Die Autoren bedanken sich bei Chiyoko Kobayashi und Kiyokazu Agata für hilfreiche Tipps Planarie Transplantation sowie ehemaligen und derzeitigen Mitarbeitern des Labors Sánchez bedanken für wertvolle Diskussionen während der Entwicklung dieser Techniken. Diese Arbeit wurde vom NIH Training Grant (5T32 HD0791) zu OCG und NIH R37GM057260 zu ASS unterstützt. ASA ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.

Hinweis: Dieses Protokoll legt die Verwendung potenziell gefährlicher Stoffe (Blei und Chloreton). Zu erwerben, lesen und befolgen Sie die Sicherheitsdatenblätter für alle potenziell gefährlichen Materialien. 1. Tierische Kultur, Auswahl, Vorbereitung und <ol><li> Für Tiere Kultur und Handling Einsatz Planarie Wasser (1X Montjuïc Salze 9) und Kunststoff Transferpipetten. </li><li> Sexuelle Biotyp Schmidtea mediterranea kann verwendet werden, wenn im Labor unter normalen Kulturbedingungen 10 angehoben werden. Um ungeschlechtliche Exemplare der erforderlichen Größe zu erzeugen, S. mediterranea angehoben bei Raumtemperatur unter normalen Bedingungen bei 9 Doppel sollte auf dreifache normale Frequenz (2-3 mal pro Woche) werden für ein bis zwei Monate vor der Verwendung zugeführt. Alternativ kann asexuellen Tiere bei normaler Frequenz gespeist bei 10 Grad Celsius auf unbestimmte Zeit aufbewahrt werden, um ihre durchschnittliche Größe zu erhöhen. </li><li> Wählen Tieren, die zwischen 1 bis 2 cm im sindLänge und breiter als 2 mm und dann verhungern Tieren 3-7 Tage vor der Verwendung. </li><li> Wenn Sie bei sämtlichen pharmakologischen oder radiologischen Behandlungen auf Gastgeber bestimmt, Spender, oder teilweise bestrahlten Tiere, führen Behandlung (en) an dieser Stelle. </li><li> Wenn pharmakologische Behandlungen wurden durchgeführt, dass die Fütterung der Tiere erforderlich ist, verhungern Tiere zusätzlich 3 bis 7 Tage vor dem Gebrauch. </li></ol> 2. Herstellung von Lösungen und Materialien <ol><li> Planen Chloreton Lösung, eine milde lokale Anästhetikum, durch Auflösen von 0,1-0,2% w / v Chloreton in Planarie Wasser und Kühlen der Lösung auf Eis. </li><li> Wenn die Ausführung partieller Bestrahlung nur, fahren Sie mit Schritt 2,7. Für Gewebetransplantation weiter auf 2,3 fort. </li><li> Mit einem Brenner, biegen 0,75 mm Innendurchmesser, zum Schneiden des Transplantatgewebe verwendet, und 0,7 mm Außendurchmesser, zum Erstellen eines Loches in dem Host, die das Transplantat, eine Kapillare nach einem 90 °-Winkel 1-2 cm erhalten verwendet vom Ende des STch Rohr. Um Material zu sparen, biegen die beiden Enden jedes Kapillarrohr und brechen sie in eineinhalb bis zwei Werkzeuge zu produzieren. Darauf achten, dass die Flamme sehr Enden der Röhren. </li><li> Schneiden Sie die folgenden Papiere zu den angegebenen Größen: <ul><li> Schwarz Filterpapier (Schnitt in Rechtecke ca. 2,5 cm x 1,5 cm) </li><li> Whatman # 3 Filterpapier (Schnitt in Rechtecke ca. 2 cm. X 0,5 cm) </li><li> Kimwipe (gefaltet und geschnitten in wads ca. 3 cm x 0,5 cm x 4 Lagen) </li><li> Zigaretten Zigarettenpapier (entfernen Gummistreifen und in Rechtecke schneiden ca. 3 cm x 2 cm) </li></ul></li><li> Bereiten geändert Holtfreter-Lösung (3,5 g / l NaCl, 0,2 g / l NaHCO 3, 0,05 g / l KCl, 0,2 g / l MgSO 4, 0,1 g / l CaCl 2, pH 7,0 bis 7,5) und Kasein-Lösung gesättigt Holtfreter und Chill sowohl auf 4 ° C </li><li> Bringen Sie einen gefalteten Kimwipe zu einem Quadrat von Parafilm und findet am Peltier-Kühler Platte oder andere Kühlvorrichtung unter einem Binokular entfernt. Tränken Sie das Kimwipe mit gekühltem Holtfreter-Lösung und Platz zwei schwarze Rechtecke Filterpapier auf dem Kimwipe. </li><li> Line-Petrischalen mit Whatman Nr. 2 Filterpapier. Befeuchten Sie das Filterpapier mit Holtfreter-Lösung und chillen das Geschirr auf dem Eis. Für partielle Bestrahlung eine größere