Wir danken die Mitgliedern des Division of Genome Science and Laboratory für Systembiologie und Medizin, RCAST, The University of Tokyo. Wir danken vor allem Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSMB, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida und Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) für hilfreiche Gespräche und Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Beihilfe für junge Wissenschaftler (A) (26710005, T.O.), Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (26116711 und 16 H 01567, T.O.) und Beihilfe für anspruchsvolle Explorative Forschung (16K 14605, T.O.) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan, der Takeda Science Foundation (T.O.), Kobayashi Stiftung Krebsforschung (T.O.) und das Projekt für die Krebsforschung und Therapeutischen Evolution (P-erstellen) und die praktische Forschung für Innovative Krebsbekämpfung aus Japan Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED (T.O.).

1. Vorbereitung des sauren Kulturmedium
<ol><li>
Vorbereitung des Steuerelements (pH 7,4) und niedrigem pH-Wert (pH 6.8) Kulturmedium
	<ol>
<li>4,75 g Pulver DMEM ohne L-Glutamin in 500 mL Wasser auflösen.</li>
		<li>0,33 M Nahco33 Lösung in eine Druckdichte Flasche ansetzen. Achtung: Es ist wichtig, einen engen Druckflasche zu verwenden, da Nahco33 CO2 -Gas strahlt Wenn erhitzt und thermisch zersetzt.</li>
		<li>Autoklav das Medium und Lösung. Lassen Sie diese Puffer auf 25 ° c abkühlen</li>
		<li>Fügen Sie 200 mM L-Glutamin, 5 mL von Penicillin-Streptomycin, 5 mL und 50 mL der fötalen Rinderserum, 500 mL DMEM ohne Bikarbonat.</li>
		<li>Steuermedium (pH 7,4) fügen Sie hinzu 2,4 mL 0,33 M Nahco33 Lösung pro 100 mL DMEM ohne Bikarbonat. Hinzugeben Sie für mittlere und niedrige pH-Wert (pH 6,8) 0,6 mL 0,33 M Nahco33 Lösung pro 100 mL DMEM ohne Bikarbonat.</li>
		<li>Überprüfen Sie die mittlere pH nach 24 h Inkubation bei 37 ° C weniger als 5 % CO2. Hinweis: Die Menge der Nahco33 Lösung muss je nach der mittlere pH-Wert eingestellt werden, die abhängig von der CO2 -Gehalt der Inkubator und Luftdruck unterscheiden können. Im Idealfall zum ersten Mal ist es besser, die mittlere pH mit verschiedenen Konzentrationen von Bikarbonat zu bestimmen, die entsprechende Menge an Nahco33 Lösung DMEM hinzu zu messen.<ol>
<li>Kulturmedium sofort nach dem Entfernen der Kulturschale aus dem CO2 Inkubator zu sammeln und den pH-Wert mit einem pH-Meter zu messen. Halten Sie die mittlere Temperatur bei 37 ° C mit einem Wasserbad, wenn nötig. Messen des mittlere pH-Werts dreimal unabhängig. Hinweis: Nahco33 Lösung sollte bei 4 ° C gelagert werden und jedes Medium sollten frisch zubereitet. Im Handel erhältliche Produkte, die in dieser Studie verwendet werden können sind in Tabelle Materialienaufgeführt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung Laktat-induzierte oder HCl-induzierte sauren Kulturmedium
	<ol>
<li>100 mL des Steuermediums (vorbereitet in Schritt 1.1.5) fügen Sie 74 µL Laktat-Lösung oder 125 µL 1 M HCl hinzu.</li>
		<li>Überprüfen Sie die mittlere pH nach 24 h Inkubation bei 37 ° C weniger als 5 % CO2. Hinweis: Die Menge an Laktat oder HCl-Lösung muss auch nach der mittlere pH-Wert eingestellt werden, die abhängig von der CO2 -Gehalt in den Inkubator und Luftdruck unterscheiden können. Im Idealfall ist es besser, die mittlere pH mit seriellen Laktat oder HCl-Konzentration zu bestimmen, den entsprechenden Betrag für die Anpassung an den gewünschten pH-Wert des Mediums zu messen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) die Ernte und die Behandlung von Zellen
<ol><li>Kultivierung von Zellen bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 mindestens 1 Woche vor der Durchführung Experimente zu starten. Hinweis: Die in dieser Studie verwendeten Zelllinien sind in Tabelle Materialienaufgeführt.</li>
	<li>Durchgang-Zellen, wenn sie 70-90 % Konfluenz zu erreichen. Lassen Sie sich nicht die Zellen konfluierende werden. Verändern Sie das Medium alle 2-3 Tage beim täglichen Anbau.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 5 mL PBS. Aspirieren der PBS und fügen Sie trennen Enzym wie 1 mL Trypsin.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C, bis die Zellen gerundet sind und anfangen zu lösen.</li>
