Die Autoren danken für die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) durch den Sonderforschungsbereich SFB 578 &quot;Vom Gen zum Produkt&quot; an der Technischen Universität Braunschweig, Deutschland zur Verfügung gestellt.

1. Reactor-Setup und Beginn der Kultivierung 4 Bioreaktor-Kultivierungen insgesamt durchgeführt werden. <ol><li> Verwenden Sie ein 3 L Rührkessel-Bioreaktor mit einem Arbeitsvolumen von 2,2 L für die Kultivierung von A. niger SKAn1015. </li><li> Gießen 72,6 g Glucose-Monohydrat in den Reaktor und füllen Sie ihn mit 1,9 l entionisiertem Wasser. </li><li> Installieren des Reaktors Geräte wie 3 Schikanen, zwei Sechs-beschaufelten Scheibe Turbinenrades, eine pH-Elektrode, einen Gaseinlaß mit Luftfilter, ein Kühlfinger, einem Abgas-Luft-Kühler mit Luftfilter, ein Tauchrohr zur sterilen Probenahme mit Luftfilter und Zulaufschläuche für mittlere, Inokulum, Säure und Base. </li><li> Autoklav den Reaktor bei 121 ° C für 20 min. </li><li> Verbinden Sie den Reaktor mit dem Säure-Basen-Reservoir (2 M HCl, 2 M NaOH) und den entsprechenden Pumpen und die Einrichtung eines pH-Wert von 5,0 ± 0,05 pH-Wert mit dem Steuergerät. </li><li> Verknüpfen Sie den Reaktor mit dem Kühlwasser-System und setzen Sie den Heizmantelin den Reaktor. </li><li> Installieren Sie den Temperaturfühler mit entsprechender Steuerung und Einrichtung einer Temperatur von 37 ± 0,1 ° C bei der Temperatur Steuereinheit. </li><li> Montieren Sie den Motor Agitation der Spitze des Reaktors und bringen sie in Betrieb mit einer Rührgeschwindigkeit von 200 min -1. </li><li> In dem sterilen ein minimales Wachstum Medium 11 Trog einem der sterilen Zulaufschläuche (250 ml). Für mittlere Vorbereitung alle Komponenten wurden bei 121 ° C für 20 min autoklaviert und miteinander vermischt. Drei Kulturen die Komponenten umfassen Talkum (3MgO • 4SiO 2 • H 2 O) in den Konzentrationen von 1 g / l (Reaktor 2), 3 g / l (Reaktor 3) und 10 g / l (Reaktor 4). Vor der Verwendung erneut zu suspendieren die Mikropartikel in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 6,5) und fügen sie in den sterilen Medium. In Kontrollkulturen (ohne Partikel) ersetzen Sie den Mikro-Suspension mit 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH 6,5). </li><li> Fügen Sie die Sporensuspension (Inokulum) eines vorbereitet in Wucherpfennig et. al (2011) 11 Trog einem der sterilen Zulaufschläuche (50 ml), so dass die Konzentration von Sporen beträgt 1x10 6 ml -1. Die Impfung stellt den Beginn des Anbaus (h = 0 h). </li><li> Starten Sie die Belüftung mit einer Rate von 1,0 L min -1. </li></ol> 2. Sterile Probenahme nach 24, 48 und 72 h Kultivierung <ol><li> Nehmen 50 ml sterilem Kulturbrühe in einem Flakon Rohr. </li><li> Verwenden Probe zur Bestimmung der Biomasse Trockengewicht, β-Fructofuranosidase Aktivität und mikroskopische Analyse. </li></ol> 3. Bestimmung des Biomasse-Trockengewicht nach 24, 48 und 72 h Kultivierung <ol><li> Biomasse Proben zu mindestens doppelt gemacht werden. </li><li> Gewicht ein Cellulose-Filter mit einem Mikro-Skalen nach dem Trocknen im Exsikkator und platzieren Sie den Filter in einem Büchner-Trichter mit angeschlossenem Wasserstrahl-Vakuumpumpe. </li><li> Filtern sie ein definiertes Probenvolumen (zB 10 ml) einenND spülen Sie den Filter mit 10 ml destilliertem Wasser auf Medium Verbindungen aus der Biomasse zu entfernen. </li><li> Falten der Filter einmal in der Mitte, legen Sie sie in einem Glas-Petrischale und steckte es in ein Fach Trockner bis zur Gewichtskonstanz (mindestens 24 h). </li><li> Kühlen Sie den Filter in einem Exsikkator und Bestimmung des Gewichts. </li><li> Berechnen Sie die Biomasse Trockengewicht als die Differenz zwischen dem Gewicht des Filters mit und ohne getrocknete Biomasse von der verwendeten Probe dividiert. </li></ol> 4. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der extrazellulären β-Fructofuranosidase von GOD / POD-Essay nach 24, 48 und 72 h Kultivierung Lagern Sie die Proben auf Eis ständig während der Arbeit mit ihnen. <ol><li> Filter 1,5 ml Kultur Suspensionstrog ein Celluloseacetat-Filter durch Drücken der Kultursuspension mit einer Spritze durch den Filter in ein Reaktionsrohr. Bewahren Sie das Reaktionsrohr bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Für die Reaktionsmischung verwenden 20ul-Probe und mit 200 ul von 1,65 M Saccharose in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 5,4) aufgelöst, um die Reaktion von Saccharose zu Glucose zu initiieren. Cary aus der Reaktion mindestens in zweifacher Ausführung. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei 40 ° C für 20 min in einem Heizblock. Stoppen der Reaktion durch Inkubation bei 95 ° C für 10 min in einem Heizblock. Das Reaktionsgemisch wird durch Lagerung auf Eis und Spin-down das kondensierte Wasser durch Zentrifugieren bei 13.000 g für 10 min bei 4 ° C </li><li> Um den pH-Wert und Temperatur abhängige Spaltung von Saccharose zu Glukose ausmachen, führen Sie eine leere Wert mit 20 ul entionisiertem Wasser anstelle von 20 ul Probe. </li><li> Um restliche Glucose in der Kulturbrühe zu berücksichtigen, Durchführung einer negativen Kontrolle für jede Probe. Zu diesem Zweck Verwendung von 20 ul der Probe zu inaktivieren und β-Fructofuranosidase durch Erhitzen bei 95 ° C für 10 min vor der Saccharose hinzugefügt und die Platte wie in Schritt 4.3 beschrieben. </li><li> Verdünnen der Proben, so dass die folgenden Maßnahmenured Adsorption ist in der kalibrierten Wertebereich. </li><li> Führen Sie alle enzymatischen Assays in dreifacher Ausfertigung. Bewerben 2 ul verdünnte Probe in eine Mikrotiterplatte gut. Tragen Sie einen Standard für die Kalibrierung auf der Mikrotiterplatte durch jede Verwendung von 2 ul von zehn Glukose-Lösungen mit zehn unterschiedlichen Know-Konzentrationen (ab 1 mm bis 15 mm) anstelle von 2 ul Probe. Für Null-Punkt-Kalibrierung verwenden 2 ul entionisiertem Wasser anstelle von 2 ul Probe. </li><li> Fügen Sie 200 ul der Reagenzlösung in jede Vertiefung mit Hilfe einer Multi-Pipette. </li><li> Inkubieren des Gemisches für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Bewahren Sie die Mikrotiterplatte bei 6 ° C bis zur Messung (ein paar Stunden bei den meisten). </li><li> Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einer 96-well Mikrotiterplatten-Photometer Sonnenaufgang und die Magellan Datenwiederherstellung Software. Stellen Sie die Mischzeit bis zu 5 sek. und der Ruhezeit bis zu 1 sek. </li><li> Öffnen Sie das Ergebnis Tabelle mit einem Tabellenkalkulationsprogramm und erstellen Sie eine Eichgerade mit dem Standard-Sortiment: glucose Konzentration X = a + b-Absorption </li><li> Berechnen Sie die Aktivität: Aktivität = (Absorption x Verdünnungsfaktor-Blindwert) X a + b </li><li> Finde heraus, die β-Fructofuranosidase Aktivität durch Berechnung der Differenz zwischen den Aktivitäten der Probe und der entsprechenden negativen Kontrolle. </li><li> Berechnen Sie die spezifische Produktivität für folgende Verwendung unter Berücksichtigung Biomasse Trockengewicht und β-Fructofuranosidase Tätigkeit 11. </li></ol> 5. Mikroskopie und