Die Citrus Forschung und Entwicklung Foundation für die Finanzierung anerkannt. Dank Engel Hoyte und Michael Flores für die Durchführung von Bioassays.

<ol><li> Montage einer speziell angefertigten, zwei Ports aufgeteilt T-Olfaktometer zuvor Mann et al. 10 ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Olfaktometer besteht aus einem 30 cm Glasröhre, die in zwei separate Anschlüsse mit einem Teflonband bilden ein T-Labyrinth gegabelt ist. Jede Hälfte ist analog zu einem Arm eines 2-Wahl Stil Olfaktometer ermöglicht die Testperson zwischen zwei möglichen Geruchs Felder auszuwählen. <ol><li> Montage und anschließende Tests sollten innerhalb einer temperierten Raum oder Klimakammer nehmen. </li><li> Mount Glas T-Labyrinth Olfaktometer vertikal, wie in Abbildung 1 dargestellt und positionieren Sie es unter einem Fluoreszenz-900 lux Glühbirne. </li><li> Für eine optimale Lichtstreuung, sollte die Montage in einem 1,0 x 0,6 montiert werden x 0,6 m undurchsichtigen Behälter einheitliche Lichtstreuung zu maximieren. </li><li> Schließen Sie die Olfaktometer Arme Geruch Quellen, die in fester Phase Micro-Extraktion Holding / Geruchsquelle chamb untergebracht werdener (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville) durch Teflon; Glasrohr-Anschlüsse. Jedes SPMEC aus einem geraden Glasrohr (17,5 cm lang x 3,5 cm breit) mit einem Einlass-und Auslassventil für ankommende und abgehende Luftströme (Abbildung 1) abgestützt besteht. </li><li> Verbinden der Luftzufuhreinrichtung mit einer externen Quelle des befeuchteten und Kohlenstoff-gereinigte Luft, die unter konstantem Druck (das Luftzuführungssystem hat sowohl eine interne Kohlefilter zur Luftreinigung und eine Luft Gasspüler zur Befeuchtung wenn anderen Quellen verfügbar sind) ist. </li><li> Lösen gewünschten chemischen Proben in geeigneten Verdünnungsmittel (Lösungsmittel) und Pipette auf eine langsame Freisetzung Substrat wie ein Baumwoll-Docht (Petty John Packaging, Inc., Concord, NC). Die Steuerung sollte die Behandlung eines Baumwolldocht mit Lösungsmittel nur imprägniert bestehen. </li><li> Um erhebliche Verschmutzung der Gläser verhindern, umhüllen die Behandlungs-und Kontrollgruppe Baumwolldochte im Labor Gewebe (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) und Platz in den beiden SPMEC Arme (ARS, Inc., Gainesville, FL). Im Fall von lebenden Pflanze Proben kann eine Guillotine flüchtigen Sammelkammer zum Olfaktometer enthaltenden Behandlungen anstelle des SPMEC (Abbildung 1) befestigt werden. </li><li> Liefern gereinigt und befeuchtete Luft durch das SPMEC (oder Guillotine flüchtigen Kammer) über zwei Pumpen, der