Wir danken die Mitgliedern des Division of Genome Science and Laboratory für Systembiologie und Medizin, RCAST, The University of Tokyo. Wir danken vor allem Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSMB, RCAST, The University of Tokyo), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida und Dr. A. Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) für hilfreiche Gespräche und Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Beihilfe für junge Wissenschaftler (A) (26710005, T.O.), Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (26116711 und 16 H 01567, T.O.) und Beihilfe für anspruchsvolle Explorative Forschung (16K 14605, T.O.) vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie von Japan, der Takeda Science Foundation (T.O.), Kobayashi Stiftung Krebsforschung (T.O.) und das Projekt für die Krebsforschung und Therapeutischen Evolution (P-erstellen) und die praktische Forschung für Innovative Krebsbekämpfung aus Japan Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED (T.O.).

1. Vorbereitung des sauren Kulturmedium
<ol><li>
Vorbereitung des Steuerelements (pH 7,4) und niedrigem pH-Wert (pH 6.8) Kulturmedium
	<ol>
<li>4,75 g Pulver DMEM ohne L-Glutamin in 500 mL Wasser auflösen.</li>
		<li>0,33 M Nahco33 Lösung in eine Druckdichte Flasche ansetzen. Achtung: Es ist wichtig, einen engen Druckflasche zu verwenden, da Nahco33 CO2 -Gas strahlt Wenn erhitzt und thermisch zersetzt.</li>
		<li>Autoklav das Medium und Lösung. Lassen Sie diese Puffer auf 25 ° c abkühlen</li>
		<li>Fügen Sie 200 mM L-Glutamin, 5 mL von Penicillin-Streptomycin, 5 mL und 50 mL der fötalen Rinderserum, 500 mL DMEM ohne Bikarbonat.</li>
		<li>Steuermedium (pH 7,4) fügen Sie hinzu 2,4 mL 0,33 M Nahco33 Lösung pro 100 mL DMEM ohne Bikarbonat. Hinzugeben Sie für mittlere und niedrige pH-Wert (pH 6,8) 0,6 mL 0,33 M Nahco33 Lösung pro 100 mL DMEM ohne Bikarbonat.</li>
		<li>Überprüfen Sie die mittlere pH nach 24 h Inkubation bei 37 ° C weniger als 5 % CO2. Hinweis: Die Menge der Nahco33 Lösung muss je nach der mittlere pH-Wert eingestellt werden, die abhängig von der CO2 -Gehalt der Inkubator und Luftdruck unterscheiden können. Im Idealfall zum ersten Mal ist es besser, die mittlere pH mit verschiedenen Konzentrationen von Bikarbonat zu bestimmen, die entsprechende Menge an Nahco33 Lösung DMEM hinzu zu messen.<ol>
<li>Kulturmedium sofort nach dem Entfernen der Kulturschale aus dem CO2 Inkubator zu sammeln und den pH-Wert mit einem pH-Meter zu messen. Halten Sie die mittlere Temperatur bei 37 ° C mit einem Wasserbad, wenn nötig. Messen des mittlere pH-Werts dreimal unabhängig. Hinweis: Nahco33 Lösung sollte bei 4 ° C gelagert werden und jedes Medium sollten frisch zubereitet. Im Handel erhältliche Produkte, die in dieser Studie verwendet werden können sind in Tabelle Materialienaufgeführt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung Laktat-induzierte oder HCl-induzierte sauren Kulturmedium
	<ol>
<li>100 mL des Steuermediums (vorbereitet in Schritt 1.1.5) fügen Sie 74 µL Laktat-Lösung oder 125 µL 1 M HCl hinzu.</li>
		<li>Überprüfen Sie die mittlere pH nach 24 h Inkubation bei 37 ° C weniger als 5 % CO2. Hinweis: Die Menge an Laktat oder HCl-Lösung muss auch nach der mittlere pH-Wert eingestellt werden, die abhängig von der CO2 -Gehalt in den Inkubator und Luftdruck unterscheiden können. Im Idealfall ist es besser, die mittlere pH mit seriellen Laktat oder HCl-Konzentration zu bestimmen, den entsprechenden Betrag für die Anpassung an den gewünschten pH-Wert des Mediums zu messen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) die Ernte und die Behandlung von Zellen
<ol><li>Kultivierung von Zellen bei 37 ° C weniger als 5 % CO2 mindestens 1 Woche vor der Durchführung Experimente zu starten. Hinweis: Die in dieser Studie verwendeten Zelllinien sind in Tabelle Materialienaufgeführt.</li>
	<li>Durchgang-Zellen, wenn sie 70-90 % Konfluenz zu erreichen. Lassen Sie sich nicht die Zellen konfluierende werden. Verändern Sie das Medium alle 2-3 Tage beim täglichen Anbau.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 5 mL PBS. Aspirieren der PBS und fügen Sie trennen Enzym wie 1 mL Trypsin.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C, bis die Zellen gerundet sind und anfangen zu lösen.</li>
	<li>Die freistehenden Zellen 5 mL Kulturmedium hinzu und deaktivieren Sie Enzym zu. Übertragen der Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 3 min bei 300 X g. Aspirat überstand und wieder auszusetzen, die Zellen mit Nährmedium.</li>
	<li>Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hemocytometer und Trypan blau.</li>
	<li>Samen 5.0 x 105 Zellen/nun von einer 10-cm-Schüssel in 10 mL Medium. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.</li>
	<li>Aspirieren Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Zellen mit 5 mL PBS, und 10 mL sauren Kulturmedium in Abschnitt 1 vorbereitet. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 ° C weniger als 5 % CO2.</li>
</ol>3. RNA Isolierung
