Die Autoren möchten sie Michelle Deochand für die Perfektionierung dieses Auge Ablationstechnik, Taylor Birkholz für die Unterstützung bei dem Funktionstest, Michael Levin für die Anti-Arrestin Antikörper und Junji Morokuma Informationen zu den Peltier-Platten danken. Diese Arbeit wurde durch einen SFSA Zuschuss von der Western Michigan University WSB unterstützt.

1. Tier Kultur und Handhabung Hinweis: Dieses Protokoll verwendet Schmidtea mediterranea, eine diploide Planarien Spezies mit einem sequenzierten Genom 16, 17 , die üblicherweise für die Regeneration Forschung verwendet wird. Jedoch ist der Test ebenso erfolgreich mit anderen Arten, wie Dugesia Tigrina und Girardia dorotocephala (die im Handel erhältlich). <ol><li> Pflegen Würmer in „worm Wasser“ aus 0,5 g / l Meersalz wird in Reinstwasser (oder gefiltertes entionisiertes) Wasser. Verwenden sterile Polypropylen oder Glasbehälter des Wurm , Wasser zu halten. Siehe <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Zusatzdatei 1</a> für Details über Wurm Wasseraufbereitung. HINWEIS: Niemals Seife reinigen Behälter (oder andere Verbrauchsmaterialien), wie Seife ist giftig für Würmer; statt mit 70% Ethanol abwischen und an der Luft trocknen lassen. &lt;ol&gt; <li> Handschuhe tragen, während sie mit planaria arbeiten, um sie vor Verschmutzung zu schützen. HINWEIS: Würmer sind sehr empfindlich gegenüber Umweltgiften und Chemikalien, einschließlich Seife, Bleichmittel, Shampoo, Conditioner, und Handcreme. </li></ol></li><li> Haus Kolonien in Polypropylen Nahrungsmittelbehältern, wobei der Deckel teilweise geöffnet gelassen zum Luftaustausch bei ~ 20 ° C (Raumtemperatur). Store experimentelle Würmer in entweder Petrischalen (20 Würmer pro 100 mm-Schale) oder nicht-behandelten Gewebe-Kulturplatten (1 worm pro Well für 12-Well-Platten). Um Stress abzubauen, halten beide Kolonien und Experimente im Dunkeln. HINWEIS: Die Kolonien sollten nicht mehr als 500-1000 Würmer pro Liter Wurm Wasser. Für Experimente lassen Deckel vollständig an Ort und Stelle, da Luftstrom in diese Gerichte ausgelegt ist. </li><li> Feed-nicht-experimentelle Würmer einmal pro Woche mit püriertem Bio-Rindfleisch oder Hühnerleber mit Püree aus einer Transferpipette fallen, Platzierung Tropfen Nahrung in den Behälter. Lassen Sie Würmer 2 h Lebensmittel in die konsumierendunkel vor dem Behälter (siehe Schritt 1.4) Reinigung aus. Vor der Verwendung speichert Püree bei -20 ° C für kurzfristig (Wochen) oder -80 ° C für langfristige (Monate); nicht Püree zur erneuten Verwendung wieder einfrieren (als Bakterien blühen kann und die Würmer schaden). HINWEIS: Leber keine Hormone oder Antibiotika und vorzugsweise nicht vorher eingefroren enthalten sollte. Centrifuge Püree vor der Anwendung (oder vor der Fütterung) zum Gefrieren Luft zu entfernen und verhindern, dass Lebensmittel aus schweben. Lebensmittel sollten auf den Boden des Behälters sinken. 1 ml Püree ist für 500-1.000 Würmer ausreichend. </li><li> Austauschwasser einmal pro Woche mit frischem Wasser Wurm für beide Kolonien und Experimente. Colony Behälter auch mit einem ungebleichten Papiertuch abgewischt werden (entfernen Schleim Reste, die Trap-Abfälle) einmal pro Woche für Würmer oder zweimal in der Woche für die Zufuhr Würmer (2 h nach der Fütterung und wieder 2 Tage später) am Verhungern. Um den Biofilm zu behalten, nicht wischen mehr als 80% des Behälters. </li><li> Bewegen Würmer zwischen Containern (oder Operation setup) unter Verwendung einer Transferpipette. Um freie Würmer Behälteroberflächen anhaftet, spritzt Wasser über / hinter der Schnecke von der Oberfläche zu lösen. Dann saugen die Schnecke in die Pipette, bei dem Versuch, die Schnecke innerhalb des unteren inch (dünner) Teil der Pipette zu halten. <ol><li> Backload Pipetten mit einer kleinen Menge von Wurm Wasser vor ihnen zu saugen. </li><li> Versuchen Sie, das Wasser um den Wurm zu bewegen, anstatt der Wurm selbst, um zu verhindern, weiche Körper Würmer zu reißen, indem sie mit der Pipette zu berühren. </li><li> Halten Sie bedeckt experimentellen Gerichte, es sei denn Würmer übertragen oder Wasser zu ersetzen. