Dieses Projekt war die Unterstützung teilweise durch Johns Hopkins University, Büro des Provost durch die Gateway-Initiative Wissenschaft im Dialog und Qiagen Inc.

Einleitung: Eine einzelne Bakterienkolonien sollte verwendet werden, um einen geeigneten Kulturmedium, das über Nacht inkubiert impfen werden. Eine bakterielle Pellet wird dann verarbeitet, um genomische DNA unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen genomischen Isolierungskit reinigen. Das gereinigte genomische DNA sollte einen 260/280 (nm)-Verhältnis&gt; 1.8, um sicherzustellen, dass die Probe frei von Protein-Kontamination ist. Die Menge an genomischer DNA zur Erzeugung des Pyrosequenzierungs Schablone erforderlich ist 10-20 ng. A. Amplifikation der Template (PyroMark PCR Handbook; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / Handbücher</a> 1) Einrichten der PCR-Reaktion Hinweis: Eine Grundierung muss an seinem 5&#39;-Ende biotinyliert werden, und es wird empfohlen, dass es HPLC gereinigt werden für die Template Vorbereitung. Wir empfehlen die PyroMark Assay-Design Software 2.0 für PCR und seSequenz Primer-Design, die für kurz-Lese-Sequenzierung optimiert sind, jedoch Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> Dose) von NCBI auch für die Primer-Design verwendet werden. <ol><li> Tauen Sie alle erforderlichen Lösungen (aufgeführt in Tabelle 1) und mischen Sie gründlich. Richten Sie die Reaktion gemäß Tabelle 1. Alle Arbeiten können bei Raumtemperatur durchgeführt werden. </li></ol> Hinweis: Die PCR Master Mix enthält MgCl 2 für eine endgültige Konzentration von 1,5 mM, die zufriedenstellende Ergebnisse liefert in den meisten Fällen. Wenn eine höhere Mg 2 +-Konzentration benötigt wird, kann bis zu 3,5 ul 25 mM MgCl 2 zu einer Reaktion zugegeben werden. <ol start="2"><li> Mischen Sie die Reaktion Mischung durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren, dann verzichtet werden entsprechende Volumina in PCR-Röhrchen. </li><li> In template DNA zu jedem PCR-Röhrchen. Wir empfehlen 10 ng genomischer DNA. </li><li> Programmieren Sie den Thermocycler gemäß Tabelle 2. Eine abschließende Halten bei 4 ° C wird der Einfachheit halber empfohlen. Wenn Sie einen Thermocycler ohne beheizte Deckel Reaktionen Overlay mit 100 ul Mineralöl. </li><li> Legen Sie die PCR-Röhrchen in den Cycler und starten Sie das Programm. </li></ol> B. Vacuum Workstation Protocol Immobilisierung des biotinylierten PCR-Produkte <ol><li> Machen Sie einen Master-Mix nach Abbildung 4. </li></ol> Hinweis: Vor dem Pipettieren, schütteln die Flasche Streptavidinbeschichteten Sepharosekügelchen um eine homogene Suspension zu gewährleisten. <ol start="2"><li> Abhängig vom Volumen des PCR-Produkts verwendet wird, verzichtet 60-75 ul Master-Mix in jede Vertiefung einer PCR-Platte, um ein Gesamtvolumen von 80 ul pro Vertiefung geben. </li><li> In 5-20 ul biotinylierten PCR-Produkt in jede Vertiefung. </li><li> Verschließen Sie die Vertiefungen mit Streifen ca.ps und rühren die PCR-Platte bei 1.400 rpm für 5-10 min bei Raumtemperatur (15-25 ° C) mit einem Schüttler. </li></ol> Denaturierung von DNA und Zugabe von Sequenzierungsprimer <ol><li> Verdünnen Sie die Sequenzierungsprimern bis 0,3 um mit Annealingpuffer und verzichten 25 ul in jede Vertiefung einer Reaktion Platte. Positionieren Sie die Platte auf der Arbeitsstation. </li><li> Füllen Sie die Workstation Mulden nach der Abbildung 5 Diagramm. </li><li> Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, und stellen Sie sicher, dass der Schalter auf der Vakuum-Werkzeug, um auf (Abbildung 6). Spülen Sie die Filter-Sonden mit hochreinem Wasser (Milli-Q 18,2 MW x cm oder gleichwertig) in Wanne 5 (Abbildung 5). Füllen Sie die Wanne mit frischem hochreinem Wasser für die Verwendung in Schritt 12. </li><li> Arbeiten schnell, positionieren Sie den PCR-Platte mit Perlen auf der Arbeitsstation. Stellen Sie sicher, dass die beiden Platten in der gleichen Richtung sind, wenn die Proben geladen. </li><li> Mit dem Vakuum-Schalter ON, senken das VakuumWerkzeug in die Vertiefungen des PCR-Platte für 20 Sekunden oder bis alle Volumen wurde abgesaugt. Die Perlen werden durch das Vakuum-Werkzeug (Abb. 7) erfasst werden. </li><li> Mit dem Vakuum noch