während verlängert die Abtastzeit, und verringert die Zeitauflösung. Sehen <strong&gt; 3A ein Beispiel. </li><li> Starten Sie die Aufnahme mit Hilfe der Software. Die Mikroelektrode Pausen bei jeder Position und das elektrische Potential in mV auf dem Computer aufgezeichnet. Erhalten Sie Messungen für mindestens 2 min, wodurch Signalstabilisierung. Bei kurzen Zeitraffer-Experimente, Plattenpotentialänderungen an der Stelle von Interesse für den gesamten Zeitverlauf. </li><li> Extrahieren Sie die Daten als txt-Datei und kopieren Sie die Werte in eine Tabellenkalkulationsdatei. </li><li> Berechnung der Ionenkonzentration entsprechend den mV Werte in der gleichen Weise wie für die Kalibrierungswerte. Zeichnen Sie den Wert. Hinweis: Wenn ein Ionenfluss vorhanden ist, erkennt der Mikroelektrode einen Unterschied in der Ionenkonzentration zwischen den zwei Positionen (3B). </li><li> Berechnung der Ionenfluss mittels Fickschen Diffusionsgesetz wie zuvor (Schritt 3.3.1). </li><li> Wiederholen Sie den Messpuffer vor der Messung einer neuen Probe und wiederholen Sie die Prozedur des Flussmessung und die Berechnung für jedes neueProbe. </li></ol> 6. Statistische Analyse und Datenpräsentation <ol><li> Testen Sie die unabhängige Wirkung der Position und / oder der Zeit auf Ionenflüsse unter der Kontrolle Zustand mit Hilfe eines ANCOVA-Modell mit gemischten Effekten 28. Hinweis: Kovarianzanalyse (ANCOVA) ist eine allgemeine lineare Modell, dass ein normales ANOVA und Regressions mischt, indem sowohl kategorische und kontinuierliche Maßnahmen, um als unabhängige Variable verwendet werden. Zusätzlich wird in der Gegenwart von korrelierten Fehler von wiederholten Messungen pro Individuum und eventuelle verschachtelte Effekte induziert werden gemischte Wirkungen Modelle verwendet werden, um genaue Schätzungen der festen als auch zufällige Effekte zu modellieren. </li><li> Berechnen Sie paarweise Vergleiche mit Student t -Test zwischen Gruppenebene mit Bonferroni-Korrektur für multiples Testen 28. </li><li> Erzeugen Boxplots zum Ionenfluß Messungen nach Position und Zeit zusammenzufassen. Schließen p-Werte von der beschriebenen paarweisen Student toben (Figur 3D) und bestimmen Signifikanzniveaus von p-Werte wie folgt: *: p &lt;0,05; **: P &lt;0,01; ***: P &lt;0.001 29 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Messung der extrazellulären Ionenflüsse in vivo sind: die Verringerung der Geräusche, die korrekte Herstellung des ionenselektive Mikroelektroden und die Referenzelektrode und die Positionierung der Probe und den beiden Elektroden. Um den Lärm zu minimieren, sollte das Aufzeichnungssystem in einem geerdeten (geerdet) Faraday-Käfig, vorzugsweise mit einem Metall-Spitze (Schwingungsisolation) Tabelle, die ebenfalls geerdet ist, sein...