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung <ol><li> Stoppen Sie Würmer mindestens eine Woche vor den Experimenten zugeführt wird . <ol><li> Wählen Sie Würmer, die für ≥1 Woche wurden nicht gefüttert worden und sind mindestens 5-7 mm in der Länge. Übertragen Sie die Würmer in eine Petrischale 2/3 voller Wurm Wasser und bestätigen Schneckenlänge von einem Lineal unterhalb der Schale gleiten. messen Sie worms während voll ausgefahren und bewegend. HINWEIS: Während kleiner (5-7 mm) Würmer besser funktionieren , wenn nachfolgende Immunofluoreszenz durchführt und in situ - Hybridisierungsanalysen, größere Würmer (8-10 mm) sind leichter zu handhaben - vor allem , wenn das Lernen abzutragen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Würmer sind ganze, unversehrt, und in letzter Zeit nicht regenerieren. HINWEIS: Regenerieren Würmer haben viel leichter (oder keine) Pigment im Kopf und / oder Schwanzbereich im Vergleich zu normalen Würmern. </li><li> Wenn RNAi oder pharmakologische Behandlungen von Würmern durchführen, tun Sie dies an dieser Stelle. Wenn Würmer als Teil der Behandlung (wie für RNAi) gefüttert wurden, wartet mindestens 7 Tage nach der letzten Fütterung vor dem Fortfahren zu Schritt 2.2. </li></ol></li><li> Reinigen der Arbeitsfläche und Präpariermikroskop Basis mit 70% igem Ethanol und lassen Sie ihn vollständig trocknen. Die Schale ausgewählter Würmer auf der linken Seite des Bereichs. Rechts von dem Umfang, Ort ein Paar von # 5 Zangen, a 31 G 5/16 Zoll Insulin Nadel mit einem 1ml-Spritze und eine saubere Transferpipette. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Instrumente durch Berühren der Bank gehalten werden (die Verunreinigungen einführen könnte). Verwenden ein starres Element (wie ein Stäbchen Rest), um die Zange zu halten, Nadel, Pipette und sauber. Alternativ Ort Instrumente auf einem frischen braunen (roh) Papiertuch. Hinweis: Diese und nachfolgende Befehle geschrieben werden, wie sie auf rechtshändige Personen betreffen. Linkshändig Personen sollten die rechts / links Richtung umkehren. </li></ol></li><li> Neben dem Arbeitsbereich, legen Sie eine Schachtel mit einem fusselfreien Tuch wischt, eine Quelle von frischem Wurm Wasser, und einige zusätzliche Transferpipetten (von der Tischplatte geschützt). Platz Wurm Wasser in einer Plastikwaschflasche für eine einfache Dosierung. stellen auch eine markierte 12-Well-Platte (oder 100 mm Petrischale) auf der rechten Seite des Umfangs für ablatiert Tiere zu sammeln. </li><li> Bei Verwendung einer maßgefertigte Platte Peltier Würmer zu immobilisieren, positioniert die Peltier - Platte in die Vertiefung in ter Basis des Binokular und stellt den Ausgang auf der Gleichstromquelle, bis die Arbeitsfläche der Peltier-Platte ausreichend kühl ist (typischerweise ~ 5 V) .Alternatively, bildet eine Kühlplatte mit einer 100 mm Petrischale Füllung ½ voll mit Wasser und frieren für mindestens 24 Stunden. Verwerfen Sie den Deckel und legen den Boden der 100-mm-Schale auf der Basis des Binokular, anschießend den Deckel einer 60 mm Petrischale mit der Oberseite nach unten direkt auf der Oberfläche des Eises (1A). <ol><li> Nachdem das Wasser in der 100-mm-Schale gefroren ist, wird ein „Vulkan“ von Eis in der Mitte der Platte erscheinen. Wenn dies der Fall ist, verwenden Sie eine Rasierklinge das Eis flach zu kratzen, Unregelmäßigkeiten von der Oberfläche zu entfernen. HINWEIS: Während der Operationen