mit einem Luftzuführungssystem (Abbildung 1). Pflegen Luftdurchsatz bei 0,1 L / min durch beide Arme des Olfaktometers. </li></ol></li><li> Verwendung Olfaktometer zur Arthropoden Reaktion auf putative Repellentien testen. In der vorliegenden Beschreibung wurde ein hemipteran Insekt, asiatische Zitrus psyllid, Diaphorina citri, als Test Arthropoden verwendet. Reaktion wurde Zitrus flüchtigen allein oder in Kombination mit einem Repellent (Dimethyldisulfid) und saubere Luft als Geruchsquellen getestet. <ol><li> Führe alle Experimente an einer standardisierten Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit. </li><li> Vor allen Tests Setzen test Probanden um Luft gegenüber reiner Luft oder Lösungsmittel gegenüber Reinluft im T-Labyrinth Olfaktometer reinigen, um die Abwesenheit von Positionsdaten Vorspannung oder eine Wirkung auf das Verhalten des Lösungsmittels der Testperson zu verifizieren. </li><li> Zuweisen einer Geruchsquelle zufällig einer der Arme des Olfaktometers zu Beginn eines jeden Bioassay. Rückwärts diese Position nach dem alle 10 Probanden untersucht, mindestens, um mögliche von Positionsdaten Bias zu beseitigen. </li><li> Testen des Ansprechens eines mindestens 30 (und bis zu 120) Probanden pro Behandlung Kombination. </li><li> Lassen Probanden 100-300 Sek. eine Verhaltensreaktion auf vorher festgelegten Reaktionszeit (Latenz) Intervalls aufweisen. </li><li> Rekord, wenn das Motiv in die Behandlung Arm, Querlenker oder bleibt in der Release-Port oder unter dem T-Labyrinth Division. </li><li> Note eine Behandlung oder Steuerarm Wahl, wenn ein Testsubjekt kreuzt die Teilung im T-Labyrinth und bewegt sich in beiden Olfaktometer Arm. </li><li> Note ein Lösearms Wahl, wenn ein Test sorbehaltlich verbleibt in der Öffnung für die Freisetzung oder unterhalb des T-Labyrinths Division. </li><li> Reinigen Sie die Olfaktometer und Verbindungsrohre gründlich mit 2% Seifenlösung und backen Sie die Komponenten aus Glas bei 200 ° F zwischen der Verwendung von unterschiedlichen Geruch Behandlungen. </li><li> Für Assays, in dem putativen Repellent Behandlungen im T-Labyrinth Olfaktometer mit oder ohne chemische Behandlung versus Reinluft präsentiert werden, zu vergleichen, die Anzahl der Testpersonen verbleibenden am Abwurfpunkt und nicht in die Olfaktometer zwischen Behandlungen durch Einweg-Varianzanalyse ( ANOVA) gefolgt von HSD-Test Tukey (α &lt;0,05). In Fällen, in denen die Probanden belassen Sie den Arm, vergleichen Sie die Anzahl der Wahl der Lenker gegenüber der Behandlung Arm mit Chi-Quadrat (χ 2) Analyse bei α &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