auf, spülen Sie das Tool mit 70% Ethanol (Trog 1) für 20 Sekunden oder bis alle Volumen wurde abgesaugt. </li><li> Mit Vakuum-ON, spülen Sie das Werkzeug mit Denaturierungslösung (Wanne 2) für 20 sec oder bis alle Volumen wurde abgesaugt. </li></ol> Hinweis: Die Denaturierungsreagenz enthält Natriumhydroxid, das eine Auge und Haut reizend ist. Tragen Sie immer einen Kittel, Handschuhe und Schutzbrille tragen. <ol start="8"><li> Mit Vakuum-ON, spülen Sie das Tool mit Waschpuffer (Trog 3) für 20 sec oder bis alle Volumen wurde abgesaugt. </li><li> Mit Vakuum-ON, heben Sie den Vakuum-Tool, über 90 ° vertikal für 5 Sekunden, damit alle Flüssigkeit abtropfen aus dem Vakuum-Tool. Schalten Sie die Pumpe AUS, und richten Sie die Vakuum-Tool mit der Reaktion Platte. Senken Sie den Vakuum-Werkzeug in derBrunnen und sanft hin und her zu schütteln, um die Kügelchen in die Vertiefungen, die Sequenzierungsprimer freizugeben. </li><li> Um das Vakuum Werkzeug reinigen, schüttelt die Filter Sonden in Reinstwasser (Wanne 4) für 10 Sekunden. </li><li> Schalten Sie das Vakuum ON und spülen Sie das Tool mit hochreinem Wasser (Wanne 5) für 20 sec oder bis alle Volumen angesaugt worden ist. </li><li> Heben Sie das Vakuum Werkzeug, um mehr als 90 ° C für 5 sec vertikal, dann schalten Sie das Vakuum ab und lagern in der &quot;Parking&quot;-Position. </li></ol> Glühen Sequenzierungsprimer um DNA-Stränge <ol><li> Legen Sie die Reaktion Platte in einer vorgewärmten Platte Inhaber. </li><li> Anschließend wird die Platte auf einem Heizblock bei 80 ° C für 2 min. </li><li> Entfernen Sie die Platte aus der Halterung und auf dem Zähler bei Raumtemperatur für 5 min abkühlen. </li></ol> PyroMark Q24 Betrieb Hinweis: Schalten Sie das Gerät über den Netzschalter über das Netzkabel entfernt. Sterntup kann bis zu 1 min. <ol><li> Füllen Sie eine Patrone gemäß den Anweisungen in der PyroMark Gold-Q24 Reagenzien Handbook 2 vorgesehen. Um Volumina benötigt, bis eine run-Datei in der Gerätesoftware eingestellt zu bestimmen, und unter dem Menü Extras wählen Pre Run Informationen </li><li> Wenn das Gerät bereits auf, sicherzustellen, dass sie nicht auf der Bühne einen Lauf und dann den Deckel öffnen. Ein akustisches Warnsignal wird ausgegeben, wenn der Deckel geöffnet wird, wenn es nicht sicher ist, dies zu tun. </li><li> Öffnen Sie die Patrone Gate und setzen Sie die Patrone mit dem Etikett nach vorne (Abbildung 8). Stellen Sie sicher, dass die Patrone richtig eingelegt ist (eine Linie sichtbar sein soll an der Front) und schließen Sie die Tür. </li><li> Öffnen Sie die Platte-Halterahmen und positionieren Sie die Platte mit Proben im Inneren des Gerätes. </li><li> Schließen Sie die Platte-Halterahmen und das Instrument Deckel (Abbildung 9). </li></ol> Ab einen Lauf <ol><li> Stecken Sie den USB-Stick mit dem run-Dateis erstellt mit der Gerätesoftware in den USB-Port an der Vorderseite des Gerätes. </li><li> Wählen Sie &quot;Ausführen&quot; im Hauptmenü und drücken Sie &quot;OK&quot;. </li><li> Verwenden Sie die Scroll-Pfeile, um die gewünschte Datei auszuwählen run und drücken Sie &quot;Select&quot;. </li></ol> Hinweis: Das Gerät beginnt Abgabe Reagenzien, wenn alle vorgegebenen Druck-und Temperaturniveaus erreicht werden (dies kann einige Minuten dauern). Während eines Laufs, zeigt das Gerät den Bildschirm des ausgewählten Pyrogramm auch in Echtzeit. Verwenden Sie die Scroll-Pfeile, um die Pyrogramm anderer Brunnen zu sehen. Abschließen einer run <ol><li> Wenn das Instrument bestätigt, dass der Lauf beendet ist und die run-Datei auf USB-Stick gespeichert wurden, drücken Sie auf &quot;Schließen&quot;. </li><li> Entfernen Sie den USB-Stick. Wenn es entfernt wurde, bevor der Lauf beendet ist, stecken Sie den USB-Stick. Wählen Sie &quot;Verwaltung&quot; und dann &quot;Copy gespeicherte Runs&quot;. </li><li> Die run-Datei kann nun geöffnet und analysiert werden mit der Gerätesoftware und verglichenzu einer Bibliothek von bekannten Mikroben mit der Identifire Software. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel von der Firma Qiagen gesponsert. Autoren Ahmed, Durocher, Jessen und Vardi sind Mitarbeiter von Qiagen Inc., die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet produziert.