automatisierte Bildanalyse nach 72 h Kultivierung <ol><li> Platz in 3 ml-Suspension in einer Kunststoff-Petrischale undverdünnen mit physiologischer Kochsalzlösung, bis die morphologischen Strukturen getrennt sind. </li><li> Situieren die Petrischale unter dem Mikroskop, das eine integrierte oder angeschlossene Kamera verfügt. Erfassen und Speichern des etwa 100 Bilder (Abbildung 2) von morphologischen Strukturen pro Probe. Beachten Sie, dass für jedes Bild wenigstens ein Objekt vollständig abgebildet. </li><li> Öffnen Sie alle Bilder von der gleichen Probe mit dem Bildverarbeitungsprogramm ImageJ 12. Konvertieren Sie die Bilder auf schwarz und weiß mit der Prozess-Tool &quot;Make Binary&quot; (Abbildung 2). Für die Anwendung des Befehls an die ganze Reihe von Bildern mit einem Makro-Code wie folgt. laufen (,, Machen Sie Binary &quot;) </li><li> Öffnen Sie die bearbeiteten Bilder mit binären ImageJ wieder. Berechnen Sie die Formfaktoren Feret-Durchmesser, projizierte Fläche, Umfang, Rundheit, Seitenverhältnis, Rundheit und Solidität für jedes Bild mit dem Analysetool &quot;Set Measurement&quot;. Zum Aufbringen der Befehl zu einer ernstES von Bildern mit einem Makro-Code wie folgt. laufen (&quot;8-Bit&quot;); ausgeführt werden (&quot;Make Binary&quot;); laufen (&quot;Set Scale ...&quot;, &quot;Abstand = X bekannt = 1000 Pixel = 1 VE = um globale&quot;); laufen (&quot;Set Maße ...&quot;, &quot;Bereich Umfangsform Feret-Limit-Anzeige redirect = None dezimal = 3&quot;); laufen (&quot;Analyze Particles ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity Zirkularität = 0,00-1,00 show = Outlines Display&quot;); Bestimmen X die Anzahl der Pixel, die 1000 um korreliert, indem er eine gerade Linie in einem Maßstab. Korrelieren der Anzahl von Pixeln aus der geraden Linie mit der Länge der Balken in um. </li><li> Öffnen Sie das Ergebnis Diagramm mit Formfaktor Werte für jedes Bild mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnen Sie eine Morphologie-Nummer wie folgt für jedes Bild. <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Berechnen Sie Mittelwert und Standardabweichung für die Morphologie Zahl unter Berücksichtigung aller Bilder einer Probe. </li&gt; <li> Verwenden Sie eine Graphik-und Datenanalyse-Programm für graphische Korrelation der Morphologie, die dem spezifischen Produktivität und bestimmen Sie die mathematische Beziehung durch mathematische Regression. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Durch Zugabe von Talkum Mikropartikel A. niger SKAN 1015 Morphologie wird von einem echten Pelletmorphologie zu einem verteilten oder sogar Myzel Morphologie verändert. Während Pelletmorphologie unter Standardbedingungen zeigte ein Myzel Morphologie durch Ergänzung Medium mit 10 g / l Talkum Mikropartikel (4.) Erstellt. Gleichzeitig die Aktivität von β-Fructofuranosidase erhöht um 3-fach 3-5. Eine Ergänzung von 1 oder 3 g / l Talkpulver führt zu einer dispergierten Morphologie mit einer doppelten Fructofuranosidase Aktivität (4.). Die Mikro-Partikel abhängig Morphologie in umfassender Weise durch die Mor beschrieben werdenMorphologie Zahl, die anhand von Parametern automatische Bildanalyse bestimmt werden kann. Perfekt abgerundete und glatte Pellets werden in mikroskopischen Bildern erscheinen als perfekte Kreise. Für solche Teilchen die Morphologie hat einen Wert von 1. Die kleinste Fragment von Mycel Morphologie als eindimensionale Linie was eine Morphologie Zahl von 0 vereinfacht werden. Alle Zwischen-morphologische Formen wie längliche unregelmäßige Pellets oder