<ol><li>Aspirieren Sie Kulturmedium und waschen Sie Zellen mit 5 mL PBS. Stören die Zellen durch Zugabe von RNA-Extraktion-Reagenz (siehe Tabellen der Materialien).</li>
	<li>Kratzen Sie die Schüssel kurz, dann entfernen Sie das RNA-Extraktion-Reagenz mit einer Pipette und hinterlegen Sie die RNA Extraktion Reagenz/Zelle lysate in einem 1,5 mL-Tube. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie 250 µL Chloroform und schütteln Sie das Rohr für ca. 15 S. lassen bei Raumtemperatur für 5 min und Zentrifuge auf ≥8, 000 X g für 5 min. kräftig.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Phase mit einer Pipette. Einige der wässrigen Phase hinter sich zu lassen. Legen Sie in einem anderen 1,5 mL-Tube.</li>
	<li>Die wässrige Phase 550 µL Isopropanol hinzufügen und vorsichtig mischen. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 5 min. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (≥20, 000 X g) für 20 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Gießen Sie das Isopropanol und fügen Sie 1 mL 75 % Ethanol in DEPC Wasser behandelt. Mischen Sie vorsichtig. 8.000 x g für 5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Pipette aus Ethanol und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen.</li>
	<li>Fügen Sie (je nach Ausbeute) ca. 15-25 µL DEPC Wasser zu den RNA-Pellet aufbereitet. Mischen Sie gründlich.</li>
	<li>Messen die Konzentration der isolierten RNA durch die Messung der OD bei 260 nm mit einem Spektralphotometer.</li>
</ol>(4) cDNA Synthese
<ol><li>Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einer PCR-Reaktion-Röhre: bis zu 5 µg Gesamt-RNS, 1 µL Oligo-dT (50 µM) oder zufällige Primer-Mischung (60 µM) 1 µL 10 mM dNTP und Nuklease-freies Wasser auf ein Gesamtvolumen von 14 µL.</li>
	<li>Mischen und kurz Zentrifugieren Sie die Komponenten mit einer kleinen Benchtop-Zentrifuge (~ 5 s). Denaturieren Sie die Probe RNA/Primer für 5 min bei 65 ° C. Drehen Sie kurz (~ 5 s) mit einem kleinen Benchtop Zentrifugieren und setzen die Probe sofort für mindestens 1 min auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie die folgenden Komponenten: 4 µL 5 x Reverse Transkription Puffer, 1 µL Reverse Transkriptase (200 U/µL) 1 µL RNase-Inhibitor (40 U/µL). Hinweis: Beispiele von handelsüblichen Kits werden in Tabelle der Materialien angezeigt.
</li>
	<li>Röhrchen, mischen, und dann kurz den Inhalt mit Hilfe einer kleinen Benchtop-Zentrifuge Zentrifugieren (~ 5 s). Inkubieren Sie die kombinierte Reaktionsmischung bei 50-55 ° C für 10 min.</li>
	<li>Inkubation bei 80 ° C für 10 min, um die Reaktion zu inaktivieren.</li>
</ol>5. Messung der Säure eine geschlechtergerechte Genexpression mittels Real-Time PCR
<ol><li>Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in einer Reaktion 384-Well-Platte: 1 µL Vorlage cDNA, 0,75 µL 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0,3 µL 50 µM nach vorne Grundierung, 0,3 µL 50 µM reverse Primer, 1 µL Taq Polymerase, 2,5 µL 10 x Taq Polymerase-Puffer, 2,5 µL 20 mM dNTP, 16.65 µL Wasser. Hinweis: Beispiel für kommerziell erhältlichen Kits sind in Tabelle Materialiengezeigt. Der Primer ist in Tabelle 1aufgeführt. Eine Reaktion der 96-Well-Platte kann auch in diesem Schritt verwendet werden. Andere Sonden (z.B. Taqman Sonde) können auch verwendet werden.</li>
	<li>Richten Sie das Experiment und die folgenden PCR-Programm auf einem Real-Time PCR System: 50 ° C für 2 min, 1 Zyklus; 95 ° C für 10 min, 1 Zyklus; 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min, 40 Zyklen; 95 ° C für 15 s, 1 Zyklus; 60 ° C für 15 s, 1 Zyklus; 95 ° C für 15 s, 1 Zyklus.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in der qPCR-Instrument. Starten Sie das Programm. Hinweis: Hochregulation der pH-Wert responsive Gene MSMO1, INSIG1und IDI1 können durch Protein-Spiegel gemessen werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cancer+cell+metabolism.">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+metabolism:+Warburg+and+beyond.">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li><li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue:+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer.">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li><li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+pH:+a+perfect+storm+for+cancer+progression.">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li><li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis?.">Why do cancers have high aerobic glycolysis?.</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li><li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH.">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li><li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane.">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752 (2015).</li><li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation.">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li><li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers.">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293 (2008).</li><li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression.">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li></ol>