Mehrere neue Next Generation Sequencing Methoden wurden kommerzialisiert. Drei der am häufigsten verwendeten Methoden sind Ionen-Halbleiter-Sequenzierung, einzelnes Molekül Echtzeit-Sequenzierung und Sequenzierung durch Synthese (SBS). 3-11 Jede dieser Methoden hängt Sequenzierung durch Synthese, sondern beschäftigen neuartige Plattformen für den Nachweis der eingebauten Nukleotide. In Ion Halbleiter-Sequenzierung, dient ein einzelner DNA-Strang als Vorlage für die Sequenzierung Strang. Polymerase und 12 Nukleotide nacheinander wie in pyrosequencing aufgenommen. Wenn ein Nukleotid auf die wachsende DNA-Strang hinzugefügt wird, wird ein Wasserstoffion freigegeben. Die Wasserstoffionenkonzentration wird durch einen Feldeffekttransistor Basis erfasst. Einzel-Molekül Echtzeit-Sequenzierung abhängig von der Null-Modus Wellenleiter (ZMW). 13 Die ZMW ist eine kleine Struktur, wo ein einzelnes Molekül der Polymerase Boden des Schachtes befestigt ist. Es wird in einer solchen Weise, dass ein Flore beleuchtetDuft-Molekül erkannt werden können. Jedes Nukleotid mit einem fluoreszierenden Molekül markiert. Als fluoreszierend markierten Nukleotid eingebaut identifiziert ein Detektor die Nukleotidsequenz. Wenn die nächste Nukleotid hinzugefügt wird, wird das fluoreszierende Molekül abgespalten. 14 Sequenzierung durch Synthese (SBS) nutzt eine einzigartige Methode zur Amplifikation der Ziel-DNA, so dass Cluster einzigartige Sequenzen erzeugt werden. 15 Einzel-Matrizen erzeugt werden und dann der komplementäre Strang synthetisiert wird. Jedes Nukleotid mit einem fluoreszierenden Molekül markiert ist und nach jeder Basenzugabe die Fluoreszenz des zugesetzten Base wird aufgezeichnet.