Klumpen müssen daher Werte zwischen 0 und 1. Ziemlich große Partikel werden in einem hohen, Pilz-Partikel mit einer großen Oberfläche oder längliche Partikel, in einem eher niedrigen Morphologie der Nummer 11 zur Folge haben. Unter Standardbedingungen die Morphologie in Reaktor 1 weist eine Morphologie Zahl rund 0,8. Die Morphologie im Reaktor 4 mit 10 g / L Talkpulver ist mit einem Mn etwa 0,1. Die Morphologie Anzahl von Reaktoren 2 und 3, mit Talkum Puder Konzentrationen von 1 und 3 g / l, zwischen diesen Extremen liegt, zeigt eine dispergierte morphologie. Da Mikro-Partikel-Morphologie abhängig ist eng mit dem β-Fructofuranosidase Produktivität bezogen, wird eine mathematische Korrelation von Morphologie und Produktivität Zahl ähnlich wie Abbildung 5 erhalten. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeine Systematik des experimentellen Designs und des analytischen Verfahrens. A. niger kultiviert wird (mit oder ohne Mikro-Teilchen) in einem 3 L Rührkessel-Bioreaktor für 72 h. Nach 24, 48 und 72 ha Probe zur Bestimmung der Biomasse Trockengewicht und β-Fructofuranosidase Aktivität, was wiederum zur Berechnung der spezifischen Produktivität verwendet getroffen werden. Nach 48 h wird die Pilz-Morphologie wird durch mikroskopisch untersucht und gekennzeichnet durch digitale Bildanalyse. Relevante Parameter der Bildanalyse auf eine Morphologie-Nummer, die mathematische Beziehung mit der spezifischen Produktivität kombiniert. <imgalt = &quot;Bild 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Abbildung 2. Schritte der Bildverarbeitung für die mikroskopische-generierte Bilder von morphologischen Strukturen von A. Niger. Schritt 1: Bildaufnahme mit dem Mikroskop. Schritt 2: Imageverbesserung, wenn nötig. Schritt 3: Bild Binarisierung, schwarz-weiß (binär) Bild in ImageJ erzeugt. Schritt 4: das binäre Bild wird durch verarbeitet und unerwünschte Objekt gelöscht werden. Schritt 5: morphologische Analyse wird mit der &quot;Analyze Partikel&quot;-Funktion der Open-Source-Programm ImageJ durchgeführt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Abbildung 3. Verschiedene morphologische Formen von A. niger abhängig von der Konzentration des zugesetzten Mikropartikel. Mit zunehmender Konzentration von Mikro-Partikeln gegeben das Pellet Größe exakt verringert werden kann bis hin zu kleinen Kern-Schale-Pellets, kleine Herden und sogar frei verteilt Myzel. Morphologie Engineering Alspergillus niger SKAn1015 durch Mikro-Partikel-Supplementation in Submerskultur. Ohne Mikropartikel (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / l (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / l (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / l (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (A), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) und 40-50 g / L (T). Die Bilder wurden mittels Lichtmikroskopie nach 72 h der Landwirtschaft entzogen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> 4. Fructofuranosidase Aktivität in Abhängigkeit von Talk Mikropartikel Konzentration von 1 g / l (Reaktor 2), 3 g / l (Reaktor 3) und 10 g / l (Reaktor 4). Reaktor 1 ist nicht mit Mikro-Partikel ergänzt, hier der Anbau wird unter Standard-Bedingungen durchgeführt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Abbildung 5. Vertreter gute Korrelation (R 2 = 0,91) der MorphologieAnzahl und die spezifische Produktivität. Die Morphologie Zahl aufgetragen (Abszisse) gegen die spezifische Produktivität (Ordinate). Nichtlineare Regression ergibt den exponentiellen Korrelation.

