Dieses Protokoll verwendet hochauflösende Mikroskopie, insbesondere direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie, auch bekannt als dSTORM, um die Beugungsgrenze zu umgehen und EVs mit Nanometergenauigkeit in drei Dimensionen zu visualisieren. Ein bemerkenswerter Vorteil von dSTORM ist seine Fähigkeit, Partikel direkt unterhalb der Beugungsstufe des Lichts zu visualisieren, ohne die Schritte zu beschädigen, die die biochemische Natur des EV verändern. Viele evolutionär unterschiedliche Viren verwenden EV-Signale, daher kann dSTORM verwendet werden, um EVs für Krankheitsbiomarker und Progression zu charakterisieren sowie einzelne Viruspartikel wie SARS-CoV2 zu visualisieren. Beginnen Sie mit dem Platzieren von affinitätsgereinigten, extrazellulären Vesikeln oder EVs auf Glasboden-Mikrorutschen-Acht-Well-Platten in einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern und lassen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius an der Oberfläche haften.
Ohne die vorhandene Lösung von der Acht-Well-Platte zu entfernen, befestigen Sie EVs auf den Platten, indem Sie 200 Mikroliter 4% Paraformaldehyd in 1X PBS in die EV-haltige Lösung in jeder Vertiefung geben und die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Entfernen Sie Paraformaldehyd und überschüssige Lösung vorsichtig mit einer Mikropipette, um die EVs nicht zu stören. Waschen Sie das EV mit 1X PBS, um überschüssiges Paraformaldehyd zu entfernen.
Führen Sie den Waschvorgang dreimal durch. Entfernen Sie überschüssige 1X PBS. Bereiten Sie 250 Mikroliter dSTORM Bcubed-Pufferlösung pro Probe vor, indem Sie eine Lösung aus fünf Millimolarer protokatakräischer Dioxygenase erzeugen, die gemäß dem Protokoll des Herstellers in Bildpuffer verdünnt wird.
Fügen Sie 250 Mikroliter des vorbereiteten Puffers zu jeder Vertiefung gemäß dem Protokoll des Herstellers hinzu und inkubieren Sie die Platten für 20 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie sich vorstellen, um oxidierende Moleküle abzufangen. Die EVs können sofort visualisiert oder eine Woche lang bei vier Grad Celsius gelagert werden. Um die für die Kalibrierung des hochauflösenden Mikroskops erforderlichen Kügelchen vorzubereiten, verdünnen Sie 100-Nanometer-Mikrokugeln auf eine Konzentration von 0,5% in molekularbiologischem Wasser und pipettieren Sie 200 Mikroliter in jede Vertiefung einer Glasboden-, Mikrorutschen- und Acht-Well-Platte.
Lassen Sie die Perlen bei Raumtemperatur eine Stunde lang in den Vertiefungen absetzen. Ohne die vorhandene Lösung zu entfernen, geben Sie 200 Mikroliter 4% Paraformaldehyd in PBS zu jeder Vertiefung in die Kalibrierperlenlösung und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie das Paraformaldehyd vorsichtig mit einer Mikropipette, um die Perlen nicht zu stören, und waschen Sie die Perlen dreimal mit 1X PBS.
Bereiten Sie den Puffer wie im Manuskript beschrieben vor. Entfernen Sie 1X PBS und fügen Sie 250 Mikroliter des vorbereiteten Puffers zu jeder Vertiefung hinzu. Lassen Sie den Puffer vor der Visualisierung 20 Minuten ruhen.
Verwenden Sie die Taste Mikroskop anschließen, um eine Verbindung zum 3D-Mikroskop herzustellen, bevor Sie etwas auf die Bühne stellen. Fügen Sie dem Objektiv 100X Öl hinzu und platzieren Sie die Mitte des Bohrlochs auf dem Objektiv. Schalten Sie in der Einstellung Erfassen die 473- und 640-Nanometer-Anregungslaser ein und klicken Sie auf Ansicht.
Ohne das 3D-Objektiv zu aktivieren, können Sie die Perlen unter der Einstellung für die Photonensättigung anzeigen, indem Sie in den Bildanzeigeoptionen auf Photonenanzahl klicken. Stellen Sie die anfängliche Laserleistung auf 8,4 Milliwatt für den 473-Nanometer-Laser und 11,6 Milliwatt für den 640-Nanometer-Laser ein. Verringern Sie den Fokus des Lasers auf etwa minus 300 Nanometer oder die Brennebene der Kalibrierperlen, um eine klare Auflösung der einzelnen Kügelchen zu erzeugen.
Sobald die Z-Ebene fokussiert ist, passen Sie die Laserleistungspegel weiter an, um Schwankungen in jedem Sichtfeld zu berücksichtigen. Führen Sie unter den Gerätefunktionen die 3D-Mapping-Kalibrierung und die Kanal-Mapping-Kalibrierung durch, um die Fehler auf der X-, Y- und Z-Achse zu erhalten. Legen Sie die maximale Anzahl der Sichtfelder auf 20, die Zielanzahl der Punkte auf 4.000, den maximalen Abstand zwischen den Kanälen auf 5,0 Pixel und den Ausschlussradius zwischen den Kanälen auf 10,0 Pixel während der Kanalzuordnungskalibrierung fest.