<html> Alle Tierzellen sind durch eine Lipiddoppelschicht-Membran, die das Zytoplasma von der äußeren Umgebung trennt umgeben. Die Zelle hält einen elektrischen Membranpotentials negativ innen, durch aktiven Transport von Ionen 1. Das Membranpotential ist eine gespeicherte Energiequelle, die die Zelle zu verwenden, um verschiedene molekulare Vorrichtungen in der Membran 2 zu betreiben. Neuronen und anderen erregbaren Zellen verfügen über große Membranpotentialen. Schnelles Öffnen von Natriumkanälen kollabiert das Membranpotential (Depolarisation) und erzeugt das Aktionspotential, das entlang der Länge des Neurons 2 transportiert wird. Abgesehen von diesen schnellen elektrischen Veränderungen, viele Gewebe und Organe erzeugen und aufrechtzuerhalten signifikante langfristige elektrische Potentiale. Zum Beispiel, Haut und Hornhaut-Epithel erzeugen und aufrechtzuerhalten transepitheliale Potenziale und extrazelluläre elektrische Ströme durch gerichtetes Pumpen von Ionen (vor allem Natrium und Chlorid) 3. Zelt &quot;&gt; Während Messungen von endogenem extrazellulären elektrischen Strom unter Verwendung des vibrierenden Sonde 4-6 und Messungen der Membran oder transepithelialen Potentiale mit der Mikroelektrodensystem 7-10 ermöglichen die Messung der elektrischen Parameter der Zellmembranen und epithelialen Zellschichten, geben sie keinen Angabe der beteiligten Ionenspezies. Mikroelektroden mit selektive Ionophor können bestimmte Ionenkonzentration in der Lösung zu messen. Ionengradienten oder Flußmittel könnte mit zwei oder mehr Elektroden, die an verschiedenen Positionen gemessen werden. Jedoch würde die intrinsische Spannungsdrift jeder Sonde unterschiedlich sein, was zu ungenauen Messungen oder Detektion eines Gradienten, der nicht vorhanden war. Eine einzelne Elektrode in &quot;selbstverweis&quot; -Modus verwendet werden, wobei es bei niedrigen Frequenzen bewegt zwischen zwei Punkten löst dieses Problem. Nun ist die Ionenfluss kann vor dem Hintergrund einer relativ langsamen und stabilen Signaldrift zu sehen ist (siehe 3B). </p&gt; Die ionensensitiven Messsystem verwendet ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden auf kleine extrazellulären Flüsse von Ionen in der Nähe von Gewebe oder einzelne Zellen zu erkennen. Das System besteht aus einem Verstärker, der das Signal von der Mikroelektrode und einem Mikro-Schrittmotor und Treiber, um die Bewegung des Mikrokontrollverfahren. Die ionenselektive Mikroelektroden und die Referenzelektrode, die den Stromkreis zu schließen sind, um den Verstärker über einen heads Vorverstärker (1A) verbunden ist. Computer-Software bestimmt, welche Parameter der Mikrobewegung (Frequenz, Entfernung) und zeichnet den Ausgang des Verstärkers. Der Schrittmotor steuert die Mikrobewegung über eine dreidimensionale Mikropositionierers. Ein Niederfrequenzvibrationsionenselektive Mikroelektroden wurde erstmals 1990 entwickelt, die spezielle Calciumfluss 11 zu messen. Sowie Calcium, sind kommerziell zugänglich Ionophor Cocktails jetzt für MICR machenoelectrodes empfindlich Natrium, Chlorid, Kalium, Wasserstoff, Magnesium, Nitrat, Ammonium, Fluorid, Lithium oder Quecksilber. Grundsätzlich wandelt das selbst verweisende ionenselektive Mikroelektroden-Technik die Aktivität eines spezifischen Ions in einer Lösung gelöst, in ein elektrisches Potential, das von einem Voltmeter gemessen werden kann. Das Ionophor Cocktail ist eine nicht mischbare Flüssigkeit (organisch lipophile Phase) mit Ionenaustauscheigenschaften. Das Ionophor selektiv Komplexe (bindet) spezifische Ionen reversibel und überträgt sie zwischen der in der Mikroelektrode (Elektrolyt) enthaltenen wässrigen Lösung und der wässrigen Lösung, in der die Mikroelektrode eingetaucht ist (Figur 1D). Diese Ionentransfer führt zu einer elektrochemischen Gleichgewichts und eine Änderung des elektrischen Potentials zwischen der Mikroelektrode und der Referenzelektrode wird durch das Voltmeter gemessen. Die Spannung ist proportional zu dem Logarithmus der spezifischen Ionenaktivität nach der Nernst equation ermöglicht die Berechnung der Ionenkonzentration (2A und B). Derzeit mehrere Systeme ermöglichen die Messung von Ionenfluss mit einem ähnlichen Konzept oder Prinzip. Zum Beispiel kann die Scanning ionenselektive Elektrode Technique (SIET) 12,13 oder der Mikroelektrode Ion Flux Estimation (MIFE) Technik, die von Newman und Shabala 14-16 entwickelt sind im Handel erhältlich und weit von der Forschungsgemeinschaft, um bestimmte Ionen zu bestimmen Flüsse an Zellmembran und Gewebe vorkommenden in einer Vielzahl von Tieren, Pflanzen und einzelnen lebenden Zellmodellen. Ionenselektive Mikroelektroden wurden verwendet, um Wasserstoff, Kalium- und Calciumflusses über die Pflanzenwurzeln 17, Chlorid Flussmittel in Ratten zu messen Hirnarterien 18 und in Pollenschläuchen 19, Wasserstofffluss in Skate Retinazellen 20, Calcium-Fluss in Mausknochen 21, verschiedene Ionen Flüsse in Pilzhyphen 22 und in rbei Hornhaut 23 und schließlich Calciumfluss während der einzelnen Zelle Wundheilung 12,24. Siehe auch die folgende Rezension für detaillierte Informationen über ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden 25. Der folgende Artikel beschreibt im Detail, wie die Vorbereitung und durchführen Messung der endogenen extrazellulären Ionenflüsse mit der ionenselektiven selbst verweisende Mikroelektroden-Technik auf Einzelzellebene.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IonAmp&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonAmp32&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage pre-amplifier</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>INA116</td>
			<td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroStep Driver</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micropositioner&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>Model KITE-R</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Model M10</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table&#160;&#160;</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model VW-3036-OPT-023040</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&#176;, slotted faces</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model 360-90</td>
			<td>Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>460PD-X</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td>
			<td>Newport Inc.</td>
			<td>460A-XY</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>&#160;PC-10</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal rack</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>none</td>
			<td>Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>QL</td>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85126</td>
			<td>Hazardous, handle as recommended by provider&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish; Pyrex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode/micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>E215</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-595E</td>
			<td>Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597722</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S97329</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QSW-A15P</td>
			<td>with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3S</td>
			<td>with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60872-306</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh</td>
			<td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td>
			<td>NTX750</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue; Loctite epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500043-451</td>
			<td>Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>99053</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>none</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique

Zellen von Tieren, Pflanzen und Einzelzellen durch eine Barriere genannt Zellmembran in das Cytoplasma von außen trennt umschlossen. Zellschichten wie Epithelien bilden ebenfalls eine Barriere, die von außen nach innen oder verschiedenen Kompartimenten mehrzelligen Organismen trennt. Ein Schlüsselmerkmal dieser Hindernisse ist die differentielle Verteilung der Ionen über die Zellmembranen oder Zellschichten. Zwei Eigenschaften erlauben diese Verteilung: 1) Membranen und Epithelien zeigen selektive Permeabilität auf bestimmte Ionen; 2) Ionen werden durch Pumpen durch die Zellmembranen und Zellschichten transportiert. Diese Eigenschaften spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gewebephysiologie und fungieren als Signal Hinweise nach der Beschädigung während der Reparatur oder unter pathologischen Zustand. Die ionenselektive selbst verweisMikroElektrode ermöglicht Messungen bestimmter Flüsse von Ionen, wie Calcium, Kalium oder Natrium auf Einzelzell und Gewebespiegel. Die Mikroelektrode enthält ein Ionophor Cocktail, der istselektiv durchlässig, um eine bestimmte Ion. Die interne Fülllösung enthält eine Reihe Konzentration des Ions von Interesse. Das elektrische Potential der Mikroelektrode wird durch die Außen Konzentration des Ions bestimmt. Da die Ionenkonzentration variiert, ändert sich das Potential der Mikroelektrode in Abhängigkeit von dem Logarithmus der Ionenaktivität. Wenn vor und zurück in der Nähe einer Quelle oder Senke des Ions (dh in einem Konzentrationsgradienten aufgrund Ionenfluß) bewegt die Mikroelektrodenpotential schwankt mit einer Amplitude proportional zu der Ionenfluss / Steigung. Der Verstärker verstärkt das Mikroelektrodensignal und das Ausgangssignal wird auf dem Rechner aufgezeichnet. Ionenflusses kann dann durch Fickschen Diffusionsgesetz unter Verwendung der Elektrode Potentialschwankung, die Auslenkung der Mikroelektrode und andere Parameter, wie die spezifische Ionenmobilitäts berechnet werden. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail das Verfahren zur Berechnung der extrazellulären Ionenflüsse zu messen unter Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektrode eind präsentieren einige repräsentative Ergebnisse.

Wir haben bereits gezeigt, dass Calcium-Einstrom erscheint nach Einzelzelle Verwundung 24. Wir haben daher die Frage, ob andere Ionenflüsse auf Einzelzell Verwundung auftritt. Wir haben das X. laevis Oozyten, ein gut etabliertes Modell für einzelne Zelle die Wundheilung 30-34 und elektrophysiologische Ableitung 24,35-39. Interessanterweise sind Kaliumionen mehr in X. konzentrierten laevis Oozyten (ca. 110 mM) 40 als in der extrazellulären Lösung ...

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Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Aufrufe.  University of California, Davis. Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Serie: Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI-Probenvorbereitung: Die Ultra Thin-Layer-Methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Forschung

Biologie

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

Rekapitulation eines Ionenkanals IV Curve mit Frequenzkomponenten

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Mess-Fast-Flux Calcium in Kardiomyozyten

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Quantitative Messung der Invadopodia-vermittelte extrazellulären Matrix Proteolyse in Einzel-und Multizelluläre Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Funktionelle Charakterisierung von Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Wärmetauscher von intrazellulären Kompartimente Mit Proton-Tötung Selection man sie an der Plasmamembran Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Methods Article

Die Messung der extrazellulären Ionenflüsse Verwendung der ionenselektiven selbst verweisMikroElektroden-Technik