<ol>
	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates.">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li><li>Zuccaro, A., G&#195;&#182;tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering.">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li><li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+glucose+oxidase,+peroxidase,+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose.">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li><li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity.">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

Ich habe nichts zu offenbaren.

Die Modifizierung von Pilz-Morphologie hat Interesse an der Biotechnologie seit vielen Jahrzehnten. Verschiedene Studien haben versucht, ausgewählte Prozessparameter wie pH-Wert, Leistungsaufnahme, Temperatur, Medium Nährstoffe oder Inokulumkonzentration 1 variieren, leiden aber unter eher ungenau, unvollständig und Kontrolle der Morphologie, hohe Energiekosten, Hemmeffekte Produkt oder Instabilität, Im Gegensatz dazu Die Ergänzung von Mikropartikeln erlaubt eine präzise Konstruktion von Pilz Morphologie durch Feinabstimmung Variation der Teilchengröße und Konzentration. Dies eröffnet neue Möglichkeiten, um Mikro-Partikel zur Optimierung und zur maßgeschneiderten Entwicklung von Hochgeschwindigkeits produzierenden Morphologie verwenden in der biotechnologischen Produktion mit A. niger und andere filamentöse Mikroorganismen. Die digitale Bildanalyse ist ein leicht reproduzierbares Verfahren zur Pilz-Makro-Morphologie zu charakterisieren. Allerdings ist die Vielzahl von Parametern für die Größe, Form und Oberflächeneigenschaftenter von morphologischen Strukturen in der Literatur beschrieben ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Pilz-Morphologie kompliziert. Das vorgestellte Morphologie Zahl als eine Kombination von relevanten Parametern, vermeidet diesen Nachteil und kann nicht nur für die umfassende Charakterisierung von morphologischen Strukturen, sondern auch für die direkte mathematische Korrelation mit der Produktivität genutzt werden. Dies wiederum macht eine Schätzung der Produktivität durch die Morphologie gegeben und damit eine Anpassung der Morphologie für Prozess muss möglich. Mit der Morphologie Zahl, ist es möglich, zwischen verschiedenen Pellets und verklumpen Morphologien 4,5 unterscheiden. Für die weitere Entwicklung der Morphologie Zahl der Betrachtung der fraktalen Dimension scheint vielversprechend zu sein. Eine fraktale Dimension ergibt eine Messung der Komplexität und der Masse füllen Eigenschaften eines Objekts 13 und ist daher für eine ganzheitliche Charakterisierung von Mycel-Morphologie prädestiniert. Die creation eines hohen produzierenden Mycel-Morphologie, könnte jedoch zu Problemen mit Prozess-Performance vor allem in großflächigen Anbau führen, weil das Myzelwachstum Formular wurde zuvor gezeigt wurde, weisen viel größere Kulturbrühe Viskositäten 2. Dies führt zu Problemen mit Wärme-und Stofftransport und die Bildung von gemischten Zonen nicht stagniert, die eine höhere Leistungsaufnahme und machen den Anbau teurer zu 1 voraussetzen. Deshalb Beziehung zwischen Pilz Morphologie und Kulturbrühe Viskosität sollte berücksichtigt werden, wenn die Änderung der Morphologie und in weiteren Modellen eingebaut werden können.