Schüssel und Filterpapier Liner verwendet werden. </li></ol> 3. Betäubung und Ruhigstellung <ol><li> Füllen Sie eine Petrischale mit gekühltem Chloreton Lösung und Würmer Pipette in die Schüssel. Für die Transplantation nur betäuben einem Host und einem Spender zu einer Zeit. Für partielle Bestrahlung viele (n&gt; 10) Tiere können narkotisiert auf einmal. </li><li> Erlauben Sie Würmer in der Chloreton Lösung einweichen, bis sie bewegungslos geworden (5-10 min). </li><li> Spülen Würmer durch Pipettieren sie in eine Schüssel mit kaltem Holtfreter-Lösung gefüllt. </li><li> Immobilisieren Tiere durch Pipettieren sie auf schwarzen Filterpapier mit gekühltem Holtfreter-Lösung und orientieren sie Bauchseite nach unten mit einer Pinzette gesättigt. Wenn Tiere in der Lage, locOmote, aufsaugen überschüssige Holtfreter-Lösung, leicht sinken die Temperatur Ihres Peltier oder kalte Platte, oder erhöhen Sie die Länge der Chloreton Behandlung. </li></ol> 4. Partielle Bestrahlung Hinweis: Befolgen Sie diese Schritte, um Tiere für die partielle Bestrahlung vorzubereiten. Wenn die Durchführung der Transplantation statt, § 5 fortfahren. <ol><li> Legen Sie eine gekühlte Petrischale aus Schritt 2,7 auf Eis in einem Eiskübel, die innerhalb einer Top-Quelle Röntgen-Strahler passen. </li><li> Anordnen betäubten Tieren in einer Petrischale durch Bewegen des schwarzen Filter, auf dem sie immobilisiert sind. Mit einer Pinzette an narkotisierten Würmer direkt bewegen kann verletzen. </li><li> Transport angeordnet Tieren zu einer oberen Source-X-ray-Strahler und den Eisbehälter anzuordnen, so dass der Abstand von der Kathodenstrahlröhre zu den Tieren minimiert wird und somit eine maximale effektive Dosis Rate. </li><li> Bleiabschirmung Position (en) (1) zwischen den Tieren und der Kathode tube wie gewünscht. Shields sollte 4,5 bis 6 mm dick ist, um für 97 bis 99% Dämpfung eines 325kV Röntgenstrahl 11 zu erlauben sein. </li><li> Deliver Röntgendosis. Wenn eine vollständige Ablation von Stammzellen nicht abgeschirmten Bereiche gewünscht wird, liefert 30 Gy oder mehr unter Verwendung einer Röntgen-Strahler. Als Referenz ist 30 Gy entsprechend 3,6 Minuten bei 320 Kilovolt und 10 Milliampere in einem Präzisions-X-Ray Inc. XRAD320 mit einer Feld-zu-Source-Abstand von 30 cm. </li><li> Unmittelbar nach der Anwendung abgeschlossen ist, Umgang mit Würmern durch den schwarzen Filterpapier, Transfer Tiere in ein gekühltes Wasser Planarien. Lassen Sie den Planarien Wasser auf Raumtemperatur erwärmt und die Tiere, um sich vor dem schwarzen Filterpapier entfernen. Die partielle Bestrahlung Verfahren ist nun abgeschlossen. </li></ol> 5. Gewebetransplantation <ol><li> Mit einer Pipette und Pinzette, arrangieren narkotisierten Gastgeber und Spender Würmer auf separaten Rechtecke aus schwarzem Filterpapier auf dem Kimwipe, die auf der Pelti abgekühlt worden istER oder kühlere Platte unter dem Binokular. </li><li> Mit Hilfe eines 0,75 mm Innendurchmesser Kapillarrohr schneiden Sie den Stecker aus der Transplantat-Donor und, mit einer Pinzette, legen Sie es auf einem aus dem Weg, Teil des Host. Wenn Transplantatmaterial im Kapillarrohr stecken bleibt, mit einer Pinzette entfernen. </li><li> Mit einem 0,7 mm Außendurchmesser Kapillarrohr Entfernen eines Plug vom Host und mit einer Pinzette Position das Transplantat in das Loch, das zurückgelassen wird. </li><li> Übertragen Sie die transplantierten Gastgeber auf seine schwarzen Filterpapier Rechteck in der Petrischale in Schritt 2,7 vorbereitet. </li><li> Befeuchten Sie ein Stück Zigarettenpapier mit Kasein gesättigten Holtfreter-Lösung und setzen Sie ihn auf der transplantierten Host wie in 2A diagramed. </li><li> Weichen Sie vier Stücke von Filterpapier in Casein gesättigt Holtfreter-Lösung und umhüllen den transplantierten Host wie in 2B