Pyrosequencing ist eine schnelle und genaue Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der &quot;Sequenzierung durch Synthese&quot; basiert. &quot;Sequenzierung durch Synthese&quot; beinhaltet die Verwendung einer Einzelstrang-DNA-Vorlage, um den komplementären Strang einer Basisstation zu einer Zeit zu synthetisieren, und Erfassen der eingebaute Base (A, T, G oder C) bei jedem Schritt durch die Erfassung eines Chemilumineszenz-Signals. Die Reaktion umfasst Pyrosequenzierungs Matrizen-DNA, dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferin, Luciferase und Apyrase. Die Synthesereaktion wird durch die Zugabe von einer der vier dNTPs und DNA-Polymerase an den biotinylierten einzelsträngigen Matrizen-DNA initiiert. DNA-Polymerase enthält die komplementären dNTP auf die Schablone, mit der anschließenden Freisetzung von Pyrophosphat (Abbildung 1). ATP Sulfurylase anteilig wandelt das Pyrophosphat zu ATP. ATP wirkt als Katalysator für die Luciferase vermittelte Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin, dasLicht erzeugt (Abbildung 2). Die Intensität des Lichts ist proportional zu der Anzahl von Nucleotiden enthalten und bestimmt, ob ein oder mehrere spezifische dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP oder) ist auf dem Template-Strang sequentiell (Abbildung 3). Jede unincorporated dNTP abgebaut Apyrase vor der Zugabe der nächsten dNTP für die Fortsetzung der Synthesereaktion. Dieses &quot;Sequenzierung durch Synthese&quot; Reaktion wird unter Zusatz von jedem der vier dNTPs wiederholt, bis die DNA-Sequenz der einzelsträngigen DNA-Matrize bestimmt. Um eine Animation der Pyrosequencing Reaktion sehen <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> .

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies zu identifizieren, zu unterscheiden und zu erkennen Bakterienstämme genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. Die Vorteile für die Mikrobiologie Pyrosequenzierungs Anwendungen sind schnelle und zuverlässige Hochdurchsatz-Screening und genaue Identifizierung der Mikroorganismen und mikrobielle Genmutationen. Pyrosequencing betrifft die Sequenzierung von DNA durch Synthetisieren des komplementären Strangs einer einzigen Basisstation zu einer Zeit, bei der Ermittlung der spezifischen Nukleotids während der Synthesereaktion eingearbeitet. Die Reaktion erfolgt an immobilisierten einzelsträngigen Matrizen-DNA, wo die vier Desoxyribonukleotide (dNTP) nacheinander zugegeben und nicht-eingebauten dNTPs enzymatisch abgebaut werden vor der Zugabe der nächsten dNTP der Synthesereaktion. Nachweis der spezifischen Base in der Vorlage enthalten ist durch Erzeugung chemilum überwachtinescent Signale. Die Reihenfolge der dNTPs, die die Chemilumineszenz zu erzeugen bestimmt die DNA Sequenz der Matrize. Die Echtzeit-Sequenzierung Fähigkeit Pyrosequenzierungstechnologie ermöglicht eine schnelle Identifizierung von Mikroorganismen in einem einzigen Assay. Darüber hinaus ist die Pyrosequencing Instrument, analysieren die volle genetische Vielfalt der antimikrobiellen Resistenzen, einschließlich Typisierung von SNPs, Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und sowie Quantifizierung mehrerer Genkopien, die in irgendeiner Antibiotikaresistenz auftreten können Mustern.