wird das Eis schmelzen, so dass Ablationen viel schwieriger. Bereiten mehr Eier Geschirr im Voraus, und gefrorene ersetzen für diejenigen während des Tests, sobald der Deckel der 60-mm-Schale beginnt floating schmelzen. </li></ol></li><li> Bereite das ... VorChirurgie Oberfläche. Geschnitten , um ein 5 cm x 10 cm großes Stück aus Kunststoffparaffinfilm (4 cm 2 bei Verwendung der Petrischal kalte Platte) und es auf dem Zentrum der Fixiereinrichtung. Falten Sie ein fusselfreien Tuch abwischen in ein Quadrat etwa 2 cm 2 und legen Sie es auf der Folie. Schneiden Sie ein Stück weißes Filterpapier 1,5-2 cm 2 und legen Sie es auf des Tuchs. Siehe Abbildung 1B-1E. <ol><li> Halten Sie die gefaltete Wischtuch an der Stelle mit einem behandschuhten Finger, und verwendet Wurm Wasser leicht zu dämpfen das Wischtuch, um sicherzustellen, dass es gefaltet bleibt. Verwenden, um die Seite einer Transferpipette zu rollen die flache abzuwischen. HINWEIS: Kälte hilft Würmer zu hindern. Die Arbeit „trocken“ hilft auch bei der Immobilisierung. Das Gewebe wirkt abzuwischen Wasser durch das Filterpapier Docht, die während der Operation worm feucht zu halten, ohne Würmer ermöglichen vollständig zu austrocknen (das letal ist). </li></ol></li></ol> 3. Chirurgische Ablation <ol><li> Verwenden einer Transferpipette Ort aufe worm dorsal auf das Filterpapier. Schalten Sie die Lichtquelle auf und leiten die Schwanenhälse, so dass das Licht auf der Wurm fokussiert ist. Stellen Sie den Binokular Fokus und Vergrößerung, so dass die Augen deutlich sichtbar sind (der gesamte Wurm muss nicht in Sicht sein); 5fache Vergrößerung ist ein guter Ausgangspunkt. Orientieren die Schnecke durch Drehen des Paraffinfilmes so dass der Kopf in Richtung der Forscher gerichtet ist (in Richtung der Vorderseite des Mikroskops), gewinkelt 30-40 Grad nach rechts. <ol><li> Vermeiden Sie den Einsatz von hellem Licht überschüssige Wurm Bewegung zu verhindern. Planarien Anzeige negativ Photo- und versuchen, helle Licht zu entziehen. </li><li> Wenn der Wurm ventrale Seite positioniert ist, nach oben zeigt (mit Schlundöffnung sichtbar), verwendet, um die matte Seite der Pinzette vorsichtig auf die Schnecken Dorsalseite repositionieren (mit Augen sichtbar). Vermeiden Sie das Tier mit der scharfen Spitze der Zange Annäherung an die Möglichkeit des Reißens durch Weichgewebe zu minimieren, wenn das Tier Neupositionierung. </li><li&gt; Das Mikroskop Fokus so einstellen, dass die Augen klar im Fokus. Achten Sie auch darauf, dass sowohl die Augen und die umgebenden Gewebe Kopf in Sicht sind. </li></ol></li><li> Halt eine frische Nadel / Spritze in der rechten Hand , als ob es ein Stift (zwischen Daumen und Zeigefinger) war. Verspannen den linken Daumens gegen die Peltier - Platte (oder eine Petrischale kalte Platte) und mit dem linken Daumen als einen Drehpunkt , auf das der Bodenabschnitt der Spritze aufliegt (Abbildung 2A). Schauen Sie durch das Mikroskop, und stellen Sie sicher , dass die Abschrägung der Nadel sichtbar ist. HINWEIS: Nadeln sind sehr scharf. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit ihnen. Das Tragen von Latex oder Nitril Handschuhe können einen gewissen Schutz bieten. <ol><li> Mit dem linken Daumen, um die Nadel / Spritze stetig während des gesamten Verfahrens zu halten und zu vermeiden Hände schütteln. </li><li> Bildet einen Winkel von etwa 40 ° mit dem linken Daumen und linken Zeigefingern (mit dem Zeigefinger auf der Oberfläche der Operation), um die Operation Oberfläche stabil zu halten. </li></ol></li><li> Mitdie Abschrägung der Nadel nach oben zeigt (wie ein Löffel) positioniert, um die Nadel im rechten Winkel zu dem Auge (2B). Verwenden, um die Spitze der Nadel vorsichtig auf die dünne Gewebeschicht durchdringt von rechts über den Augenbecher (weiß, unpigmentierten Region) des Auges, Ausschöpfen nach links. Sehr sanft jede pigmentierte Gewebe innerhalb des Augenbechers, wobei darauf geachtet befanden entfernen nicht den Boden zu durchstechen oder um die Grenzen der Exkavation zu zerstören. <ol><li> Wenn der Wurm auf dem Filterpapier für&gt; 1-2 min an jedem Punkt während des Verfahrens gewesen ist, einen Tropfen Wurm Wasser, um den Wurm zu rehydrieren. HINWEIS: Dehydration wird der Wurm Anfälligkeit Rippen Verletzungen erhöhen. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.3, bis alle schwarzen pigmentierten Geweben (Pigmentzellen) sowie alle weißen Geweben des Augenbechers (Dendriten der Sehzellen), werden entfernt. Entfernen Sie nach dem Ende der Nadel stecken operativ entfernte Gewebe durch sorgfältig mit einem Tuch abwischen wischen. Wenn Doppel Auge Ablation ist, abzutragen das zweite Auge an dieser Stelle gewünscht. HINWEIS: Um Verletzungen zu vermeiden, Nadeln können durch Greifen die Nadel mit einem sauberen Tuch wischt mit dem Daumen und Zeigefinger, dann mit der anderen Hand gehalten gereinigt werden, um die Nadel durch die wegzuwischen von Daumen und Zeigefinger zu ziehen. Alternativ kann die Nadel auf die Oberfläche eines feuchten Gewebes abzuwischen und untersucht Sauberkeits abgewischt werden. </li><li> Wenn Sie fertig ist , verwenden Sie eine Transferpipette den Wurm auf eine markierte Schale mit frischem Wurm Wasser zu bewegen. Wenn Gruppendaten zu analysieren, in einem einzigen 100 mm Petrischale bis 20 Würmer auf. Wenn die Regeneration in den gleichen Individuen über die Zeit - Tracking, lege 1 Wurm in jede Vertiefung einer 12-Well - Platte. Sobald alle Würmer übertragen werden, Würmer spülen , indem sie alle Würmer Wasser aus den Schalen / Brunnen entfernt und mit frischem Wurm Wasser zu ersetzen. <ol><li> Zum Entfernen von Würmern aus dem Filter, Backload die Pipette mit einer geringen Menge an Wasser worm und läßt das Wasser auf die Schnecke. Dies sollte heben ter Wurm aus dem Filterpapier, um sofort in die Pipette für die Übertragung angesaugt werden. </li></ol></li><li> Inkubieren Experimente bei ~ 20 ° C (Raumtemperatur) vor Licht geschützt und dem Regenerationsprozess folgen. HINWEIS: Würmer können in einem temperaturgesteuerten Inkubator gelagert werden, um eine konstante Temperatur zu halten, aber das ist nicht unbedingt notwendig. Die meisten Raumtemperaturen variieren nur von + 5 ° C, was nicht den Wurm der Fähigkeit beeinflussen zu regenerieren. </li><li> Wenn es gewünscht wird , zu beheben Würmer für die Immunhistochemie (siehe Abbildungen 3-4) und / oder in situ - Hybridisierungsanalysen der Genexpression. Verschiedene Befestigungsverfahren gibt es für Planarien Immunhistochemie 18, 19, 20 und in situ - Hybridisierung 21, 22, 23 - Protokolle. </li><li> Wenn Experimente abgeschlossen werden, sacrifice leben Würmer durch worm Wasser aus der Schale entfernt und mit 70% Ethanol zu ersetzen. Inkubieren Würmer für 3-5 min, für Würmer Kontrolle zu lysieren und drehen gräulich. </li><li> Legen Sie nicht behandelten Würmer in den normalen Abfallstrom einmal geopfert. Vermeiden Sie Live-Würmer in die Umwelt einzuführen, insbesondere nicht-einheimische Arten. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Auge Ablationstechnik verbessert die aktuellen Methoden (wie Lochung) von Hirngewebe mit Ausnahme von und Exzision hauptsächlich auf die Augengewebe zu beschränken. Mit etwas Übung kann diese Technik von den meisten Personen durchgeführt wird, von Technikern in microsurgeries zu unerfahren, aber gewissenhaft Studenten erlebt. Es wird empfohlen , dass diese Technik oft vor der Verwendung von Ablationen in Experimenten durchgeführt werden, einschließlich (wenn möglich) Bestätigung der vollständigen Entfern...