	<li>Die freistehenden Zellen 5 mL Kulturmedium hinzu und deaktivieren Sie Enzym zu. Übertragen der Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 3 min bei 300 X g. Aspirat überstand und wieder auszusetzen, die Zellen mit Nährmedium.</li>
	<li>Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hemocytometer und Trypan blau.</li>
	<li>Samen 5.0 x 105 Zellen/nun von einer 10-cm-Schüssel in 10 mL Medium. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen mit 5 mL PBS, und 10 mL sauren Kulturmedium in Abschnitt 1 vorbereitet. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.</li>
</ol>3. RNA Isolierung
<ol><li>Aspirieren Sie Kulturmedium und waschen Sie Zellen mit 5 mL PBS. Stören die Zellen durch Zugabe von RNA-Extraktion-Reagenz (siehe Tabellen der Materialien).</li>
	<li>Kratzen Sie die Schüssel kurz, dann entfernen Sie das RNA-Extraktion-Reagenz mit einer Pipette und hinterlegen Sie die RNA Extraktion Reagenz/Zelle lysate in einem 1,5 mL-Tube. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie 250 µL Chloroform und schütteln Sie das Rohr für ca. 15 S. lassen bei Raumtemperatur für 5 min und Zentrifuge auf ≥8, 000 X g für 5 min. kräftig.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Phase mit einer Pipette. Einige der wässrigen Phase hinter sich zu lassen. Legen Sie in einem anderen 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>Die wässrige Phase 550 µL Isopropanol hinzufügen und vorsichtig mischen. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (≥20, 000 X g) für 20 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Gießen Sie das Isopropanol und fügen Sie 1 mL 75 % Ethanol in DEPC Wasser behandelt. Mischen Sie vorsichtig. 8.000 x g für 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Pipette aus Ethanol und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen.</li>
	<li>Fügen Sie (je nach Ausbeute) ca. 15-25 µL DEPC Wasser zu den RNA-Pellet aufbereitet. Mischen Sie gründlich.</li>
	<li>Messen die Konzentration der isolierten RNA durch die Messung der OD bei 260 nm mit einem Spektralphotometer.</li>
</ol>(4) cDNA Synthese
<ol><li>Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einer PCR-Reaktion-Röhre: bis zu 5 µg Gesamt-RNS, 1 µL Oligo-dT (50 µM) oder zufällige Primer-Mischung (60 µM) 1 µL 10 mM dNTP und Nuklease-freies Wasser auf ein Gesamtvolumen von 14 µL.</li>
	<li>Mischen und kurz Zentrifugieren Sie die Komponenten mit einer kleinen Benchtop-Zentrifuge (~ 5 s). Denaturieren Sie die Probe RNA/Primer für 5 min bei 65 ° C. Drehen Sie kurz (~ 5 s) mit einem kleinen Benchtop Zentrifugieren und setzen die Probe sofort für mindestens 1 min auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie die folgenden Komponenten: 4 µL 5 x Reverse Transkription Puffer, 1 µL Reverse Transkriptase (200 U/µL) 1 µL RNase-Inhibitor (40 U/µL). Hinweis: Beispiele von handelsüblichen Kits werden in Tabelle der Materialien angezeigt.
</li>
	<li>Röhrchen, mischen, und dann kurz den Inhalt mit Hilfe einer kleinen Benchtop-Zentrifuge Zentrifugieren (~ 5 s). Inkubieren Sie die kombinierte Reaktionsmischung bei 50-55 ° C für 10 min.</li>
	<li>Inkubation bei 80 ° C für 10 min, um die Reaktion zu inaktivieren.</li>
</ol>5. Messung der Säure eine geschlechtergerechte Genexpression mittels Real-Time PCR
<ol><li>Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einer Reaktion 384-Well-Platte: 1 µL Vorlage cDNA, 0,75 µL 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µL 50 µM nach vorne Grundierung, 0,3 µL 50 µM reverse Primer, 1 µL Taq Polymerase, 2,5 µL 10 x Taq Polymerase-Puffer, 2,5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL Wasser. Hinweis: Beispiel für kommerziell erhältlichen Kits sind in Tabelle Materialiengezeigt. Der Primer ist in Tabelle 1aufgeführt. Eine Reaktion der 96-Well-Platte kann auch in diesem Schritt verwendet werden. Andere Sonden (z.B. Taqman Sonde) können auch verwendet werden.</li>
	<li>Richten Sie das Experiment und die folgenden PCR-Programm auf einem Real-Time PCR System: 50 ° C für 2 min, 1 Zyklus; 95 ° C für 10 min, 1 Zyklus; 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min, 40 Zyklen; 95 ° C für 15 s, 1 Zyklus; 60 ° C für 15 s, 1 Zyklus; 95 ° C für 15 s, 1 Zyklus.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in der qPCR-Instrument. Starten Sie das Programm. Hinweis: Hochregulation der pH-Wert responsive Gene MSMO1, INSIG1und IDI1 können durch Protein-Spiegel gemessen werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