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Der Autor wurde mit Mitteln, die von der Citrus Forschung und Entwicklung Foundation bereitgestellt.

Geruchsstoffe an Hierin werden eine Testvorrichtung und Protokoll zum Messen der Antwort von kleinen Arthropoden (: Hemiptera Psyllidae Insecta) beschrieben. Das Verfahren beinhaltet eine Auswahl-Test, so dass das Insekt, eine Wahl zwischen zwei Feldern Odorans im Falle von Assays Auswerten eines putativen Lockstoff machen. Ferner kann die Testperson drei Arten von Verhaltensweisen, die von dem Verlassen des Lösearm und Eingeben entweder eines von zwei möglichen Geruchs Felder, oder Verbleiben in dem Lösearm, im Falle von Assays Abweisungsvermögen anzuzeigen. Das Olfaktometer ermöglicht hohen Durchsatz Datenerhebung, weil sie ausnutzt der negativen geotactic (Tendenz nach oben zu bewegen) und positive phototaktischen (Tendenz in Richtung Licht bewegen) natürliche Verhaltensreaktion vieler Arthropoden. Obwohl die vorliegende Demo verwendet ein psyllid Insekten-Test kann beispielsweise der Test leicht auf Arthropoden breit, angepasst sowohl diejenigen, die Flucht zu nutzen oder zu Fuß als vorherrschende Verkehrsträger. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Olfaktometer zum Messen der Reaktion der Insekten entwickelt wurden zunächst vor Jahrzehnten entwickelt und haben eine wichtige Rolle gespielt bei der Aufklärung Insekten Lockmittel und Repellentien 12. Die spezifischen Konstruktionen solcher Olfaktometer stark variieren, jedoch beschriebenen Variationen auf das allgemeine Thema des zweiteiligen Wahl Assay hier, wie auch, ähnlich Y-Schlauch Assays wurden oft verwendet, um ansprechend auf Arthropoden Chemikalien zu messen. Größere Flug Tunneln, die anhaltenden Flug der Insekten 9 verursachen auch in der Sammlung von wegweisenden Daten der Aufklärung der grundlegenden Mechanismen von Insekten Flug und Orientierung Semiochemikalien sowie Daten informieren praktischen Einsatz der Schädlingsbekämpfung Werkzeugen geführt. Es ist oft notwendig, um maßgeschneiderte Design ein Olfaktometer und zugehörigen Geräten für die Biologie des spezifischen Arthropoden Testperson. Jene, die unter Olfaktometer einer allgemeinen Gruppe von Insekten verwendet werden können, sind nützlicher als diejenigen specific auf eine kleine Gruppe, aber manchmal ist die wirtschaftliche Bedeutung einer kleinen Gruppe von Insekten diktiert die Notwendigkeit der Entwicklung einer ganz bestimmten Olfaktometer und Assay-Technik. Die aktuell beschriebenen Design baut auf bisher bekannten Arthropoden Techniken. Es ermöglicht eine Standard-Zwei-Wahl Assay als Y-Rohr Bioassays, in denen die experimentelle Arena oder Choice-Test nimmt die Form eines Y-förmigen Glas 7 auf. Typischerweise wird ein Arm eines derartigen Y-Rohr erhalten eine Behandlung Odorans, während die andere leer gelassen werden 13. Variationen solcher Olfaktometer kann Zugabe von mehreren Strahler-Arme 14 und sogar Zugabe eines Bodens Medium zur Untersuchung auf das Verhalten der Organismen Bewegen durch den Boden 15. Bei der Entwicklung solcher Olfaktometer und zugehörige Tests ist es wichtig zu prüfen, wie eng natürlichen Bedingungen repliziert werden und somit die wahre Bedeutung der untersuchten Verhaltensreaktionen in Bezug auf die Probanden Biologie. Zu einem large Grad, werden die erhobenen Daten nur so nützlich wie die Relevanz des Verhaltens Bioassay mit Bezug auf des Organismus Verhaltensökologie 16. Die aktuell beschriebenen Olfaktometer und Verhaltensstörungen Bioassay ist speziell für eine hemipteran Insekt, das die Flucht so kurz &quot;springt&quot; 16 zu initiieren tendiert konzipiert. Die vertikale Ausrichtung des Olfaktometer und die Lichtquelle Anordnung erleichtert die Einleitung Insekt Bewegung und damit eine nachfolgende chemisch-vermittelte Orientierungsverhalten kann getestet effizient und mit hoher Durchsatzleistung werden. Dieses Verhalten Assay Anordnung kann wahrscheinlich für eine breite Palette von Fliegen oder zu Fuß Arthropoden Taxa oder könnte auch leicht modifiziert werden, um die Notwendigkeit von Nicht-Arthropoden Organismen passen verwendet werden.