Table of Equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Equipment</td>
			<td>
			Company</td>
			<td>
			Catalogue Number/model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			autoclave</td>
			<td>
			Systec</td>
			<td>
			V150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			B&uuml;chner funnel (plastic)</td>
			<td>
			VWR</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose filter (for biomass dry weight)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Filter Discs Grade 389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)</td>
			<td>
			Sartorius stedim biotech</td>
			<td>
			Midisart 200 PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for enzyme activity)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Midisart NML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Centrifuge 5415R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Biofuge fresco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus sepatech</td>
			<td>
			Varifuge 3.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			compartment dryer (105 &deg;C)</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Kelvitran t</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (temperature)</td>
			<td>
			Jumo</td>
			<td>
			Jumo iTron 08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (pH-value)</td>
			<td>
			meredos</td>
			<td>
			pH Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			desiccator</td>
			<td>
			Duran</td>
			<td>
			Vacuum stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Falcon tubes</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			FALC352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 40 &deg;C</td>
			<td>
			Biometra</td>
			<td>
			TB1 Thermoblock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 95 &deg;C</td>
			<td>
			HLC</td>
			<td>
			HBT 130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro plate reader</td>
			<td>
			Tecan</td>
			<td>
			Sunrise-Microplate-Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro scales</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			microscope (digital inverted)</td>
			<td>
			AMG</td>
			<td>
			EVOS xl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro pipettes and tips (different sizes)</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			5283303
			5283298 
			5283299 
			5283300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro titer plate</td>
			<td>
			Nunc</td>
			<td>
			MaxiSorp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			multi pipette and tips</td>
			<td>
			Eppendorf/ Omnilab</td>
			<td>
			5283611/ 5283611</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			pH-electrode</td>
			<td>
			Schott</td>
			<td>
			pH-Meter CG840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reaction tubes</td>
			<td>
			Roth</td>
			<td>
			E518.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			scale</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 3202 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			stirred tank bioreactor with equipment</td>
			<td>
			Applikon Biotechnology</td>
			<td>
			2L Bioreactor set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			syringe</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Combitips Plus 5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Reagents:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Name of the reagent</td>
			<td>
			Company </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Acetic acid</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose monohydrate, (&alpha;-D-)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrochloride acid (37 % w/v)</td>
			<td>
			Fiedel-de Ha&euml;n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrous magnesium silicate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Monopotassium phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			o-dianoisidine dihydrochloride</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Peroxidase (Typ II from horseradish)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium acetate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium hydroxide</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sucrose, D-(+)</td>
			<td>
			Fluka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Water (deionized)</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Solutions and Medium Composition:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Solution</td>
			<td>
			Components</td>
			<td>
			Amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)</td>
			<td>
			Sodium acetate
			Bring to volume with deionized water
			Adjust at pH 6.5 with acetic acid</td>
			<td>
			4.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			Monopotassium phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			6.805 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			7.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)</td>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			61.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			0.05M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			1.65 M sucrose solution</td>
			<td>
			D-(+)-sucrose
			Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			564.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reagent solution</td>
			<td>
			o-Dianisidin-Dihydrochlorid
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			25 mg
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose reagent solution</td>
			<td>
			Glucose oxidase
			Peroxidase
			Phosphate buffer (pH 7.0)
			reagent solution</td>
			<td>
			10.5 mg
			3 mg
			90 mL
			10 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

Der filamentöse Pilz A. niger ist ein weit verbreitetes Stamm in einem breiten Bereich industrieller Prozesse aus der Nahrung der pharmazeutischen Industrie. Eines der faszinierendsten und oft unkontrollierbaren Merkmale dieser filamentösen Organismus ist seine komplexe Morphologie. Es reicht von dichten kugelförmigen Pellets zu zähflüssig Myzelien (Abbildung 1). Verschiedene Prozessparameter und Zutaten sind dafür bekannt, Pilz-Morphologie 1 zu beeinflussen. Da eine optimale Produktivität korreliert stark mit einer bestimmten morphologischen Form, die Pilz-Morphologie stellt oft den Engpass bei der Produktivität in der industriellen Produktion. Ein geradlinig und elegante Methode zur präzisen Steuerung morphologische Form ist der Zusatz von anorganischen unlöslichen Mikropartikel (wie wasserhaltiges Magnesiumsilikat, Aluminiumoxid oder Titan-Silikat-Oxid) zu dem Kulturmedium Beitrag zur höheren Enzymproduktion 2-6. Da es eine obvdene Korrelation zwischen Mikro-Partikel abhängig Morphologie und Enzymproduktion ist es wünschenswert, mathematisch zu verknüpfen Produktivität und morphologische Erscheinungsbild. Daher ist eine genaue quantitative und ganzheitliche morphologische Beschreibung wird angestrebt. So stellen wir eine Methode zur Erzeugung und Charakterisierung von Mikro-Partikel abhängig morphologischen Strukturen und zur Pilz-Morphologie mit der Produktivität (Abbildung 1), die möglicherweise trägt zu einem besseren Verständnis der Morphogenese von fadenförmigen Mikroorganismen zu korrelieren. Der rekombinante Stamm A. niger SKAn1015 wird 72 h in einem 3 l Rührkessel Bioreaktor. Durch Zugabe von Talk Mikropartikel in einer Konzentration von 1 g / l, 3 g / l und 10 g / l vor der Inokulation eine Vielzahl von morphologischen Strukturen reproduzierbar erzeugt. Sterile Proben werden nach 24, 48 und 72 Stunden zur Bestimmung der Wachstumsprozess und die Aktivität des hergestellten Enzyms gemacht. Diegebildete Produkt ist der hochwertige Enzym β-Fructofuranosidase, ein wichtiger Biokatalysator für neo-Zucker-Bildung in Lebensmitteln oder pharmazeutischen Industrie, die unter anderem katalysiert die Reaktion von Saccharose zu Glucose 7-9. Daher bedeutet die Quantifizierung von Glucose nach Zugabe von Saccharose die Menge des produzierten β-Fructofuranosidase. Glukose wird durch eine Quantifizierung GOD / POD-Assay-10, die für High-Throughput-Analyse in 96-well Mikrotiterplatten modifiziert wird. Pilz-Morphologie nach 72 Stunden wird durch mikroskopisch untersucht und gekennzeichnet durch digitale Bildanalyse. Dabei werden Partikelform Faktoren für Pilz-Makro-Morphologie wie Feret-Durchmesser, projizierte Fläche, Umfang, Rundheit, Seitenverhältnis, Rundheit und Solidität mit dem Open-Source-Bildbearbeitungsprogramm ImageJ berechnet. Relevante Parameter werden auf einer dimensionslosen Zahl Morphologie (Mn) 11, die eine umfassende Charakterisierung ermöglicht kombiniertPilz Morphologie. Die enge Korrelation der Morphologie Anzahl und Produktivität werden durch mathematische Regression hervorgehoben.