Der Autor Ayano Kondo ist ein Mitarbeiter von Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

Wir hier eine einfache sauren pH-Wert Kultursystem und seine Bewertung. Die Kombination der drei Methoden der mittleren Versauerung, d.h.reduzierte Bikarbonatkonzentration, Laktat-Zusatz und HCl hinaus ermöglichte, die pH-Wirkungs-Mechanismus gründlich zu untersuchen und die zelluläre Antwort auf andere Tumor vergleichen microenvironmental Erkrankungen wie Hypoxie oder Nährstoff verhungern.
Der Schlüssel dieser Methode ist, die entsprechenden Konzentrationen von Bikarbonat, Lakta...

Der Tumor Mikroumgebung spielt wichtige Rolle in der Tumorprogression und Krebs Zelle Stoffwechsel1,2,3. Krebszellen sind oft an Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoff Entbehrungen und sauren extrazellulären pH (pHe) ausgesetzt. Jedoch die Rolle der PWT in Tumorprogression nicht geklärt so umfassend wie Hypoxie oder Nährstoff verhungern. PHe im Tumorgewebe werden sauer, etwa pH 6,84,5zu erreichen. Die saure pH-Wert ergibt sich aus aeroben und anaeroben glykolytischen Ausscheidung von Protonen (H+) und Laktat durch wuchernden Krebs Zellen5,6.
Neuere Studien gezeigt, dass sauer pHe-induzierte Histon Deacetylation, Fettsäureoxidation und Exozytose von sauren Lysosomen zur Anpassung an die starken sauren Milieu7,8,9,10. Die Mechanismen, durch welche extrazelluläre Übersäuerung beeinträchtigt jedoch Krebs Verhalten und die Identität des Schlüssels, die Regulierungsbehörden in den sauren pH-Wert Tumor Mikroumgebung nicht vollständig ermittelt wurden. Darüber hinaus mehrere Berichte beschrieben verschiedene sauren pH-Wert-Medien mit unklaren Konzentrationen von Bikarbonat, Tris, Rohre und HEPES-Puffer oder Laktat und HCl, aber es gibt einige Berichte, die Stabilität der die angepasste mittlere noch umfassender zu demonstrieren Vergleich von mehrere verschiedene saure Nährmedien7,8,9,10
Um die wichtigsten Regulatoren und metabolischen Veränderungen in Krebszellen im Rahmen der extrazelluläre Übersäuerung zu erhellen, wir eine einfache in-vitro- Kultur-Modell zur Aufrechterhaltung eines sauren pHe und untersuchte die Rolle von pHe in Krebs Zellen11. Mit dieser Methode, wir erhalten eine saure Kulturmedium mit einem PWT von 6,8 bei 37 ° C weniger als 5 % CO2, mit reduzierten Bicarbonat Konzentrationen in das Kulturmedium. pH 7.4 diente als normal und Medium zu kontrollieren. Der mittlere pH-Wert war für mindestens 24 Stunden getragen und degressiv von 72 h während der Kultur der Bowle-1 und1 AsPC pankreatischen Krebszellen. Da erhöhte Glykolyse beschleunigt die Ausscheidung von Protonen sondern auch Laktat7,8,9, wir auch etabliert eine Kultur-Methode imitiert Laktat-induzierten Azidose durch Hinzufügen von Laktat, anstatt verringern die Bikarbonatkonzentration. HCl-induzierte sauren pHe im Medium ermöglicht darüber hinaus ausschließen, die zelluläre Reaktionen auf sauren pH-Wert Kulturmedium nicht durch eine verminderte Konzentration von Bikarbonat. Mit verschiedenen Medien mit einem pH-Wert von 6,4 bis 7,4 mit verschiedenen Bikarbonatkonzentration, können wir darüber hinaus das Ausmaß der PWT Auswirkungen auf zellulärer Antworten bewerten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium&#8220;Nissui&#8221; 2</td>