Arthropoden (einschließlich Insekten und Spinnentiere) werden oft als Schädlinge definiert, weil sie mit den menschlichen Verzehr entweder konkurrieren in landwirtschaftlichen oder städtischen Einstellungen oder übertragen kausalen Erreger der Krankheit ein. Eine große Menge an Investitionen in die Entwicklung von Instrumenten zur solche Schädlinge gemacht. Diese Tools können stark variieren und bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung biorational Werkzeugen, die entweder zu ändern oder zu nutzen das natürliche Verhalten von Schädlingen mit dem Einsatz von Behavioral Lockmittel oder Repellents 2,3 gemacht. Arthropodenschädlinge verlassen sich oft auf olfaktorische Signale oder Hinweise für die Partnerwahl und / oder Host-Standort 4. Deshalb Entdeckung wirksamer Lockmittel oder Repellents für Schädlinge oft zu Entwicklung von Steuerungs-Tools führen. Dieser Prozess der Entdeckung erfolgt in mehreren Schritten. Erstens muss das natürliche Verhalten des Probanden zu verstehen. Beispielsweise muss man feststellen, ob ein Geschlecht einer bestimmten Art die entgegengesetzte anziehtSex für Mate Lage. Wenn ja, muss festgestellt werden, ob diese durch eine chemische Anziehungskraft vermittelt wird und wo diese chemische hergestellt wird. Weitere Schritte umfassen die Bestimmung, wenn die chemische produziert wird und ihre letztendliche Identifizierung. In diesem Verfahren muss der Versuchsperson (Insekten oder Milben) Verhaltensreaktion auf Geruchsstoffe getestet werden. Anfänglich wird das Verhalten des Probanden zu dem natürlichen Material getestet werden. Zum Beispiel kann eine männliche Motten Antwort auf die der Extrakt seiner weiblichen Artgenossen die Pheromon Verschraubung überprüft werden. Alternativ kann ein Pflanzenfresser Antwort auf den natürlichen Gerüche von der Wirtspflanze getestet werden. Während diese Untersuchungen oft eine praktische Schwerpunkt auf der Entwicklung von Management-Tools 5,6 haben, können sie auch für die Forschung, die mehr grundlegende Fragen, wie Artbildung 7 Adressen angewendet werden. Nachfolgende Schritte beinhalten die Prüfung der Arthropoden Antwort auf synthetische Versionen von identifizierten natürlichen Produkten. Understanding wie Arthropoden Chemikalien reagieren erfordert die Entwicklung geeigneter Werkzeuge, um ihr Verhalten zu messen. Die Daten von diesen Tools generiert wird davon abhängen, wie gut die Forscher in der Lage, natürliche Verhaltensweisen in einer kontrollierten Umgebung zu messen. Mehr als sechs Jahrzehnte her, da waren anhaltenden Flug Olfaktometer und Tunnel entwickelt, um Insekten Reaktion auf Duftstoffe 8,9 messen. Olfaktometer erheblich variieren in Design und sind oft auf die spezifische Insekten oder Problem untersucht zugeschnitten. Das Ziel dieses Artikels ist es, das Design und die Verwendung von einem vertikal ausgerichteten, T-Labyrinth Olfaktometer zur Messung Insekten Reaktion auf Duftstoffe (Abbildung 1) zu beschreiben. Die Olfaktometer die vertikale Ausrichtung nutzt die negativen Geotaxis (Tendenz nach oben) von vielen Insekten ausgestellt. Eine Lichtquelle direkt oberhalb der Olfaktometer positioniert nutzt die positive Phototaxis (Neigung zur Lichtquelle hin bewegt) durch viele Insekten ausgestellt. Die olfactometer ist besonders nützlich für hemipteran Insekten, die nicht auf eine Bewegung ohne weiteres zeigen in horizontal orientierten Olfaktometer und die stark von Lichtintensität bezüglich Ausrichtung beeinflusst neigen. Jedoch kann diese Vorrichtung für eine Vielzahl von fliegenden und kriechenden Insekten, Spinnentieren sowie verwendet werden. Das Olfaktometer eingesetzt werden, um beide Lockmittel und Repellentien zu bewerten. Im Fall von Lockstoffen, wird der gegabelte Geruch Feld (Abbildung 1) mit dem putativen Lockstoff auf einer Seite gegenüber reiner Luft auf der gegenüberliegenden Seite freigesetzt sind etabliert. Eine Auswahl wird aufgezeichnet, wenn das Insekt an der Basis des Olfaktometers freigesetzt wählt eines der beiden Felder Geruch. Im Falle von Wirkstoffen, eine dritte Verhalten möglich. Neben Aufwärtsbewegung in einem der beiden Felder Geruch, mangelnde Aufwärtsbewegung aufgezeichnet, die eine nicht antwortende Stimulus oder abstoßenden Reiz entweder von Geruch Felder werden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name der Einrichtung </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Zwei-Port unterteilt T-Olfaktometer </td><td> Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> None (Custom made) </td><td> Falls diese nicht über ARS, Southern Scientific (Gainesville, FL) derzeit auch baut und vertreibt diese Geräte. </td></tr><tr><td> Solid-phase micro-Extraktion Holding / Geruchsquelle Kammer mit Teflon;-Glasrohr-Anschlüsse. </td><td> Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> RV-R3 </td><td> Siehe oben Kommentar </td></tr><tr><td> Luftzufuhrsystem </td><td> Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> HADS-2AFM2C.4 </td><td> Siehe oben Kommentar </td></tr><tr><td> Guillotine Kammer </td><td> Analytische Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL </td><td> L3GP3 </td><td> Siehe oben Kommentar </td></tr></tbody></table>

