DIY kryogenen Rückholvorrichtung hatte im Laufe der Projekte &quot;Modellierung bakterieller Proteinprenylierung in eukaryotischen Zellen mit Hilfe der Bioinformatik und molekulare Ansätze&quot; von Mary Louise Andrews Award for Cancer Research Program, Virginia Akademie der Wissenschaften gefördert &quot;, physiologische Bedeutung von RNA-Editing in Plasma getestet Dendritische Zellen &quot;von The Thomas F. Jeffress und Kate Miller Jeffress Memorial Trust und Staatsvertrages 16.740.11.0364 (Ministerium für Wissenschaft und Bildung, Russland) gesponsert. Wir möchten Beth Eom für die Unterstützung bei der RNA-Integrität Experiment danken.

1. Versammlung der Cryotolerant Einrichtung zur Abfrage von Kryoboxen <ol><li> Mit einer Zange, entzerrt einer Seite des 3-seitig Strong-Tie (1A), um einem L-förmigen Strong-Tie in 1B gezeigt ist. Hinweis: Die Abmessungen der Strong-Tie kann in Abhängigkeit von dem Durchmesser des Halses des Dewar werden . </li><li> Befestigen Sie zwei so starke Bindungen zu einer-Strong-Tie Band T (Abbildung 2) mit GABELKOPFSCHRAUBE Mutter, Scheibe und Schraube, um die Basis zu bilden Cryoscoop wie in Abbildung 3 (AB) gezeigt. Hinweis: Zwei starke Bindungen werden zur Abfrage von ermöglichen 5 ½ Zoll x 5 ½ Zoll Cryoboxen. </li><li> Mit Hilfe eines geschlitzten Platte (Abb. 4), richten Sie die Steckplätze auf der Strong-Tie T Gurt mit den Schlitzen an einem Ende der geschlitzten Platte und sichern Sie die beiden zusammen mit Hilfe von Hillman Mutter und Schrauben (Abbildung 5). Hinweis: Wenn die geschlitzten Platte und die starke Bindung nicht zusammenmich mit vorgebohrten Löchern, müssen Sie haben Löcher gebohrt, mit Hartmetall-Bohrer. </li><li> Biegen des anderen Endes der Schlitzplatte mit Hilfe der Zange, so wie in 6 gezeigt. (Dieser Schritt ist optional). </li><li> Wickeln Sie den Griff mit Schaumstoff, besser begreifen, wenn das Gerät in flüssigem Stickstoff, wie in Abbildung 6 dargestellt. (Optional) Hinweis: Entfernen Sie den Schaum vor dem Autoklavieren. </li></ol> 2. Versammlung der Cryotolerant Einrichtung zur Abfrage von Kryoröhrchen Die Cryotolerant DIY Abruf kann auch für das Abrufen von Kryoröhrchen angepasst werden. Dabei ersetzt die flache Basis mit einem Sieb aus Edelstahl, wie gezeigt verändert für Aushöhlungen Fläschchen aus flüssigem Stickstoff (Abbildung 7). <ol><li> Lösen Sie die Krone Muttern und Bolzen Befestigung des Strong-Tie T Trageriemen an der geschlitzten Platte. </li><li> Vor dem Anbringen des Edelstahlsieb an der Schlitzplatte, sanft beugen den Halsdas Sieb mit Hilfe der Zange zu orientieren die Basis in einem Winkel zu einer Schöpfkelle (Abbildung 8) ähneln Hinweis: Wenn das Sieb kommt mit einer Lippen-, Zange verwenden, um die Lippe bücken, das macht das Manövrieren mit dem Gerät erleichtern.. </li><li> Richten Sie das Loch am Griff des Filters zusammen mit den Löchern auf der geschlitzten Platte und sichern Sie das Sieb mit Hilfe von Hillman Muttern und Schrauben wie in Abbildung 8 dargestellt. Hinweis: wenn das Sieb nicht mit vorgebohrten Löchern kommen, müssen Sie zu arrangieren, um Löcher mit Hartmetall-Bohrer gebohrt haben. </li></ol> 3. Abrufen und Kryoröhrchen Kryoboxen Von Dewar <ol><li> Um zu beginnen, auf Tieftemperatur-Handschuhe an und entfernen Sie 1 oder 2 Gefriergestelle aus dem Dewar, um Platz zum Manövrieren zu ermöglichen. </li><li> Vorsichtig entlang der Unterseite des Dewar mit dem aufrechten Cryotolerant DIY Rückholvorrichtung mit Strong-Tie T Gurt Basis (Abbildung 5) ausgerüstet kratzen und sammeln Sie die Box fallen auf den Boden des Tanks Dewar. Hinweis: Flüssiger Stickstoff siedet sofort bei Kontakt mit einer wärmeren Objekt, das Objekt in umhüllenden Isolierschicht Stickstoffgas (Leidenfrosteffekt). Um das Gerät vor zu kühlen, um Abrufen von Proben, langsam Tauchen Sie das Gerät in das Dewar und erlauben flüssigem Stickstoff, um das Gerät ausreichend abkühlen, bevor Sie mit dem obigen Schritt. </li><li> Ziehen Sie das Gerät aufrecht an den Wänden des Dewar, um die Tiefkühltruhe aus dem Tank zu schaufeln. </li><li> Besorgen Sie sich die Box aus dem Boden des Dewar abgerufen. </li><li> Zum Abrufen von Kryoröhrchen, sanft kratzen den Boden des Dewar mit dem cryoscoop mit einem Sieb (Abbildung 9) ausgestattet. </li><li> Ähnlich wie bei Kryobox Retrieval, ziehen Sie das Gerät aufrecht und ergreifen Sie die Fläschchen im Sieb aufgefangen. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Eine große Herausforderung in der Genexpression Studien ist, dass die Qualität der RNA von den Lagerbedingungen abhängigfür die beiden eingefrorenen Gewebeproben extrahiert und RNA-4. Abbildung 10 zeigt die Wirkung der Handhabung der Proben auf die Integrität von Gesamt-RNA. Gesamt-RNA aus dem gleichen Gewebe Quelle (menschliche Fettgewebe) wurde zu verschiedenen Probenhandhabung unterzogen. Vor dem Experiment zeigt intakte Gesamt-RNA-Präparat klar 28S und 18S rRNA-Banden mit der 28S-rRNA-Band etwa doppelt so intensiv wie die 18S-rRNA-Bande (Abbildung 10, Spur 1). Dieses Verhältnis von 2:1 (28S: 18S) ist ein Indiz dafür, dass die RNA intakt ist, während partiell abgebauten RNA erscheint als ein Abstrich oder seine 28S: 18S Intensitätsverhältnis fährt von 2.01 5. Lanes 3-4 zeigt RNA-Proben mit einem signifikanten Abbau. Diese RNA-Proben wurden wiederholt auftauen teilweise durch kurzfristige Abfragen im Dewar (Methode A) unterzogen, wodurch die Modellierung der Langzeitlagerung mit periodischen Dekantieren wegen Notwendigkeit der Rückholung der gefallenen Flaschen und Kisten (Abbildung 10, Lane 4.3 ). Allerdings Proben in Dewar gewartet gespeichertVerwendung DIY Vorrichtung (Verfahren B) und somit keine teilweise Abtauung enthalten intakte RNA (10, Spur 2). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> Abbildung 1. A) Die Bemessungsgrundlage besteht aus zwei 3-seitige Strong-Tie von Dimensionen gezeigt. Jeder Strong-Tie enthält eine große vorgebohrte Loch (durchgezogener Pfeil) und mehrere kleinere Löcher (kleiner Pfeil) auf jeder Seite. Dies bietet eine Option, damit die Befestigung mit Mutter und Bolzen. Auch die kleineren Löcher ermöglichen die schnelle Ableitung von flüssigem Stickstoff während Probe Abruf. B) Eine Seite von jedem der starken Bindung mit Hilfe einer Zange, um L-förmigen Strong-Tie gerichtet ist. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> 2. Strong-Tie T Riemen verwendet wird, um die starken-Bindungen aneinander zu befestigen. Wie Strong-Tie, hat T-Gurt ein großer vorgebohrte Loch (durchgezogener Pfeil) und zwei kleinere Löcher (small Pfeil) an jeder Ecke. Dies ermöglicht die Sicherung starke-ten entlang der Länge des T - Strap mit Muttern und Bolzen. Es ermöglicht auch Befestigungs-T-Gurt an den geschlitzten Platte. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> Abbildung 3. A) Jeder Strong-Tie wird an einer Ecke des T-Gurt befestigt, über seine Länge mit Krone Bolzen Muttern, Bolzen und Unterlegscheiben. B) Zwei starke-schaften sind benachbart aneinander befestigt werden, um abzurufen 5 ½ Zoll x 5 ½ in. Cryoboxen. Für kleinere Cryoboxen wie 2 Zoll x 2 Zoll, kann ein einzelner Strong-Tie direkt an die geschlitzte Platte befestigt werden, ohne eine T-Riemen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> Abbildung 4. Schlitz flache Platte als Griff dient. Länge der Schlitzplatte hängt von der Tiefe des Dewar. In diesem Fall wurde 4 Fuß von geschlitzten Platte verwendet. Die Dicke der geschlitzten Platte ist entscheidend, seit dünne geschlitzte Platten (&lt;14 Manometer) machen das Gerät fadenscheinigen beim Abrufen von Proben aus flüssigem Stickstoff gefüllten Dewar. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> Bild 5. Der flache Boden, bestehend aus starken Bindungen und T Gurt wird dann an einem Ende der geschlitzten Platte befestigt ist. Die größere Bohrung auf dem verbleibenden Ecke des T Gurt wird mit dem Schlitz auf der flachen Platte ausgerichtet und befestigt mit Hex-Schraube und Mutter. Dieses Gerät kann nun verwendet werden, um Cryoboxen von Dewar abzurufen. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> 6. Ein Ende des geschlitzten flachen Platte gebogen ist und mit einer Zange mit Schaum bedeckt besser zu greifen besonders bei tiefen Dewars, wie im vorliegenden Fall gezeigt wird. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> Abbildung 7. Schmutzfänger mit Drahtgitter und Edelstahl-Griffwird verwendet, um Kryoröhrchen von Dewar abzurufen. Wenn der Griff nicht mit einem Schlitz versehen ist, mit Hartmetall-Bit-Bohrer wird zum Bohren eines Lochs erforderlich. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> Abbildung 8. Um das Abrufen Kryoröhrchen zu erleichtern, ist Sieb entlang des Halses mit einer Zange zu Kelle geformten Sieb bekommen gebogen. Wenn Sieb mit Lippe wie in diesem Fall vorgesehen ist, kann Zangen verwendet werden, um es zu biegen. Dadurch wird sichergestellt, Sieb nicht innerhalb der Dewar verfangen. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> Abbildung 9. Schmutzfänger an den geschlitzten flache Platte an einem Ende befestigt mit Hex-Schraube und Mutter. <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> Abbildung 10. Die Integrität der Probe von Gesamt-RNA zu unterschiedlichen Umgang mit den Proben unterworfen. Um zu untersuchen, wie RNA-Qualität durch Probenhandhabung c ist betroffenie Bedingungen, wurde eine Reihe von RNA-Proben aus der gleichen Quelle zwei Methoden der Handhabungen unterworfen. Methode A bestand aus Lagerung von RNA in Dewar-Probe unterzogen, um Abfragen mit DIY-Gerät, damit kein teilweiser auftauen. Verfahren B aus der Lagerung von RNA in Dewar einer wiederholten teilweisen Abtauung durch kurzfristige Abfragen im Dewar, damit Modellierung Langzeitlagerung mit periodischen Dekantieren zum Abrufen gefallen Proben. Gesamt-RNA-Integrität wurde dann durch Gelelektrophorese analysiert. Lane1: Probe vor der Lagerung in Dewar, Spur 2: Probe von Dewar unterzogen, um den Abruf durch Methode A, Spur 3, 4: Probe von Dewar unterzogen, um den Abruf durch Methode B, M: 100 bp Leiter.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine der gängigsten Methoden zum Abrufen und Cryoboxen Kryoröhrchen aus dem Boden des Dewar-Tank ist in flüssigen Stickstoff in einen freien Behälter umfüllen und ziehen Sie die Proben im Kolben verbliebene oder schwebend in der dekantiert flüssigem Stickstoff. Dies ist jedoch eine unsichere Praxis, die kryogene Verbrennungen oder Erstickung durch längere Exposition gegenüber flüssigem Stickstoff 2 Dämpfe verursachen können. Andere gemeinsamen Weg bei der Abfrage von gefallenen Kryoröhrchen beinha...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Hillman-Gruppe überzog Schlitz Flache 1-3/8 x 4 Meter; 14 Gauge </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> N / A </td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> GABELKOPFSCHRAUBE Stainless Steel # 6 - 32 x 3/8 Zoll Oval Leiter Phillips Laufwerk Maschinenschraube </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model # 42281 </td><td> 4 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> GABELKOPFSCHRAUBE 3/8 Zoll x 1-1/2 Zoll Stahl verzinkt Fender Unterlegscheiben </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model # 20122 </td><td> 4 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> GABELKOPFSCHRAUBE verzinkt # 8-32 Maschinenschraube Nuss </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model # 18512 </td><td> 4 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie BC40Z 4 In.x4 in. halbe Basis </td><td> Lokale Hardwarebestellen </td><td> Model # BC40Z </td><td> 2 Stück erforderlich </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie 6 Zoll x 6 Zoll T Strap </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model # 66T </td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> Oneida 6 &quot;Mesh-Sieb </td><td> Lokale Geschäft </td><td> Model # 7859W </td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> Der Hillman Gruppe verzinkt Sechskantmuttern 3/8-16 </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td> Model #: 810509 </td><td> 6 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> Der Hillman Gruppe verzinkt Sechskantschrauben 3/8- 16 </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td></td><td> 4 Einheiten erforderlich </td></tr><tr><td> Schaum zur Dämmung </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td></td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> Schraubendreher </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td></td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr><tr><td> Zange </td><td> Lokalen Hardware-Shop </td><td></td><td> 1 Einheit erforderlich </td></tr></tbody></table>