diagramed. </li><li> Einweichen vier Bündel von Schnitt Kimwipe in Kasein-Lösung gesättigt Holtfreter und legt sie überdas Filterpapier aus Schritt 5.6 (2B). Setzen Sie den Deckel und setzen Sie die Petrischale auf Eis. </li><li> Übertragen Sie die Spender Wurm in Planarie Wasser zu erholen, zu heilen und zu regenerieren. </li><li> Wenn alle Transplantationen vorgenommen haben, setzen Sie die transplantierten Würmer in ein 10 ° C Inkubator über Nacht. </li><li> Am nächsten Morgen, dabei nicht zu stören, das Transplantat, den Wurm zu entdecken und zu übertragen (auf der schwarzen Filterpapier) in eine Petrischale mit Planarien Wasser gefüllt. </li><li> Entweder kann der Wurm, sich von dem Filterpapier entfernen oder entfernen Sie diese vorsichtig mit einer Pinzette. </li><li> Ändern Sie den Planarien Wasser alle 2-3 Tage. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Unmittelbar nach partieller Bestrahlung Planarien erscheint normal und unberührt. Je nach der abgegebenen Dosis und der Geometrie der Abschirmung verwendet wird, kann bestrahlten Gewebes zurückbilden und sogar zerfallen 7. Abgeschirmte Gewebe sollte intakt bleiben. Follaufgrund Gewebe Regression und ein Verlust von Gewebe Integrität wird ein Blastem bilden und fehlende Strukturen wird regeneriert (Abbildung 3A) werden. Wenn eine Amputation in der teilweise bestrahlten Bereich gemacht wird, wird das bestrahlte Gewebe befreit (dh aus der Regression oder Zerkleinern verhindert) werden (3B). Sowohl in der unverletzten und der Fall amputiert Regeneration verzögert, um eine Amputation nicht bestrahlte Planarien (3C) verglichen werden. Wenn ein X-ray Dosis von 30 Gy wurde geliefert, und der teilweise bestrahlten Tier unverletzt, erfolgreiche Stammzelltransplantation Ablation in einem Muster entsprechend mit der Abschirmung der verwendet wird, bestätigt 2 bis 3 Tage nach der teilweisen kann Bestrahlung durch in situ Hybridisierung für die Stammzellen Marker Smed-Piwi-1-12 (aka smedwi-1) (Abbildung 4). Der Morgen nach der Transplantation, ein erfolgreicher Transplantat des transplantierten Gewebes sollte offensichtlich sein, wnnerhalb die Wirtsgewebe, wobei auf beiden den dorsalen und ventralen Oberflächen der Host (5A) angeklebt ist. Gelegentlich wird das Transplantat nur der ventralen oder dorsalen Oberfläche haften. Wenn die Transplantation war völlig erfolglos, wird keine Spur von dem Transplantat aus sichtbar sein entweder der dorsalen oder ventralen Oberfläche des Wirtes (Abbildung 5B). Kurz nach einem erfolgreichen Transplantat nicht bestrahlten Gewebe in einem Wirt, die von Stammzellen durch eine tödliche Bestrahlung 13,14 hatte abgetragen in situ Hybridisierung für Smed-piwi-1 zeigen, dass Stammzellen vorhanden sind in erster Linie in dem Transplantat (5C ). Darüber hinaus wird eine erfolgreiche Transplantate von nicht-bestrahlten Gewebe in letal bestrahlten Hosts in Rettung von Wirtsgewebe und langfristige Überleben der Host 15 führen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeine Anordnung der Basiskomponentes für partielles Bestrahlen. In einer Röntgen-Strahler mit einer oben liegenden Röntgenquelle (Kathodenstrahlröhre) die anästhesiert Planarie ist direkt unter der Röntgenquelle im Bestrahlungsfeld positioniert. Um die Röntgendosis zu maximieren, sollte der Abstand zwischen der Planarie und der Röntgenquelle minimiert werden. Eine Abschirmung der sollte zwischen der Kathodenstrahlröhre und dem anästhesierten Wurm, möglichst nahe an der Schnecke als praktische positioniert werden. Die Bleiabschirmung sollte so ausgelegt, hergestellt, und so positioniert, dass sie das gewünschte Gewebe schirmt aber völlig aussetzt der Rest des Wurms. Viele kommerzielle produziert werden benutzerdefinierte Blei schirmt Ihr schlichtes Design aus Diagramm zu erzeugen, haben wir erfolgreich Alpha