Planarien sind ein leistungsfähiger Modellorganismus für die adulte Stammzellvermittelte Regeneration zu studieren. Diese nichtparasitären Süßwasser Plattwürmer besitzen die Fähigkeit , jegliche und alle fehlenden Gewebe zu regenerieren, einschließlich ihrer zentralen Nervensystems und des Gehirns 1. Studium so weit zurück wie die 1700er Jahre 2, technologischen Fortschritte in den Planarien Feld in den letzten 10-15 Jahren (wie ein sequenzierten Genom, in - situ - Hybridisierung, Immunhistochemie, RNA - Interferenz (RNAi) und Transkriptomik) hat diesen historischen Modellorganismus aktualisiert . Insbesondere haben Planarien vor kurzer Popularität durchaus als ein Modell für die Augenforschung 3 gewonnen. Planarien haben prototypischen Augen mit nur zwei Gewebetypen, die Photorezeptorneuronen und Pigmentzellen; dies hat die Charakterisierung seiner Augenstammzellpopulation und demonstriert ermöglicht, dass viele der gleichen Gene Wirbeltierauge de Regulierungwicklung ist in Planarien konservierte 4, 5. Die Augenbecher befinden sich dorsal und der weißen, nicht pigmentierten Dendriten der Photorezeptorneuronen und den Halbmond schwarzen Pigmentzellen enthalten, und die Augen, das Gehirn über eine Chiasma innervate. Zusätzlich ist ein Modell zur Erläuterung regenerative Prozesse 6 ist, wobei die Planarien Auge zu studieren , die Entwicklung der visuellen Mechanismen gut geeignet ist , 7, Verhaltensreaktionen auf Licht (Planarien anzuzeigen negativen Phototaxis) 8 und die neurologische Grundlage des Verhaltens 9. Augenregeneration in Planarien wurde in zwei Kontexten weitgehend untersucht: als Teil des Regenerationskopfes Dekapitation folgenden 4, 10, und im Anschluss an der Exzision von nur die Augengeweben 11, 12 </sup&gt;. Die meisten Planarien Studien zur Augen Regeneration haben die Enthauptung Methode verwendet, da es einfach und unkompliziert ist. Die gebräuchlichste Methode Planarien Auge Exzision hat bisher mit einem feinen Glaskapillare 13 über Locher gewesen, 14, obwohl einige Studien auch Amputationen durchgeführt sind gerade hinter den Augen (teilweise Enthauptung) 15. Jedoch beinhalten alle diese Methoden, um den Verlust von vielen anderen Geweben als nur das Auge (wie Gehirn, Darm und Nephridien), möglicherweise die Ergebnisse kompliziert Interpretation. Das Protokoll Auge Ablation präsentierte hier beschränkt Exzision auf die Augengewebe (insbesondere ohne Gehirn), in Daten entstehen, die spezifischen für das Auge sind. Außerdem, im Gegensatz zu geköpft Würmer , die 7-14 Tage , um Fütterung zu beginnen, Augen abgetragenen Würmer füttern innerhalb von 24 h von Ablation 12, so dass RNAi - Experimente (wo RNAi über die Nahrung zugeführt wird) werden performed gleichzeitig. Obwohl technisch schwieriges Auge Ablation erfolgreich als Enthauptung durchzuführen, Exzision aktuelle Studien mit Auge haben keine detaillierten Anweisungen auf ihren Verfahren enthalten. Das Ziel dieses Video-Artikel ist Forscher zu ermöglichen, konsequent die Planarien Exkavation zu entfernen, ohne die zugrunde liegenden Hirngewebe zu stören und so einige anderen Gewebe wie möglich zu entfernen. Dieses Verfahren kann sowohl für die Einzel- und Doppel Auge Ablation verwendet werden und ist für eine Vielzahl von Untersuchungen. Wie die meisten Regenerations Assays wird Augen Ablation gut geeignet für die Kombination mit sowohl pharmakologischen und genetischen (RNAi) Bildschirme sowie Verhaltensstudien. Hier beschreiben wir Methoden für die Behandlung von Würmern, eine Planarien Kolonie Aufrechterhaltung und das Auge Ablationstechnik selbst.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instant Ocean sea salts</td>
			<td>Spectrum Brands&#160;</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td>&#34;10 Gallon&#34; box&#160; (net weight 3 lbs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>4.5 x 8.5 in&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #2 filter paper</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1002125</td>
			<td>Circles, 125 mm diameter, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Touch Insulin syringe (with needle)</td>
			<td>Pet Health Market</td>
			<td>17175-04</td>
			<td>&#160;U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>60 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5&#160; forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Inox, straight tip , 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Samco Scientific&#160;</td>
			<td>225</td>
			<td>Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M paraffin film</td>
			<td>Brand&#160;</td>
			<td>701606</td>
			<td>&#160;4 in x 125 ft roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated tissue culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15705-059</td>
			<td>Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic food containers (for colony)&#160;</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>Large rectangle</td>
			<td>2.25 qt (2.12 L), 10&#34; x 6 -3/4 &#34; x 3 -3/16&#34;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planaria (Girardia tigrina)</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>132954</td>
			<td>Sold as &#34;Brown&#34; Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planaria (Schmidtea mediterranea)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown paper towels&#160;</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>9-3/16 x 9-3/8&#34; 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (for worm water), optional</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16650-275</td>
			<td>Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-synapsin antibody, optional</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3C11</td>
			<td>Supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-arrestin antibody, optional</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional</td>
			<td>Nalge Nunc International Corporation</td>
			<td>2324-0015</td>
			<td>15 L,&#160; polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Peltier plate, optional</td>
			<td>Williams Machine, Foxboro, MA&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:&#160; Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).&#160; The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is&#160; &#34;anchored&#34; to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a &#34;foot&#34; that fits into the opening of your microscope&#39;s base plate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power source (for Peltier plate), optional</td>
			<td>B &#38; K Precision</td>
			<td>1665</td>
			<td>Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other common supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope with gooseneck lighting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopstick rests, optional</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical ablation assay for studying eye regeneration in planarians