Die Ergebnisse eines typischen pyrosequencing Lauf mit der Software zeigt die Lage der Vorwärts-und Rückwärtsprimer Amplikons für Generation verwendet wird, und der Sequenzierungsprimer die pyrosequencing Reaktion innerhalb der 16S ribosomalen Sequenz (10). Die hypervariable Sequenz zwischen dem Primer Verbindungsstellen ermöglicht Identifizierung von Bakterien aus einer Vielzahl von Bakterienarten mit dem konservierten Sequenzierung (5&#39;-TACATGCAAGTCGA). Als interne Qualitätskontrolle, die DNA-Sequenz Klammerung der variable Bereich überprüft werden, um sicherzustellen, dass die korrekte DNA-Bereich analysiert wurde . Die Pyrosequenzierungs Software ermöglicht den Vergleich und Ausrichtung der erzeugten Sequenz in einer internen Datenbank der bakteriellen ribosomalen Sequenzen für Identifizierung von Bakterien. Darüber hinaus kann eine zu analysierende Sequenz von Mutationen, die Antibiotikum-Resistenz verleihen bestimmen. Beispielsweise Analyse von Mutationen in der 23S ribosomalen Gene HelicobActer pylori zeigt zwei Mutationsmuster (GAA oder AGA), die Antibiotika-Resistenz (Abbildung 11). Die Analyse der verschiedenen Isolate vom gleichen Patienten können gleichzeitig getestet werden, um die Entstehung von Resistenzen im Laufe der Zeit in epidemiologischen Untersuchungen von Resistenzen gegen antimikrobielle Arzneimittel Ausbrüche helfen zu verfolgen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Abbildung 1. Biotinylierte PCR-Produkt wird als Vorlage dNTPs durch DNA-Polymerase enthalten, was zur Erzeugung von Pyrophosphat (PPi) verwendet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Abbildung 2. ATP Sulfurylase anteilig wandelt Pyrophosphat zu ATP. ATP wirkt als Katalysator für die Luciferase-vermittelte Umwandlung von Luciferin zu Oxyluciferin, das Licht, das Pro ist erzeugtproportional zu der Menge an ATP. Das Licht wird als Höhepunkt am Pyrogramm Trace aufgezeichnet und zeigt Nucleotideinbaus. Nicht-eingebauten dNTPs abgebaut von Apyrase, bevor die nächste dNTP für die Fortsetzung der Synthese zugegeben wird. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die Intensität des Lichts generiert wird, wenn eine oder mehrere spezifische dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP oder) auf dem Template-Strang eingebaut wurde nacheinander. <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Abbildung 4. Ablaufschema für die Vorbereitung der Master-Mix, um die biotinylierten PCR-Produkt zu fixieren. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;always&quot;&gt; Abbildung 5. PyroMark Workstation mit PCR-Platte, Platte PyroMark und Trog Standorten. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> Abbildung 6. Standorte der Vakuum-Schalter ON und OFF Positionen. <img alt="Abbildung 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Abbildung 7. Vacuum-Tool. Richtige Handhabung der Vakuum-Tool. <img alt="Fig. 8" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Abbildung 8. Cartridge Tor geöffnet mit Patrone im Ort. <img alt="Abbildung 9" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> Abbildung 9. Cartridge richtig eingesetzt mit geschlossenem Tor. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> Abbildung 10. Pyrosequencing basierte Identifizierung von Bakterien führt. PCR-Primer für konservierte Regionen der DNA-Matrize ausgebildet ist und der Sequenzierprimer unmittelbar stromaufwärts eines gut charakterisierten Identifizierung hypervariablen DNA-Sequenz innerhalb des Amplikons (blau) angeordnet ist. <img alt="Abbildung 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> Abbildung 11. Nachweis von Antibiotika-Resistenzen in Helicobacter pylori mit pyrosequencing. Analyse von Mutationen in den Genen, die 23S antibakterielle Resistenz in Helicobacter pylori mit GAA oder AGA-Sequenzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Komponente </td><td> Volumen pro Reaktion </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12,5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> CoralLoad Konzentrat, 10x </td><td> 2,5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl 2 (optional) </td><td> Variable </td><td> ≥ 1,5 mM </td></tr><tr><td> Q-Lösung, 5x (optional) </td><td> 5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A / B Primer </td><td> Variable / Variable </td><td> 0,2 μM/0.2 uM </td></tr><tr><td> RNase-freies Wasser </td><td> Variable </td><td> - </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen (nach Zugabe von DNA) </td><td> 25 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. PCR-Reaktionsgemisch. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Zusätzliche Kommentare </td></tr><tr><td> Initial PCR Aktivierung Schritt </td><td> 15 min </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA Polymerase aktiviert </td></tr><tr><td> 3 Schritt Radfahren: Denaturierung </td><td> 30 sec </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Glühen </td><td> 30 sec </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Für genomische DNA Für Bisulfit-konvertierter DNA </td></tr><tr><td> Erweiterung </td><td> 30 sec </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Anzahl der Zyklen </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Abschließende Verlängerung </td><td> 10 min </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2. PCR-Zyklus Spezifikationen.