Der Autor Ayano Kondo ist ein Mitarbeiter von Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

Wir hier eine einfache sauren pH-Wert Kultursystem und seine Bewertung. Die Kombination der drei Methoden der mittleren Versauerung, d.h.reduzierte Bikarbonatkonzentration, Laktat-Zusatz und HCl hinaus ermöglichte, die pH-Wirkungs-Mechanismus gründlich zu untersuchen und die zelluläre Antwort auf andere Tumor vergleichen microenvironmental Erkrankungen wie Hypoxie oder Nährstoff verhungern.
Der Schlüssel dieser Methode ist, die entsprechenden Konzentrationen von Bikarbonat, Lakta...

Der Tumor Mikroumgebung spielt wichtige Rolle in der Tumorprogression und Krebs Zelle Stoffwechsel1,2,3. Krebszellen sind oft an Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoff Entbehrungen und sauren extrazellulären pH (pHe) ausgesetzt. Jedoch die Rolle der PWT in Tumorprogression nicht geklärt so umfassend wie Hypoxie oder Nährstoff verhungern. PHe im Tumorgewebe werden sauer, etwa pH 6,84,5zu erreichen. Die saure pH-Wert ergibt sich aus aeroben und anaeroben glykolytischen Ausscheidung von Protonen (H+) und Laktat durch wuchernden Krebs Zellen5,6.
Neuere Studien gezeigt, dass sauer pHe-induzierte Histon Deacetylation, Fettsäureoxidation und Exozytose von sauren Lysosomen zur Anpassung an die starken sauren Milieu7,8,9,10. Die Mechanismen, durch welche extrazelluläre Übersäuerung beeinträchtigt jedoch Krebs Verhalten und die Identität des Schlüssels, die Regulierungsbehörden in den sauren pH-Wert Tumor Mikroumgebung nicht vollständig ermittelt wurden. Darüber hinaus mehrere Berichte beschrieben verschiedene sauren pH-Wert-Medien mit unklaren Konzentrationen von Bikarbonat, Tris, Rohre und HEPES-Puffer oder Laktat und HCl, aber es gibt einige Berichte, die Stabilität der die angepasste mittlere noch umfassender zu demonstrieren Vergleich von mehrere verschiedene saure Nährmedien7,8,9,10
Um die wichtigsten Regulatoren und metabolischen Veränderungen in Krebszellen im Rahmen der extrazelluläre Übersäuerung zu erhellen, wir eine einfache in-vitro- Kultur-Modell zur Aufrechterhaltung eines sauren pHe und untersuchte die Rolle von pHe in Krebs Zellen11. Mit dieser Methode, wir erhalten eine saure Kulturmedium mit einem PWT von 6,8 bei 37 ° C weniger als 5 % CO2, mit reduzierten Bicarbonat Konzentrationen in das Kulturmedium. pH 7.4 diente als normal und Medium zu kontrollieren. Der mittlere pH-Wert war für mindestens 24 Stunden getragen und degressiv von 72 h während der Kultur der Bowle-1 und1 AsPC pankreatischen Krebszellen. Da erhöhte Glykolyse beschleunigt die Ausscheidung von Protonen sondern auch Laktat7,8,9, wir auch etabliert eine Kultur-Methode imitiert Laktat-induzierten Azidose durch Hinzufügen von Laktat, anstatt verringern die Bikarbonatkonzentration. HCl-induzierte sauren pHe im Medium ermöglicht darüber hinaus ausschließen, die zelluläre Reaktionen auf sauren pH-Wert Kulturmedium nicht durch eine verminderte Konzentration von Bikarbonat. Mit verschiedenen Medien mit einem pH-Wert von 6,4 bis 7,4 mit verschiedenen Bikarbonatkonzentration, können wir darüber hinaus das Ausmaß der PWT Auswirkungen auf zellulärer Antworten bewerten.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium&amp;ldquo;Nissui&amp;rdquo; 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized)</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0.5%-Trypan Blue Stain Solution</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Lactic acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368702&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Cell Bank</td><td>JCRB0432</td><td></td></tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of an extracellular acidic ph culture system