In der Studie von adulten Stammzellen und Regenerationsmechanismen sind Planarienplattwürmer eine Heftklammer in vivo Modellsystem. Dies ist zum großen Teil auf ihre reichlich vorhandenen pluripotenten Stammzellpopulation und die Fähigkeit, alle Zell- und Gewebetypen nach Verletzungen zu regenerieren, die für die meisten Tiere katastrophal sein würde. Vor kurzem haben Planarien an Popularität gewinnen als Modell für die Augenregeneration. Ihre Fähigkeit, das gesamte Auge (bestehend aus zwei Gewebetypen: Pigmentzellen und Photorezeptoren) zu regenerieren ermöglicht die Präparation der Regulierungsmechanismen Sehsystem Regeneration. Eye Ablation hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Techniken (wie Enthauptung oder Loch) für die Prüfung Augenspezifische Wege und Mechanismen, die wichtigsten davon ist, dass die Regeneration weitgehend Augengewebe allein beschränkt ist. Der Zweck dieses Video-Artikel ist zu zeigen, wie zuverlässig die Planarien Exkavation zu entfernen, ohne das Gehirn oder die umgebenden Gewebe zu stören.Der Umgang mit Würmern und Wartung einer etablierten Kolonie wird ebenfalls beschrieben. Diese Technik verwendet eine 31-G, 5/16-Zoll-Nadel Insulin chirurgisch die Exkavation von Planarien auf einer kalten Platte immobilisierte aushöhlen. Dieses Verfahren umfasst sowohl Einzel- und Doppel Auge Ablation, mit den Augen in 1-2 Wochen zu regenerieren, so dass für eine breite Palette von Anwendungen. Insbesondere kann diese Ablationstechnik leicht mit pharmakologischen und genetischen (RNA-Interferenz) Bildschirmen für ein besseres Verständnis von Regenerationsmechanismen und deren Entwicklung, Augen Stammzellen und deren Wartung und phototaxic Verhaltensreaktionen und deren neurologischen Basis kombiniert werden.