do-it-yourself device for recovery of cryopreserved samples accidentally dropped into cryogenic storage tanks

Flüssiger Stickstoff ist farblos, geruchlos, extrem kalt (-196 ° C) Flüssigkeit unter Druck gehalten. Es wird allgemein als ein kryogenes Fluid für die langfristige Lagerung von biologischen Materialien wie Blut, Zellen und Geweben 1,2 verwendet. Die kryogene Natur des flüssigen Stickstoffs, während sich ideal für Probenkonservierung, kann dazu führen, schnelles Einfrieren von lebenden Gewebe in Berührung - bekannt als &quot;Kryo-burn&quot; 2, was zu schweren Erfrierungen in nahe stehende Personen in Ein-und Auslagerung von Proben aus Dewars beteiligt führen. Zusätzlich kann, wie flüssigem Stickstoff verdampft reduziert die Sauerstoffkonzentration in der Luft und kann dazu führen, Asphyxie, in geschlossenen Räumen, 2. In Labors werden biologische Proben oft in Kryoröhrchen Kryoboxen oder in Edelstahl-Racks in den Dewar-Tanks 1 gestapelt gelagert. Diese Regale sind mit einem langen Schaft zu Boxen Herausrutschen aus den Regalen zu verhindern und in den Boden zur Verfügung gestelltDewars während der routinemäßigen Handhabung. Allzu oft jedoch rutschen Kisten oder Flaschen mit wertvollen Proben heraus und sinken auf den Boden von flüssigem Stickstoff gefüllten Tank. In solchen Fällen könnten Proben mühsam nach der Übertragung des flüssigen Stickstoffs in einem freien Container oder verwerfen sie abgerufen werden. Die Kästen und Flaschen können dann relativ sicher von Dewar geleert erholt. Jedoch macht es die kälteerzeugenden von flüssigem Stickstoff und Expansionsrate versunkenen Probe Abruf gefährlich. Es wird allgemein von Sicherheit Büros empfohlen, die Probe Retrieval nie durchgeführt werden, indem eine einzelne Person. Eine weitere Alternative ist im Handel erhältlich kühlen Grabber oder Zange benutzen, sich aus der Fläschchen 3. Allerdings stellt eingeschränkter Sicht in den dunklen Flüssigkeit gefüllt Dewars eine große Einschränkung in ihrer Verwendung. In diesem Artikel beschreiben wir den Bau einer Cryotolerant DIY Rückholvorrichtung, die Probe macht Abruf von Dewar mit kryogenen Flüssigkeiten sowohl sicher als einND einfach.

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Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Hier präsentieren wir Ihnen eine kostengünstige, langlebige cryotolerant Gerät zur Probe Abruf von Dewar Tanks mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Die Einfachheit der Konstruktion und der modulare Aufbau des Gerätes macht den Prozess der Probe Abruf aus kryogenen Tanks sicher und einfach.

Do-It-Yourself Einrichtung zur Rückgewinnung von kryokonservierten Proben versehentlich fallengelassen in Kryo-Lagerbehälter

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

do-it-yourself-device-for-recovery-cryopreserved-samples-accidentally

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K Aufrufe.  George Mason University. Hier präsentieren wir Ihnen eine kostengünstige, langlebige cryotolerant Gerät zur Probe Abruf von Dewar Tanks mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Die Einfachheit der Konstruktion und der modulare Aufbau des Gerätes macht den Prozess der Probe Abruf aus kryogenen Tanks sicher und einfach.

Serie: Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Forschung

Biologie

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung mit Groove Patterns für ein Studium Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Ein Gradient-Erzeugung Mikrofluidikvorrichtung für Zellbiologie

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Testproben zur Optimierung STORM Super Resolution Mikroskopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Quasi-metagenomischen Analyse Salmonella aus Lebensmitteln und Umweltproben

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

Reproduktionstechniken für Diekarianüberwachung und -kontrolle bei Amphibien

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Kryogene Probenladung in ein magisches Winkel-Spinning-Kernspinresonanzspektrometer, das die Zelllebensfähigkeit bewahrt

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.