Bedingungen der Tumor Mikroumgebung, z. B. Hypoxie oder Nährstoff Hunger, spielen wichtige Rollen in der Tumorprogression und Bösartigkeit. Jedoch wurde die Rolle der sauren extrazellulären pH im Tumor Aggressivität und der zugrunde liegende Mechanismus nicht ausgiebig gegenüber Hypoxie oder Nährstoff verhungern Bedingungen untersucht. Darüber hinaus wurde eine klar definierte Kultur-Methode, um die sauren extrazelluläre Tumor Mikroumgebung imitieren nicht vollständig gemeldet.
Hier präsentieren wir eine einfache in-vitro- Kultur Methode, um beizubehalten, sauren extrazellulären pH mit Bikarbonat und erhöhte Laktat oder HCl-Konzentrationen in das Kulturmedium verringert. Der mittlere pH-Wert war für mindestens 24 Stunden getragen und degressiv von 72 h nach Kultur der Bowle-1 und1 AsPC pankreatischen Krebszellen. Drei unterschiedliche sauren Medien Bedingungen in dieser Studie im Vergleich hoch hochreguliert pH-responsive Gene wie MSMO1, INSIG1und IDI1 zu Hypoxie oder Nährstoff Hunger. Die Hochregulation dieser Gene kann als Marker des sauren pH-Wertes verwendet werden. Diese einfachen Techniken sind vorteilhaft für die zugrunde liegenden Mechanismen der malignen Tumor unter sauren Tumor Mikroumgebung aufzuklären. Unser extrazelluläre sauren pH-Wert-Kultur-System ermöglicht somit, Entdeckung der zellulären sauren pH-Wert Antworten nicht nur in den Krebszellen, sondern auch in Primärzellen, z. B. röhrenförmigen Nierenzellen, in Bezug auf die anderen sauren Störungen einschließlich, diabetische Ketoazidose, Laktatazidose, renale tubuläre Azidose und Respiratorische Azidose.

Um die geeignete Bicarbonat-Konzentration zu bestimmen, wir DMEM im Bereich von 0 - 8 mM Nahco33 (Endkonzentration in das Kulturmedium) vorbereitet und ist es gelungen, bei der Vorbereitung von Nährmedien mit pH-Wert von 6,4-7,4 (Abbildung 1). Wir vorbereitet DMEM mit 8 mM Nahco33 (pH 7,4) als Steuermedium und 2 mM Nahco33 (pH 6.8) als Medium mit sauren pH-Wert nach einem vorherigen Bericht besagt, dass der extrazelluläre pH...