Systems Corp (Bluffdale, UT) verwendet. Die Zuleitung sollte ausreichend dick sein, um die gewünschte Menge der Abschirmung ermöglicht. Zum Beispiel, wenn nahezu vollständige Abschirmung eines 320 kV Röntgenstrahlung gewünscht wird, sollte der Vorsprung von 4,5 bis 6 mm dick sein. Die Planarien und Schirm auf positionierteines Holtfreter getränkte Filterpapier ausgekleidet Petrischale, die in einem Eiskübel ruht. Bei einem ausreichend großen Röntgenbestrahlung sowie eine Reihe von identischen Blei Schilde können viele Proben teilweise zu einer Zeit (nicht abgebildet) bestrahlt werden. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig2.jpg" /> Abbildung 2. Building the Recovery Kammer. (A) Eine Explosionsdarstellung der Gewebetransplantation Erholung Kammer und zeigt alle Komponenten, die auf-einander, nachdem sie in Casein gesättigt Holtfreter Lösung getränkt geschichtet sind. (B) A fast abgeschlossen Erholung Kammer, welche die Verzahnung Platzierung des Whatman # 3 Filterpapier Rechtecke, die fest umklammern Sie die narkotisierten Planarien, um eine Bewegung während der Heilung. Die sorgfältige Konstruktion der Erholung Kammer verhindert, dass Bewegung für Tiere und Austrocknung, rasche Heilung zu fördern und eine größere Wirksamkeit der Gewebetransplantation. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig3.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse der einfachen hinteren Teil Bestrahlung. Als Dubois 7, (A), wenn die hintere Hälfte der Planarien mit Blei geschützt waren und dann Röntgenbestrahlung ausgesetzt die vordere Gewebe beobachtet wieder zurückbilden an der Grenze zwischen dem bestrahlten und abgeschirmte Gewebe, an welcher Stelle unpigmentierten Blasteme gebildet und die Tiere begannen sich zu regenerieren. (B) Auf der anderen Seite, wenn die Tiere nach dem gleichen partielle Bestrahlung in (A), Gewebe-Regression wurde nicht beobachtet und die verbleibenden bestrahlten vorderen Gewebe gerettet wurde durchgeführt wurden enthauptet. Die bestrahlten Tiere geköpft teilweise regeneriert Köpfe (B), wurde jedoch erheblich verzögert die Regeneration zu unbestrahlten Kontrollen enthaupteten (C) verglichen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig4.jpg" /> Abbildung 4. Vertreter outcomich von partiellen Stammzell-Ablation nach partieller Bestrahlung. Whole-mount in situ Hybridisierung (WISH) für die Stammzell-Marker Smed-Piwi-1 zeigt, dass Wildtyp Planarien haben Stammzellen in ihrem Körper mit Ausnahme des Gewebes ventral des verteilten Photorezeptoren (Pfeilspitze) und des Rachens richtige (Sternchen) 14. (A) für Smed-Piwi-1 WISH in bestrahlten, aber vollständig abgeschirmt Kontrolle Planarien fixiert 3 Tage nach der Bestrahlung zeigt eine Stammzell-Distribution, die nicht von der der Wildtyp Planarien ist. (B) Auf der anderen Seite, wünschen Smed-piwi-1 in Tieren, die nur teilweise abgeschirmt wurden, so dass die vorderen und hinteren ausgesetzt, sondern sich auch fixiert drei Tage nach der Bestrahlung zeigt, dass Stammzellen von den nicht abgeschirmten Bereiche abgetragen . Scale-Bars sind 500 Mikrometer. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig5.jpg" /> Abbildung 5. Examples von erfolgreichen und nicht erfolgreichen Gewebetransplantation. (A) Live-Bilder von dorsalen und ventralen Ansichten eines erfolgreich transplantiert Planarie drei Tage nach der Transplantation. Das Transplantat (angezeigt) ist deutlich sichtbar auf beiden dorsalen und ventralen Oberflächen und ist mit charakteristischen unpigmentierten Gewebe an der Graft-Host-Schnittstelle umgeben. (B) entsprechend anzuzeigen erfolglosen Transplantationen keine sichtbare Transplantat Gewebe an der Stelle der Transplantation (angedeutet) und stattdessen eine vernarbte, unpigmentierten, seitliche Wunde aus der gescheiterten Transplantation. Ein