vertical t-maze choice assay for arthropod response to odorants

Angesichts der wirtschaftlichen Bedeutung der Insekten und Spinnentiere als Schädlinge von Nutzpflanzen, städtischen Umgebungen oder als Träger von Anlagen und menschliche Krankheiten werden verschiedene Technologien als Kontrollinstrumente entwickelt. Eine Teilmenge dieser Tools konzentriert sich auf Änderung des Verhaltens von Arthropoden durch Anziehung oder Abstoßung. Daher sind Arthropoden oft im Mittelpunkt von Verhaltens Untersuchungen. Diverse Tools wurden entwickelt, um Arthropoden Verhalten, einschließlich Windkanäle, Flug Mühlen, servospheres, und verschiedene Arten von Olfaktometer messen. Der Zweck dieser Werkzeuge ist zu Insekt oder arachnid Reaktion auf visuelle oder öfter Geruchssinn zu messen. Die vertikale T-Labyrinth oflactometer hier beschriebenen Maßnahmen Entscheidungen von Insekten in Reaktion auf Lockmittel oder Repellents durchgeführt. Es ist ein High Throughput-Assay-Gerät, das den Vorteil hat der positive Phototaxis (Anziehung zu hell) und negativen Geotaxis (Neigung zu laufen oder fliegen nach oben) von vielen Arthropoden ausgestellt. Die olfactometer besteht aus einer 30 cm Glasröhre, in der Hälfte mit einem Teflonband bilden ein T-Labyrinth wird geteilt. Jede Hälfte dient als Arm des Olfaktometer ermöglicht die Probanden die Wahl zwischen zwei möglichen Geruch Felder in Assays, die Lockstoffe machen. In Assays, die Abwehrmittel können Fehlen normaler Reaktion auf bekannte Lockstoffe auch als dritte Variable gemessen werden.

Attraktion des Asian Citrus psyllid (Diaphorina citri) Erwachsene zu den Gerüchen ihrer Geburt Wirtspflanze flüchtigen (Zitrusfrüchte) ist in 2A dargestellt. Signifikant (α &lt;0,05) mehr Erwachsene wählte den Arm des T-maze Olfaktometer empfangen Gerüche aus lebenden Zitruspflanzen wie mit einem leeren (saubere Luft) Kontrolle verglichen. Ein Beispiel für Abstoßung in 2B gezeigt. In diesem Fall wurden die Insekten an einem Arm des T-Labyrinths Empfangen Zitrus flüchtigen ausgesetzt, während der zweite Arm aus einem empfangenen flüchtigen Zitrus Pflanze, die mit dem bekannten Repellent, Dimethyldisulfid 11 behandelt wurde. In diesem Fall wurden drei Arten von Verhaltensweisen beobachtet. Die Anzahl der Psylliden am Lösearm verhaftet und reagiert nicht statistisch nicht unterschiedlich von der Anzahl der Eingabe des Arms Empfangen der Gerüche von Zitruspflanzen allein (2B). Allerdings haben keine Blattflöhe den Arm mit ter Wirtspflanze flüchtigen, wenn sie mit der abweisenden (2B) co-präsentiert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50229/50229fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der vertikal ausgerichteten T-Labyrinth Olfaktometer verbunden Luftzufuhrsystem und Geruch Behandlung Auslösevorrichtungen. Das Diagramm ist eine Adaption von Abbildung 1 in Mann et al. 10. Ein Prüfling wird einzeln in die Lösekammer des 2-Port geteilt T-Olfaktometer platziert. Es bewegt sich in Richtung der Gerüche durch ein Absperrventil, das bekämpft Aufwärtsbewegung gestattet in die Olfaktometer und verhindert das Insekt aus kriecht zurück in den Abwurfpunkt Bereich. Das Rohr gabelt 10 cm nach dem Tor Wert. Eine positive Reaktion auf einen Geruch wird erfasst, wenn das Insekt bewegt 0,5 cm in einer bestimmten Seite der Division. Büroschneidemaschine flüchtigen Sammelkammer kann anstelle eines Festkörper-PHAs eingesetzt werdene micro-Extraktion Holding / Geruchsquelle Kammer (SPMEC) als Geruchsquelle. <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50229/50229fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50229/50229fig2.jpg" /> Abbildung 2. Response of Asian Citrus psyllid (Diaphorina citri) Erwachsene flüchtigen aus Zitrusfrüchten Wirtspflanzen gegenüber Clean Air Control (A) oder Zitrus flüchtigen gegenüber Zitrusfrüchten flüchtigen mit einer Repellent (Dimethyldisulfid) co-released (B) in einer vertikal ausgerichteten T -maze Olfaktometer 2A:. Ein-Wege-Analyse der Varianz (ANOVA) gefolgt von HSD-Test Tukey (α &lt;0,05) gefolgt wurde durchgeführt, um die Anzahl der psyllid eine Wahl zwischen jedem Arm (2 Behandlungen, n = 120) zu vergleichen. Spalten durch verschiedene Buchstaben gekennzeichnet sind signifikant verschieden voneinander (α &lt;0,05) 2B:. Einfach analysist der Varianz (ANOVA) gefolgt von HSD-Test Tukey (α &lt;0,05) gefolgt wurde durchgeführt, um die Anzahl der psyllid eine Wahl zwischen entweder verbleibenden Arm oder im Freigabepunkt (3 Behandlungen, n = 120) zu vergleichen. Spalten durch verschiedene Buchstaben gekennzeichnet sind signifikant verschieden voneinander (α &lt;0,05).