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Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Die sauren Tumor Mikroumgebung spielt wichtige Rollen in Tumorprogression. Um die Auswirkungen des sauren extrazellulären pH auf Krebs Zellen in vitro zu beurteilen haben wir einfache saure Kultur-Systeme etabliert.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

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Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Balance

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14.6K Aufrufe.  Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Die sauren Tumor Mikroumgebung spielt wichtige Rollen in Tumorprogression. Um die Auswirkungen des sauren extrazellulären pH auf Krebs Zellen in vitro zu beurteilen haben wir einfache saure Kultur-Systeme etabliert.

Serie: Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Beurteilung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakterielle Konsortiums auf der In-vitro- Darm Host-Mikrobe Oberfläche

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Forschung

Biochemie

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

In vitro Monitoring of Extracellular pH in Real-Time

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to chronic inflammation. Without efficient PMN clearance at sites of infiltration, PMN can accumulate and contribute to chronic inflammatory conditions, including the intestinal diseases ulcerative colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). The pH in the distal colon in individuals with active UC can range between a pH of 5 and 6, whereas healthy individuals maintain colonic pH in the range of 6.8-7.4. Extracellular pH has been shown to influence both intestinal epithelial cells and the infiltrating immune cells. More specifically, extracellular acidosis significantly impacts PMN. At pH below 6.5, there are increases in the production of H2O2, inhibition of apoptosis, and increases in the functional lifespan of PMN. Given the significant presence of PMN and extracellular acidification at sites of inflammation, we developed a novel model that allows for the monitoring of extracellular pH during PMN transepithelial migration in real time. Here, we describe this model and how it can be utilized to measure both the apical and basal pH during PMN trafficking. This model can be utilized to monitor extracellular pH under a wide range of conditions; including, hypoxia, PMN transepithelial migration, and for extended periods of time.

<meta charset="utf8"></head><body>In-vitro-Überwachung des extrazellulären pH-Werts in Echtzeit

This article represents a useful in vitro assay to measure changes in extracellular pH during neutrophil (PMN) transepithelial migration (TEM)

In vitro Überwachung des extrazellulären pH-Werts in Echtzeit

Early accumulation of neutrophils (PMN) is a hallmark of acute intestinal inflammation. This acute inflammation is either resolved or progresses to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Chronoamperometrische Analyse der EET bei Lactiplantibacillus plantarum mit DHNA

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron acceptor. This electron acceptor can be an electrode and electrons can be delivered indirectly via a redox-active mediator molecule. Here, we present a protocol to study mediated EET in Lactiplantibacillus plantarum, a probiotic lactic acid bacterium widely used in the food industry, using a bioelectrochemical system. We detail how to assemble a three-electrode, two-chambered bioelectrochemical system and provide guidance on characterizing EET in the presence of a soluble mediator using chronoamperometry and cyclic voltammetry techniques. We use representative data from 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA)-mediated EET experiments with L. plantarum to demonstrate data analysis and interpretation. The techniques described in this protocol can open new opportunities for electro-fermentation and bioelectrocatalysis. Recent applications of this electrochemical technique with L. plantarum demonstrated an acceleration of metabolic flux towards producing fermentation end-products, which are critical flavor components in food fermentation. As such, this system has the potential to be further developed to alter flavors in food production or produce valuable chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers in Milchsäurebakterien mit einem bioelektrochemischen System mit drei Elektroden und zwei Ka

Here we present a protocol for characterizing mediated extracellular electron transfer (EET) in lactic acid bacteria using a three-electrode, two-chamber bioelectrochemical system. We illustrate this method with Lactiplantibacillus plantarum and the redox mediator 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid and provide a thorough description of the electrochemical techniques used to evaluate mediated EET.

Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers in Milchsäurebakterien mit einem bioelektrochemischen System mit drei Elektroden und zwei Kammern

Many bacteria perform extracellular electron transfer (EET), whereby electrons are transferred from the cell to an extracellular terminal electron ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its complex nature, and its diverse association with mammalian components. The goal of this protocol is to culture the gut microbiota in vitro, which allows for the study of the gut microbiota dynamics, without having to consider the contribution of the mammalian milieu. Using in vitro culturing technology, the physiological conditions of the gastro intestinal tract are simulated, including parameters such as pH, temperature, anaerobiosis, and transit time. The intestinal surface of the colon is simulated by adding mucin-coated carriers, creating a mucosal phase, and adding further dimension. The gut microbiota is introduced by inoculating with the human fecal material. Upon inoculation with this complex mixture of bacteria, specific microbes are enriched in the different longitudinal (ascending, transverse and descending colons) and transversal (luminal and mucosal) environments of the in vitro model. It is crucial to allow the system to reach a steady state, in which the community and the metabolites produced remain stable. The experimental results in this manuscript demonstrate how the inoculated gut microbiota community develops into a stable community over time. Once steady state is achieved, the system can be used to analyze bacterial interactions and community functions or to test the effects of any additives on the gut microbiota, such as food, food components, or pharmaceuticals.