Für die ersten 1-2 Stunden nach der Operation erhalten die Tiere Bewegung aufweisen können im Vergleich zu intakten Würmer verringert (aber sie werden immer noch bewegen). Falls gewünscht, werden essen Würmer innerhalb von 24 h nach der Operation (beispielsweise für RNAi Fütterung). Wenn folgendes Auge Regeneration in den gleichen Individuen im Laufe der Zeit, stellen Sie sicher, dass ein Foto von jedem Wurm sowohl vor der Operation (intakt) und bei 1 h nach der Ablation (hpa) zu ...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians at JoVE.com

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Dieses Protokoll zeigt, wie konsequent Planarien Augen (Augenbecher) ohne störende umgebende Gewebe auszuschneiden. Verwendung eine Insulin-Nadel und Spritze, entweder einen oder beiden Augen ablatiert werden können Untersuchungen über die Mechanismen der Regeneration regulierenden Auge, um die Entwicklung der visuellen Regeneration und die neuronalen Grundlage des lichtinduzierten Verhaltens zu erleichtern.

Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

surgical-ablation-assay-for-studying-eye-regeneration-in-planarians

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K Aufrufe.  Western Michigan University.  Dieses Protokoll zeigt, wie konsequent Planarien Augen (Augenbecher) ohne störende umgebende Gewebe auszuschneiden. Verwendung eine Insulin-Nadel und Spritze, entweder einen oder beiden Augen ablatiert werden können Untersuchungen über die Mechanismen der Regeneration regulierenden Auge, um die Entwicklung der visuellen Regeneration und die neuronalen Grundlage des lichtinduzierten Verhaltens zu erleichtern. 