Transplantat, das nur den dorsalen oder ventralen Oberfläche haftet kann eine erfolgreiche Transplantation (A) von einer Seite und einem erfolglosen Transplantation (B) betrachtet, wenn von der anderen angesehen ähneln. (C) Beim Wildtyp (wt) in einem bestrahlten Gewebe-Host, der ansässigen Stammzellen und den transplantierten Stammzellen wurde abgetragen wird aufgepfropft werden später durch WISH für Smed-Piwi-1 zwei Tage nach der Transplantation zeigten,Der Erfolg der Transplantation ist eindeutig durch die Gegenwart von spezifischen Stammzellen nur in oder um das Transplantat Lage (Pfeilspitzen) angezeigt. Scale-Bars sind 500 Mikrometer.

<ol>
	<li>Morgan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata.">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch. Entw. Mech. Org. 7, 364-397 .</li><li>Reddien, P. W., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+planarian+regeneration.">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li><li>Randolph, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regeneration+of+the+tail+in+lumbriculus.">The regeneration of the tail in lumbriculus.</a> J. Morphol. 7, 317-344 .</li><li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration.">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li><li>Santos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transplantation+in+planaria.">Studies on transplantation in planaria.</a> Biological Bulletin. 57, 188-197 (1929).</li><li>Morgan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+grafted+pieces+of+planarians.">Regeneration of grafted pieces of planarians.</a> J. Exp. Zo&#246;l. 3, 269-294 (1906).</li><li>Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+&#225;+l+'&#232;tude+de+la+migration+des+cellules+de+règènèration+chez+les+Planaires+dulcicoles.">Contribution &#225; l '&#232;tude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles.</a> Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).</li><li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays.">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).</li><li>Cebria, F., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+homologs+of+netrin+and+netrin+receptor+are+required+for+proper+regeneration+of+the+central+nervous+system+and+the+maintenance+of+nervous+system+architecture.">Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture.</a> Development. , 132-3691 (2005).</li><li>Newmark, P. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+specifically+labels+the+regenerative+stem+cells+of+planarians.">Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians.</a> Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).</li><li>Miller, W., Kennedy, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+attenuation+in+lead,+aluminum,+and+concrete+in+the+range+275+to+525+kilovolts.">X-ray attenuation in lead, aluminum, and concrete in the range 275 to 525 kilovolts.</a> Radiology. 65, 920-925 (1955).</li><li>Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians.">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li><li>Hayashi, T., Asami, M., Higuchi, S., Shibata, N., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+planarian+X-ray-sensitive+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of planarian X-ray-sensitive stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Dev. Growth Differ. 48, 371-380 (2006).</li><li>Reddien, P. W., Oviedo, N. J., Jennings, J. R., Jenkin, J. C., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMEDWI-2+is+a+PIWI-like+protein+that+regulates+planarian+stem+cells.">SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells.</a> Science. 310, 1327-1330 (2005).</li><li>St&#233;phan-Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+cellules+de+r&#233;g&#233;n&#233;ration+chez+la+planaire+Dendrocoleum+lacteum.">Les cellules de r&#233;g&#233;n&#233;ration chez la planaire Dendrocoleum lacteum.