Here, we present a protocol for culturing the gut microbiota of the colon in vitro, using a series of bioreactors that simulate the physiological conditions of the gastro intestinal tract.

In-vitro-Kultivierung von Technologie, um den menschlichen Darm Microbiota studieren fortgeschrittene Anwendung

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Biotechnik

Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled environment. Despite vast differences in the physiology between mammals and fish, primary cell culture protocols from fish are often based on mammalian culture conditions, often with only minor modifications. The environmental differences affect not only body temperature, but also blood serum parameters such as osmolality, pH, and pH buffer capacity. As cell culture media and similar working solutions are meant to mimic characteristics of the extracellular fluid and/or blood serum to which a cell is adapted, it is crucial that these parameters are adjusted specifically to the animal in question.
The current protocol describes optimized primary culture conditions for medaka (Oryzias latipes). The protocol provides detailed steps on how to isolate and maintain healthy dissociated pituitary cells for more than one week and includes the following steps: 1. the adjustment of the osmolality to the values found in medaka blood plasma, 2. the adjustment of the incubation temperature to normal medaka temperature (here in the aquarium facility), and 3. the adjustment of the pH and bicarbonate buffer to values comparable to other fish species living at similar temperatures. The results presented using the described protocol promote physiologically meaningful results for medaka and can be used as a reference guide by scientists making primary cell cultures from other non-mammalian species.

Here we describe a protocol to prepare and maintain primary pituitary cell cultures from medaka (Oryzias latipes). The optimized conditions in this protocol take important parameters such as temperature, osmolality, and pH into consideration by mimicking the physiological conditions of the fish, thereby enabling physiologically more meaningful results.

Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen

Primary cell culture is a powerful tool commonly used by scientists to study cellular properties and mechanisms of isolated cells in a controlled ...

Neurowissenschaften

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH are highly regulated in yeast cells and occupy a central role in overall pH homeostasis. We describe protocols for ratiometric measurement of pH in vivo using pH-sensitive fluorophores localized to the vacuole or cytosol. Vacuolar pH is measured using BCECF, which localizes to the vacuole in yeast when introduced into cells in its acetoxymethyl ester form. Cytosolic pH is measured with a pH-sensitive GFP expressed under control of a yeast promoter, yeast pHluorin. Methods for measurement of fluorescence ratios in yeast cell suspensions in a fluorimeter are described. Through these protocols, single time point measurements of pH under different conditions or in different yeast mutants have been compared and changes in pH over time have been monitored. These methods have also been adapted to a fluorescence plate reader format for high-throughput experiments. Advantages of ratiometric pH measurements over other approaches currently in use, potential experimental problems and solutions, and prospects for future use of these techniques are also described.

Measurement of Vacuolar and Cytosolic pH In Vivo in Yeast Cell Suspensions

Vacuolar and cytosolic pH can be measured in live yeast (S. cerevisiae) cells using ratiometric fluorescent dyes localized to specific cellular compartments. We describe procedures for measuring vacuolar pH with BCECF-AM, which localizes to the vacuole in yeast, and cytosolic pH with a cytosolic ratiometric pH-sensitive GFP (yeast pHluorin).

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Beurteilung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakterielle Konsortiums auf der In-vitro- Darm Host-Mikrobe Oberfläche

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

In vitro Überwachung des extrazellulären pH-Werts in Echtzeit

In vitro Überwachung des extrazellulären pH-Werts in Echtzeit

Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers in Milchsäurebakterien mit einem bioelektrochemischen System mit drei Elektroden und zwei Kammern

Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers in Milchsäurebakterien mit einem bioelektrochemischen System mit drei Elektroden und zwei Kammern

Charakterisierung des vermittelten extrazellulären Elektronentransfers in Milchsäurebakterien mit einem bioelektrochemischen System mit drei Elektroden und zwei Kammern

In-vitro-Kultivierung von Technologie, um den menschlichen Darm Microbiota studieren fortgeschrittene Anwendung

Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen

Messung von pH Vacuolar und Cytosolic