Stellen Sie sicher, dass die Kalibrierung eine Punktabdeckung von mehr als 90 % und eine gute Mapping-Qualität liefert. Speichern Sie die angegebenen Kalibrierdaten für zukünftige Bildaufnahmen. Fügen Sie 100X Öl auf das Objektiv hinzu und legen Sie die vorbereiteten EVs auf das Mikroskop.
Ohne die 3D-Linse zu aktivieren, schalten Sie den 640-Nanometer-Anregungslaser ein und erhöhen Sie ihn zunächst auf 1,2 bis 12,5 Milliwatt, abhängig von der Intensität des Signals im Sichtfeld, um die rote Membran anzuregen, interkalierende, farbstoffgefärbte EVs. Wechseln Sie unter Bildanzeigeoptionen die Anzeigemethode von Photonensättigung zu Perzentilen, um die EVs besser zu visualisieren. Passen Sie die Laserleistung an, um das Rauschen zu minimieren und gleichzeitig das Signal zu maximieren und alle anderen Parameter beizubehalten.
Passen Sie den Fokus der Z-Ebene an, indem Sie auf das Aufwärts- oder Abwärtssymbol auf der Z-Achse klicken. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 Millisekunden, die Bildaufnahme auf 10.000 Bilder und die anfängliche Laserleistung auf 1,2 bis 12,5 Milliwatt ein, abhängig von der Intensität des Signals und dem Sichtfeld. Aktivieren Sie das 3D-Objektiv über das Symbol und starten Sie die Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche Erwerben klicken.
Erhöhen Sie während des gesamten Bildaufnahmeprozesses die Laserleistung um drei Schritte von 10 alle 1000 Frames oder genug, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufrechtzuerhalten. Stellen Sie die Z-Ebene während der Erfassung nicht ein. Wechseln Sie nach der Bildaufnahme zum Anzeigefenster Analysieren.
Führen Sie eine Driftkorrektur für das ungefilterte Bild durch, und aktivieren Sie dann Filter. Passen Sie photonenzahl, Lokalisierungsgenauigkeit, Sigmas und Rahmenindex an, wie im Manuskript erwähnt. Überlagern Sie ein X-, Y-, Z-Ebenen-Ansichtswerkzeug entlang der X-Achse einzelner EVs aus dem Sichtfeld und exportieren Sie die einzelnen CSV-Dateien von Photoswitching-Ereignissen.
Halbieren Sie einzelne EVs auf der X-, Y-Achse in einem X-by-Y-Sichtfeld mit einem Linienhistogramm-Werkzeug, das Fotoschaltereignisse in festgelegte Entfernungsgruppen einfügt. Nehmen Sie Bilder von einzelnen Elektrofahrzeugen auf und speichern Sie sie als tif-Dateien. Erstellen Sie 3D-Videos einzelner EVs mit einem 3D-Visualisierungswerkzeug und Farben entsprechend der Platzierung entlang der Z-Achse.
Nach der Kalibrierung des Mikroskops, das einen durchschnittlichen Fehler von 16 Nanometern auf der X-, Y-Achse und 38 Nanometern auf der Z-Achse ergab, wurden die gereinigten u20s-EVs erfolgreich mit einer Auflösung von bis zu 20 Nanometern auf der X-, Y-Achse und 50 Nanometern entlang der Z-Achse visualisiert. Einzelne EVs, die durch dSTORM in 3D-Fotos visualisiert wurden, die während der gesamten Belichtung mit 10.000 Bildern geschaltet wurden, als die Laserleistung erhöht wurde, und waren im aufgenommenen Bild leicht sichtbar. Die Bildkorrektur nach der Aufnahme in der Z-Ebene, Photonenzähler, Sigmas und Lokalisierungspräzision des rekonstruierten Bildes führten zu einer klaren Auflösung des EV in 3D.
Die EV-Fotos wurden nur während der ersten 7.000 Frames umgeschaltet, wie die Legende in der oberen rechten Ecke zeigt. Das Histogramm bestätigt, dass die Mehrheit der Photoschaltereignisse innerhalb eines Radius von 100 Nanometern stattfand, was bestätigt, dass das visualisierte EV ein Exosom ist und dass die Isolierung von EVs mit kleinem Durchmesser erfolgreich war. Die Größenverteilungsanalyse, die an anderen einzeln verfolgten Elektrofahrzeugen mit dem Linienhistogramm-Werkzeug und dem X-, Y-, Z-Ebene-Ansichtswerkzeug durchgeführt wurde, bestätigte, dass die meisten Photo-Schaltereignisse in einem Umkreis von 100 Nanometern um das Zentrum auftraten.
Der Fehler entlang der Z-Achse wurde erhöht, wodurch ein längliches Endbild des EV entlang der axialen Achse erzeugt wurde. Photoswitching-Ereignisse korrelierten nicht mit der EV-Größe, was zeigt, dass dSTORM-basierte Charakterisierung für kleine EVs wie Exosomen und kleine, behüllte Viren mit einem Durchmesser von weniger als 100 Nanometern verwendet werden kann. Während der Durchführung von dSTORM ist es wichtig, daran zu denken, die anfängliche Laserleistung sehr niedrig einzustellen und sie während der gesamten Bildaufnahme langsam zu erhöhen, um Photobleichen zu verhindern.
Seit seiner Entwicklung hat dSTORM es den Forschern ermöglicht, die Morphologie subzellulärer Strukturen besser zu verstehen, die aufgrund der Beugungsgrenze der typischen Lichtmikroskopie bisher nicht sichtbar waren.