</a> Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).</li><li>Gurley, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+secreted+Wnt+pathway+components+reveals+unexpected+complexity+of+the+planarian+amputation+response.">Expression of secreted Wnt pathway components reveals unexpected complexity of the planarian amputation response.</a> Dev. Biol. 347, 24-39 (2010).</li><li>Salvetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cell+plasticity:+neoblast+repopulation+in+non-lethally+irradiated+planarians.">Adult stem cell plasticity: neoblast repopulation in non-lethally irradiated planarians.</a> Dev. Biol. 328, 305-314 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Bedeutung der Immobilisierung Immobilisierung ist bei weitem der wichtigste Schritt für den erfolgreichen Abschluss nach einem dieser Verfahren. Wenn Planarien unsachgemäß immobilisiert sind vor partielle Bestrahlung, können sie unter der Bleiabschirmung bewegen, Herstellung inkonsistent und verwirrende Ergebnisse. Außerdem, wenn Tiere nach der Transplantation nicht ausreichend immobilisiert werden, wird die Host-Wurm wahrscheinlich weg von dem Transplantat Gewebe, was zu einem Versage...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> General Purpose Transferpipette </td><td> Samco </td><td> 691 </td></tr><tr><td> Kapillarröhrchen (ID 0,75 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-30-0 </td></tr><tr><td> Kapillarröhrchen (OD 0,7 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-50-08 </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> VWR </td><td> 52858-076 </td></tr><tr><td> Kimwipes 34155 </td><td> VWR </td><td> 500029-891 </td></tr><tr><td> Schwarzes Filtrierpapier </td><td> Schleicher &amp; Schuell </td><td> 10310809 </td></tr><tr><td> Whatman Nr. 2 Filterpapier 1002-055 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-810B </td></tr><tr><td> Whatman # 3 Filterpapier 1003-185 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-820E </td></tr><tr><td> Zigaretten Zigarettenpapier </td><td> Zig-Zag, original </td><td> NA </td></tr><tr><td> PetriGeschirr </td><td> VWR </td><td> 82050-544 </td></tr><tr><td> DUMONT Pinzetten, INOX # 5 </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td></tr><tr><td> Chloreton </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 112054 </td></tr><tr><td> Kasein </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C3400 </td></tr><tr><td> Lead-Shields </td><td> Alpha Systems Corp, Bluffdale, UT </td><td> Custom Design </td></tr><tr><td> XRAD-320 Biologische Irradiator </td><td> Präzisions-X-Ray, North Branford, CT </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation

Die Planarien, ein Süßwasser-Plattwurm, hat sich als ein leistungsstarkes System zum Präparieren Metazoen Regeneration und Stammzellbiologie 1,2 sein. Planarien Regeneration jedes fehlende oder beschädigte Gewebe wird möglich bezeichnet Neoblasten 3 von adulten Stammzellen. Obwohl diese Stammzellen endgültig gezeigt haben, dass pluripotente und einzigartig in der Lage eine komplette Wiederherstellung Tier 4, bleiben die Heterogenität innerhalb des Stammzell-Population und der Dynamik ihrer zellulären Verhaltensweisen weitgehend ungelöst. Aufgrund der großen Anzahl und Verbreitung von Stammzellen im gesamten Körper Planarie Plan, werden fortgeschrittene Methoden zur Manipulation von Subpopulationen von Stammzellen für die molekulare und funktionelle Studien in vivo benötigt. Gewebetransplantation und partielle Bestrahlung gibt zwei Methoden, mit denen eine Subpopulation von Planarien Stammzellen für die weitere Untersuchung isoliert werden kann. Jede Technik hat deutliche Vorteile. TAusgabe der Transplantation ermöglicht die Einführung von