			<td>Nissui</td>
			<td>05919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>09367-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>32778-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>18091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR Green PCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems&#160;</td>
			<td>4368702&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AsPC-1</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMS-6</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td>JCRB0432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIG</td>
			<td>JCRB Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CRL-1682</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Bedingungen der Tumor Mikroumgebung, z. B. Hypoxie oder Nährstoff Hunger, spielen wichtige Rollen in der Tumorprogression und Bösartigkeit. Jedoch wurde die Rolle der sauren extrazellulären pH im Tumor Aggressivität und der zugrunde liegende Mechanismus nicht ausgiebig gegenüber Hypoxie oder Nährstoff verhungern Bedingungen untersucht. Darüber hinaus wurde eine klar definierte Kultur-Methode, um die sauren extrazelluläre Tumor Mikroumgebung imitieren nicht vollständig gemeldet.
Hier präsentieren wir eine einfache in-vitro- Kultur Methode, um beizubehalten, sauren extrazellulären pH mit Bikarbonat und erhöhte Laktat oder HCl-Konzentrationen in das Kulturmedium verringert. Der mittlere pH-Wert war für mindestens 24 Stunden getragen und degressiv von 72 h nach Kultur der Bowle-1 und1 AsPC pankreatischen Krebszellen. Drei unterschiedliche sauren Medien Bedingungen in dieser Studie im Vergleich hoch hochreguliert pH-responsive Gene wie MSMO1, INSIG1und IDI1 zu Hypoxie oder Nährstoff Hunger. Die Hochregulation dieser Gene kann als Marker des sauren pH-Wertes verwendet werden. Diese einfachen Techniken sind vorteilhaft für die zugrunde liegenden Mechanismen der malignen Tumor unter sauren Tumor Mikroumgebung aufzuklären. Unser extrazelluläre sauren pH-Wert-Kultur-System ermöglicht somit, Entdeckung der zellulären sauren pH-Wert Antworten nicht nur in den Krebszellen, sondern auch in Primärzellen, z. B. röhrenförmigen Nierenzellen, in Bezug auf die anderen sauren Störungen einschließlich, diabetische Ketoazidose, Laktatazidose, renale tubuläre Azidose und Respiratorische Azidose.

Um die geeignete Bicarbonat-Konzentration zu bestimmen, wir DMEM im Bereich von 0 - 8 mM Nahco33 (Endkonzentration in das Kulturmedium) vorbereitet und ist es gelungen, bei der Vorbereitung von Nährmedien mit pH-Wert von 6,4-7,4 (Abbildung 1). Wir vorbereitet DMEM mit 8 mM Nahco33 (pH 7,4) als Steuermedium und 2 mM Nahco33 (pH 6.8) als Medium mit sauren pH-Wert nach einem vorherigen Bericht besagt, dass der extrazelluläre pH...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Die sauren Tumor Mikroumgebung spielt wichtige Rollen in Tumorprogression. Um die Auswirkungen des sauren extrazellulären pH auf Krebs Zellen in vitro zu beurteilen haben wir einfache saure Kultur-Systeme etabliert.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