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Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Eine vertikale, T-Labyrinth Olfaktometer wird zur Bestimmung des Verhaltens Reaktion der Arthropoden beschrieben. Das Olfaktometer ermöglicht der Experimentator, Entscheidungen von Versuchspersonen durchgeführt messen, wenn zwei potenzielle Geruch Feldern ausgesetzt. Beide Attraktion und Abstoßung von Geruchsstoffen kann mit diesem Gerät gemessen werden.

Vertical T-Labyrinth Wahl Assay für Gliederfüßer Response to Geruchsstoffe

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

vertical-t-maze-choice-assay-for-arthropod-response-to-odorants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Aufrufe.  University of Florida. Eine vertikale, T-Labyrinth Olfaktometer wird zur Bestimmung des Verhaltens Reaktion der Arthropoden beschrieben. Das Olfaktometer ermöglicht der Experimentator, Entscheidungen von Versuchspersonen durchgeführt messen, wenn zwei potenzielle Geruch Feldern ausgesetzt. Beide Attraktion und Abstoßung von Geruchsstoffen kann mit diesem Gerät gemessen werden.

Serie: Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

T-maze Forced Alternation and Left-right Discrimination Tasks for Assessing Working and Reference Memory in Mice

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in rodents. In our laboratory, we evaluated the two types of memory in more than 30 strains of genetically engineered mice using the automated version of this apparatus. Here, we present the modified T-maze apparatus operated by a computer with a video-tracking system and our protocols in a movie format. The T-maze apparatus consists of runways partitioned off by sliding doors that can automatically open downward, each with a start box, a T-shaped alley, two boxes with automatic pellet dispensers at one side of the box, and two L-shaped alleys. Each L-shaped alley is connected to the start box so that mice can return to the start box, which excludes the effects of experimenter handling on mouse behavior. This apparatus also has an advantage that in vivo microdialysis, in vivo electrophysiology, and optogenetics techniques can be performed during T-maze performance because the doors are designed to go down into the floor. In this movie article, we describe T-maze tasks using the automated apparatus and the T-maze performance of &alpha;-CaMKII+/- mice, which are reported to show working memory deficits in the eight-arm radial maze task. Our data indicated that &alpha;-CaMKII+/- mice showed a working memory deficit, but no impairment of reference memory, and are consistent with previous findings using the eight-arm radial maze task, which supports the validity of our protocol. In addition, our data indicate that mutants tended to exhibit reversal learning deficits, suggesting that &alpha;-CaMKII deficiency causes reduced behavioral flexibility. Thus, the T-maze test using the modified automatic apparatus is useful for assessing working and reference memory and behavioral flexibility in mice.

This article presents the protocol of T-maze tests using a modified automated apparatus for assessing the learning and memory functions in mice.

T-Labyrinth Erzwungener Wechsel und die Links-Rechts-Discrimination Aufgaben für die Beurteilung der Arbeitsbedingungen und Referenz-Gedächtnis bei Mäusen

Forced alternation and left-right discrimination tasks using the T-maze have been widely used to assess working and reference memory, respectively, in ...