Stammzellen in einem naiven Host, die entweder inhärent genetisch verschieden sind oder die zuvor behandelten pharmakologisch. Alternativ können partielle Bestrahlung zur Isolierung von Stammzellen aus dem Host, um Gewebe nebeneinander frei von Stammzellen, ohne die Einführung einer Wunde oder einer Verschlusses in Gewebeintegrität. Mit diesen beiden Methoden kann man untersuchen die Zelle autonomen und nicht autonomen Faktoren, die Kontrolle Stammzell-Funktionen, wie Proliferation, Differenzierung und Migration. Sowohl Gewebetransplantation 5,6 und partielle Bestrahlung 7 wurden in der Vergangenheit bei der Definition viele der Fragen zu Planarie Regeneration, die unter-Studie noch heute verwendet. Allerdings sind diese Techniken blieb wegen der aufwendigen und unzuverlässigen Natur von den bisherigen Methoden nur unzureichend genutzt. Die hier vorgestellten Protokolle stellen einen großen Schritt vorwärts bei der Verringerung der Zeit einND Aufwand notwendig, um reproduzierbar erzeugen eine große Anzahl von aufgepfropft oder teilweise bestrahlten Tiere mit Wirkungsgraden von ca. 100 Prozent. Wir decken die Kultur der großen Tiere, Ruhigstellung, Vorbereitung für die partielle Bestrahlung, Gewebetransplantation, sowie die Optimierung von Tier Erholung. Darüber hinaus zeigt die hier beschriebene Arbeit die erste Anwendung der partiellen Bestrahlung Verfahren zur Verwendung mit den am häufigsten untersuchten Planarien, Schmidtea mediterranea. Außerdem öffnet effiziente Gewebetransplantation in Planarien die Tür für die Funktionsprüfung von Subpopulationen von naiven oder behandelten Stammzellen in der Wiederbesiedlung Assays, die schon seit langem der Goldstandard-Verfahren zur Untersuchung adulter Stammzellen Potenzial bei Säugetieren 8. Breite Akzeptanz dieser Techniken wird zweifellos zu einem besseren Verständnis der zellulären Verhalten von adulten Stammzellen in Gewebe Homöostase und Regeneration.

Watch this Scientific Journal Video about Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation at JoVE.com

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Eine effektive Methode für die Transplantation von Gewebe definierte und einheitliche Größe zwischen Planarien beschrieben wird. Ebenfalls enthalten ist eine Beschreibung, wie die Immobilisierung Technik zur Transplantation verwendet werden ausgebildet, in Verbindung mit Blei Schilde, für die partielle Bestrahlung von lebenden Tieren werden.

Planarien Immobilisierung, partielle Bestrahlung, und Gewebetransplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

planarian-immobilization-partial-irradiation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Aufrufe.  University of Utah School of Medicine. Eine effektive Methode für die Transplantation von Gewebe definierte und einheitliche Größe zwischen Planarien beschrieben wird. Ebenfalls enthalten ist eine Beschreibung, wie die Immobilisierung Technik zur Transplantation verwendet werden ausgebildet, in Verbindung mit Blei Schilde, für die partielle Bestrahlung von lebenden Tieren werden.

Serie: Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Murine Hauttransplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Forschung

Biologie

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generation of Human CD40-aktivierten B-Zellen

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissue Gezielte Embryonale Chimären: Zebrafisch Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Pharmakologische und Functional genetischen Tests zu manipulieren Regeneration der Planarien Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Ein Maus-Modell der teilweisen Darmverschluss

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Planarian Scrunching als quantitatives Behavioral Readout für Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.