Watch this Scientific Journal Video about Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization at JoVE.com

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies identifizieren, diskriminieren Bakterienstämme und erkennen genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. In diesem Video, wird das Verfahren für die mikrobielle Amplikon Generation Amplikon pyrosequencing und DNA-Sequenzanalyse nachgewiesen werden.

Pyrosequencing für Mikrobielle Identifizierung und Charakterisierung

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

pyrosequencing-for-microbial-identification-and-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

46.9K Aufrufe.  Johns Hopkins University. Pyrosequencing ist eine vielseitige Technik, die mikrobielle Genom-Sequenzierung, die verwendet werden, um bakterielle Spezies identifizieren, diskriminieren Bakterienstämme und erkennen genetische Mutationen, die eine Resistenz gegen antimikrobielle Mittel werden erleichtert. In diesem Video, wird das Verfahren für die mikrobielle Amplikon Generation Amplikon pyrosequencing und DNA-Sequenzanalyse nachgewiesen werden.

Serie: Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Mikrobielle Gemeinschaften in Natur und Labor - Interview

Forschung

Biologie

Biology of Microbial Communities  - Interview

Biologie mikrobieller Gemeinschaften - Interview

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Pflanzenanalysen Promoter: Identifizierung und Charakterisierung der Root Knoten bestimmten Promoter in die Gartenbohne

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as regulators of various biological processes. Notably, emerging evidence demonstrates that host circRNAs can be differentially expressed (DE) upon infection with&#160;pathogens (e.g., influenza and coronaviruses), suggesting a role for circRNAs in regulating host innate immune responses. However, investigations on the role of circRNAs during pathogenic infections are limited by the knowledge and skills required to carry out the necessary bioinformatic analysis to identify DE circRNAs from RNA sequencing (RNA-seq) data. Bioinformatics prediction and identification of circRNAs is crucial before any verification, and functional studies using costly and time-consuming wet-lab techniques. To solve this issue, a step-by-step protocol of in silico prediction and characterization of circRNAs using RNA-seq data is provided in this manuscript. The protocol can be divided into four steps: 1) Prediction and quantification of DE circRNAs via the CIRIquant pipeline; 2) Annotation via circBase and characterization of DE circRNAs; 3) CircRNA-miRNA interaction prediction through Circr pipeline; 4) functional enrichment analysis of circRNA parental genes using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). This pipeline will be useful in driving future in vitro and in vivo research to further unravel the role of circRNAs in host-pathogen interactions.

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

The protocol submitted here explains the complete in silico pipeline needed to predict and functionally characterize circRNAs from RNA-sequencing transcriptome data studying host-pathogen interactions.

In Silico Identifizierung und Charakterisierung von circRNAs während Wirt-Pathogen-Interaktionen

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...