Serie: Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult liver regeneration after 70% partial hepatectomy results in hepatocyte hypertrophy with some replication in remaining lobes with restoration of metabolic activity, but with permanent loss of the injured lobe&#39;s morphology and architecture. Here, we detail a new surgical method in the neonate that leaves a physiologic environment conducive to regeneration. This model involves amputation of the left lobe apex and a subsequent conservative management regimen, and lacks the necessity for ligation of major liver vessels or chemical injury, leaving a physiologic environment where regeneration may occur. We extend this protocol to amputations on juvenile (P7-14) mice, during which the injured liver transitions from organ regeneration to compensatory growth by hypertrophy. The presented, brief 30 min protocol provides a framework to study the mechanisms of regeneration, its age-associated decline in mammals, and the characterization of putative hepatic stem or progenitors.

Here, we present a new method for partial resection of the left hepatic lobe in neonatal (day 0) mice. This new protocol is suitable for studying acute liver injury and injury response in the neonatal setting.

Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic dysfunction occur in various neurodegenerative diseases and age-related degeneration. Investigation of the mechanisms that regulate neurite outgrowth would not only shed valuable light on brain developmental processes but also on such neurological disorders. Due to the low transfection efficiency, it is currently challenging to study the effect of a specific protein on neurite outgrowth in primary mammalian neurons. Here, we describe a simple method for the investigation of neurite outgrowth by the co-transfection of primary rat cortical neurons with EGFP and a protein of interest (POI). This method allows the identification of POI transfected neurons through the EGFP signal, and thus the effect of the POI on neurite outgrowth can be determined precisely. This EGFP-based assay provides a convenient approach for the investigation of pathways regulating neurite outgrowth.

In this report, we describe a simple protocol for studying neurite outgrowth in embryonic rat cortical neurons by co-transfecting with EGFP and the protein of interest.

Ein verbesserter grüner Fluoreszenzprotein-basierter Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primärneuronen

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

Konfokale Mikroskop-basierte Laserablation und Regenerationstest in Zebrafisch Interneuromastzellen

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, and stress response. More than a decade ago, stem cells were identified in the pituitary gland. However, despite the application of transgenic in vivo approaches, their phenotype, biology, and role remain unclear. To tackle this enigma, a new and innovative organoid in vitro model is developed to deeply unravel pituitary stem cell biology. Organoids represent 3D cell structures that, under defined culture conditions, self-develop from a tissue's (epithelial) stem cells and recapitulate multiple hallmarks of those stem cells and their tissue. It is shown here that mouse pituitary-derived organoids develop from the gland's stem cells and faithfully recapitulate their in vivo phenotypic and functional characteristics. Among others, they reproduce the activation state of the stem cells as in vivo occurring in response to transgenically inflicted local damage. The organoids are long-term expandable while robustly retaining their stemness phenotype. The new research model is highly valuable to decipher the stem cells' phenotype and behavior during key conditions of pituitary remodeling, ranging from neonatal maturation to aging-associated fading, and from healthy to diseased glands. Here, a detailed protocol is presented to establish mouse pituitary-derived organoids, which provide a powerful tool to dive into the yet enigmatic world of pituitary stem cells.

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

The pituitary gland is the key regulator of the body's endocrine system. This article describes the development of organoids from the mouse pituitary as a novel 3D in vitro model to study the gland's stem cell population of which the biology and function remain poorly understood.

Entwicklung von Organoiden aus der Hypophyse der Maus als In-vitro-Modell zur Erforschung der Hypophysenstammzellbiologie

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Augenentfernung in lebenden Zebrafischlarven zur Untersuchung des innervationsabhängigen Wachstums und der Entwicklung des visuellen Systems

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...