Forschung

Neurowissenschaften

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). There are several behavioral mechanisms through which an insect learns salient associations and relates them to these events. It is important to understand this behavioral plasticity for programs aimed toward assisting insects that are beneficial for agriculture. This understanding can also be used for discovering solutions to biomedical and agricultural problems created by insects that act as disease vectors and pests. The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol was developed for honey bees (Apis mellifera) over 50 years ago to study how they perceive and learn about floral odors, which signal the nectar and pollen resources a colony needs for survival. The PER procedure provides a robust and easy-to-employ framework for studying several different ecologically relevant mechanisms of behavioral plasticity. It is easily adaptable for use with several other insect species and other behavioral reflexes. These protocols can be readily employed in conjunction with various means for monitoring neural activity in the CNS via electrophysiology or bioimaging, or for manipulating targeted neuromodulatory pathways. It is a robust assay for rapidly detecting sub-lethal effects on behavior caused by environmental stressors, toxins or pesticides.
We show how the PER protocol is straightforward to implement using two procedures. One is suitable as a laboratory exercise for students or for quick assays of the effect of an experimental treatment. The other provides more thorough control of variables, which is important for studies of behavioral conditioning. We show how several measures for the behavioral response ranging from binary yes/no to more continuous variable like latency and duration of proboscis extension can be used to test hypotheses. And, we discuss some pitfalls that researchers commonly encounter when they use the procedure for the first time.

The Proboscis Extension Response (PER) conditioning protocol, developed for the honey bee (Apis mellifera), provides an ecologically-relevant and easily quantifiable means for studying several different mechanisms of learning in many insect species.

Eine Nasennebenschutz-Protokoll für die Untersuchung Verhaltensplastizität bei Insekten: Anwendung auf Grund, Biomedizinische und Agrarforschung

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification (RFID) readers built into artificial flowers that display various visual cues, and RFID tags (i.e., passive transponders) glued to the thorax of bumblebee workers. The novelty in our implementation is that RFID readers are built directly into artificial flowers that are capable of displaying several distinct visual properties such as color, pattern type, spatial frequency (i.e., &#8220;busyness&#8221; of the pattern), and symmetry (spatial frequency and symmetry were not manipulated in this experiment). Additionally, these visual displays in conjunction with the automated systems are capable of recording unrewarded and untrained choice behavior. The second method consists of recording choice behavior at artificial flowers using motion-sensitive high-definition camcorders. Bumblebees have number tags glued to their thoraces for unique identification. The advantage in this implementation over RFID is that in addition to observing landing behavior, alternate measures of preference such as hovering and antennation may also be observed. Both automation methods increase experimental control, and internal validity by allowing larger scale studies that take into account individual differences. External validity is also improved because bees can freely enter and exit the testing environment without constraints such as the availability of a research assistant on-site. Compared to human observation in real time, the automated methods are more cost-effective and possibly less error-prone.

This video describes Radio-Frequency Identification (RFID) and motion-sensitive video recording methods to monitor choice behavior by bumblebees.

Radio Frequency Identification und bewegungssensitiven Video effizient zu automatisieren Aufnahme von unbelohnt Wahlverhalten von Hummeln

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

Elektrophysiologische Aufzeichnung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Trichoid Sensilla in Reaktion auf Odoranten der niedrigen Volatilität

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Tracking von Drosophila Larven Verhalten als Reaktion auf optogenetische Stimulation der olfaktorischen Neuronen

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

Eine Hochdurchsatz-Kalzium-Flux-Assay, NMDA-Rezeptoren mit Sensibilität für Glycin/D-Serin und Glutamat zu studieren

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as visually evoked potentials (VEPs) or somatosensory evoked potentials (SEPs), the auditory evoked potentials (AEPs) are triggered by the repetitive presentation of identical stimuli, the electroencephalographic (EEG) response of which is subsequently averaged resulting in distinct positive (p) and negative (n) deflections. In humans, both the amplitude and the latency of individual peaks can be used to characterize alterations in synchronization and conduction velocity in the underlying neuronal circuitries. Importantly, AEPs are also applied in basic and preclinical science to identify and characterize the auditory function in pharmacological and genetic animal models. Even more, animal models in combination with pharmacological testing are utilized to investigate for potential benefits in the treatment of sensorineural hearing loss (e.g., age- or noise-induced hearing deficits). Here we provide a detailed and integrative description of how to record auditory brainstem-evoked responses (ABRs) in mice using click and tone-burst application. A specific focus of this protocol is on pre-experimental animal housing, anesthesia, ABR recording, ABR filtering processes, automated wavelet-based amplitude growth function analysis, and latency detection.

Brainstem evoked response audiometry is an important tool in clinical neurophysiology. Nowadays, brainstem evoked response audiometry is also applied in the basic science and preclinical studies involving both pharmacological and genetic animal models. Here we provide a detailed description of how auditory brainstem responses can be successfully recorded and analyzed in mice.

Datenerfassung und -analyse in Brainstem Evokierte Reaktion Audiometrie bei Mäusen

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...