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Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

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Serie: Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The plant hormone auxin rapidly stimulates cell elongation in young stems and similar tissues at least in part by an acid-growth mechanism 2, 3. Auxin activates a H+ pump in the plasma membrane, causing acidification of the cell wall solution. Wall acidification activates expansins, which are endogenous cell wall-loosening proteins 4, causing the cell wall to yield to the wall tensions created by cell turgor pressure. As a result, the cell begins to enlarge rapidly. This 'acid growth' phenomenon is readily measured in isolated (nonliving) cell wall specimens. The ability of cell walls to undergo acid-induced extension is not simply the result of the structural arrangement of the cell wall polysaccharides (e.g. pectins), but depends on the activity of expansins 5. Expansins do not have any known enzymatic activity and the only way to assay for expansin activity is to measure their induction of cell wall extension. This video report details the sources and preparation techniques for obtaining suitable wall materials for expansin assays and goes on to show acid-induced extension and expansin-induced extension of wall samples prepared from growing cucumber hypocotyls.
 To obtain suitable cell wall samples, cucumber seedlings are grown in the dark, the hypocotyls are cut and frozen at -80 &deg;C. Frozen hypocotyls are abraded, flattened, and then clamped at constant tension in a special cuvette for extensometer measurements. To measure acid-induced extension, the walls are initially buffered at neutral pH, resulting in low activity of expansins that are components of the native cell walls. Upon buffer exchange to acidic pH, expansins are activated and the cell walls extend rapidly. We also demonstrate expansin activity in a reconstitution assay. For this part, we use a brief heat treatment to denature the native expansins in the cell wall samples. These inactivated cell walls do not extend even in acidic buffer, but addition of expansins to the cell walls rapidly restores their ability to extend.

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

We demonstrate the use of a constant-force extensometer to measure long-term extension (creep) of plant cell wall specimens induced by acidic buffers and expansin protein.

Messen pflanzlichen Zellwand Extension (Creep) durch saure pH-Wert und von Alpha-Expansin Induced

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Forschung

Biologie

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Ein Ex-ovo Chicken Embryo Culture-System Geeignet für Imaging und Mikrochirurgie Anwendungen

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Kultur-System, um Schilddrüsenentwicklungsstudie

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Algen Konjugation

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

Messung des Zusammenflusses von iPSCs mit einem automatisierten Bildgebungssystem.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, nutrients, metabolites, pathogens, and the microbiota. Methods to culture intestinal organoids are now available for multiple species, including pigs, which is a species of major interest both as a farm animal and as a translational model for humans, for example, to study zoonotic diseases. Here, we give an in-depth description of a procedure used to culture pig intestinal 3D organoids from frozen epithelial crypts. The protocol describes how to cryopreserve epithelial crypts from the pig intestine and the subsequent procedures to culture 3D intestinal organoids. The main advantages of this method are (i) the temporal dissociation of the isolation of crypts from the culture of 3D organoids, (ii) the preparation of large stocks of cryopreserved crypts derived from multiple intestinal segments and from several animals at once, and thus (iii) the reduction in the need to sample fresh tissues from living animals. We also detail a protocol to establish cell monolayers derived from 3D organoids to allow access to the apical side of epithelial cells, which is the site of interactions with nutrients, microbes, or drugs. Overall, the protocols described here is a useful resource for studying the pig intestinal epithelium in veterinary and biomedical research.

Here, we describe a protocol to culture pig intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts. We also describe a method to establish cell monolayers derived from 3D organoids, allowing access to the apical side of epithelial cells.

Kultivierung von Ferkel-Darm-3D-Organoiden aus kryokonservierten Epithelkrypten und Etablierung von Zellmonoschichten

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

Verbesserte Isolierung bakterieller extrazellulärer Vesikel für Mikrobiota-Multi-Omics

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

Autor im Rampenlicht: Beschleunigung der Forschung zur Trennung und Heterogenität bakterieller extrazellulärer Vesikel 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.