Ein Vorteil dieses Protokolls ist, dass das Wurmblatt einfach zu handhaben ist. Das Blatt verfügt über Eigenschaften, die das Trocknen verhindern und es uns ermöglichen, Mikrostrahlbestrahlung für lebende Tiere durchzuführen, mehrere Verhaltenstests durchzuführen und Langzeitbeobachtungen durchzuführen. Die mikrofluidischen Kanäle in diesem Wurmblatt sind offen, was das Sammeln von Tieren erleichtert.
Diese Schneckenblätter können auch wiederholt verwendet werden, was sie wirtschaftlicher macht. Als wir diese Technik entwickelten, wollten wir nur einen Teil der Tiere mit einem Mikrostrahl unter dem Mikroskop bestrahlen. Also brauchten wir klare, sehr dünne Chips, die die Tiere halten konnten.
Legen Sie zunächst ein dünnes, transparentes Blatt auf die Bühne, um es als Bodenabdeckungsfolie zu verwenden. Positionieren Sie vorsichtig eine Schneckenfolie auf der unteren Abdeckfolie mit flacher Pinzette. Legen Sie mindestens drei Tröpfchen Pufferlösung auf die Oberfläche einer 6 Zentimeter langen, nicht behandelten Petrischale.
Dann wählen Sie mehrere erwachsene C.elegans mit einem Platina-Picker von einer Kulturplatte. Übertragen Sie die Tiere auf ein Tröpfchen mit dem Platina-Picker und lassen Sie die Tiere im Puffer schwimmen, um alle Bakterien zu entfernen. Waschen Sie die Tiere in zwei separaten Tröpfchen und spülen Sie die Tiere in einem anderen Tröpfchen.
Legen Sie als Nächstes ein Tröpfchen Pufferlösung auf die Oberfläche des Wurmblatts. Entfernen Sie die gewaschenen Tiere aus dem Puffertröpfchen, und übertragen Sie sie auf ein Tröpfchen auf dem Wurmblatt. Verwenden Sie eine flache Pinzette, um einen PS-Abdeckungsfilm über das Schneckenblatt zu legen, und drücken Sie sanft über die Kanäle von einem Ende des Blattes zum anderen.
Oder lassen Sie die Tiere einfach in seimlet fallen und versiegeln Sie vorsichtig mit dem Deckfilm, so dass sich Tröpfchen zwischen der Abdeckung und den Wurmblättern mit den Tieren innerhalb des Kanals ausbreitet. Bestätigen Sie, dass die Tiere am Leben sind, indem Sie mit einem Mikroskop bei 1-2-facher Vergrößerung auf Bewegung überprüfen. Notieren Sie die Positionen der Tiere, und notieren Sie sich insbesondere die Nummer des Kanals, in dem jedes Tier eingeschlossen ist, und die Position jedes Tieres im Kanal.
Um immobilisierende Tiere zu sammeln, verwenden Sie eine flache Pinzette, um den Abdeckfilm vom Wurmblatt zu entfernen, und lassen Sie dann 10-15 Mikroliter Pufferlösung auf einen der mikrofluidischen Kanäle fallen, die die Tiere umschließen. Beobachten Sie unter dem Stereomikroskop die Tiere beim Drehen. Dann nehmen Sie die Schwimmtiere mit dem Platina-Picker auf und bringen Sie sie auf eine Assay-Platte.
Nachdem Sie die Tiere wie bisher nachgewiesen eingeschlossen haben, beobachten Sie fluoreszierende Flecken an den Tieren mit einem Mehleszenzmikroskop. Dann Bild CalciumionenWellenausbreitung mittels Videoaufnahme, um dynamische Aktivitäten zu beobachten. Das verwendete Wurmblatt auf eine sechs Zentimeter lange Petrischale legen und etwa 100 Mikroliter sterilisiertes ultrareines Wasser auf das Blech legen.
Verwenden Sie die Handschuhe, um Wasser auf der Oberfläche des Blattes zu verteilen und alle Verunreinigungen abzuwaschen. Als Nächstes verwenden Sie Einwegtücher, um die Feuchtigkeit vom Wurmblatt zu entfernen. Geben Sie fünf Milliliter 70% Ethanol in die Petrischale und verwenden Sie die Gehandicapten, um das Ethanol über das Schneckenblatt zu verteilen.
Schließlich, nachdem das Blatt trocken ist, legen Sie das Blatt auf eine sterile Petrischale und Decken. Anhand dieses Protokolls wurde die Eignung verschiedener Coverfilme untersucht. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Beweglichkeit zwischen Kontrolltieren und Tieren, die in mikrofluidischen Kanälen mit PS-Folie eingeschlossen waren.
Im Gegensatz dazu wurde die Beweglichkeit bei Tieren, die unter einem Deckglas eingeschlossen sind, deutlich reduziert. Auch die Beweglichkeit der tiere, die mit einem Tierfilm eingeschlossen sind, wurde deutlich verringert. Es ist wichtig, Deckfolien für die Abdichtung von mikrofluidischen Kanälen sorgfältig auszuwählen.
Anhand dieses Protokolls haben wir drei Stunden nach der Immobilisierung auf dem Chip die Eignung verschiedener Coverfilme durch Fortbewegungstests der Tiere bewertet. Mit dieser Technik wollten wir einen ultradünnen benetzbaren Chip nur für die Mikrostrahlbestrahlung entwickeln. Diese Wurmblätter wurden jedoch bereits für Bildgebungunden und Verhaltenstests über ihre ursprünglichen Anwendungen hinaus verwendet.