Watch this Scientific Journal Video about Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles at JoVE.com

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Verfahren genau zu erzeugen und umfassend charakterisieren Morphologie Fadenpilz<em&gt; Aspergillus niger</em&gt; Wird beschrieben, mit dessen Hilfe mathematische Korrelation von morphologischen Aussehen und Produktivität.

Anpassung von Aspergillus niger Morphologie durch Zugabe von Talkum Mikropartikel

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

customization-aspergillus-niger-morphology-through-addition-talc

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

19.0K Aufrufe.  Technische Universität Braunschweig. Verfahren genau zu erzeugen und umfassend charakterisieren Morphologie Fadenpilz Aspergillus niger Wird beschrieben, mit dessen Hilfe mathematische Korrelation von morphologischen Aussehen und Produktivität.

Serie: Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs & Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Verpackung HIV-oder FIV-basierten Lentivector Expressionskonstrukte und Transduktion von VSV-G-pseudotypisierte Viruspartikel

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

Modellierung des Lebenszyklus von Ebola Virus unter Biosafety Level 2 Bedingungen mit Virus-ähnlichen Partikeln, die Tetracistronic Minigenome

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimierung eines Assay Quantitative Mikroneutralisations

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Produktion von Pseudotyped Partikel hoch pathogene Coronaviren in eine Einstellung "Biosafety Level 2" zu studieren

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious cycle further requires the formation of viral/host protein complexes with HIV-1 RNA to regulate the splicing and enable nucleocytoplasmic transport. The HIV-1 Rev protein accomplishes the nuclear export of HIV-1 mRNAs through multimerization with intronic cis-acting targets - the Rev response element (RRE). A nucleolar localization signal (NoLS) exists within the COOH-terminus of the Rev arginine-rich motif (ARM), allowing the accumulation of Rev/RRE complexes in the nucleolus. Nucleolar factors are speculated to support the HIV-1 infectious cycle through various other functions in addition to mediating mRNA-independent nuclear export and splicing. We describe an immunoprecipitation method of wild-type (WT) Rev in comparison to Rev nucleolar mutations (deletion and single-point Rev-NoLS mutations) in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. Nucleolar factors implicated in the nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 and nucleolin C23), as well as cellular splicing factors, lose interaction with Rev in the presence of Rev-NoLS mutations. Various other nucleolar factors, such as snoRNA C/D box 58, are identified to lose interaction with Rev mutations, yet their function in the HIV-1 replication cycle remain unknown. The results presented here demonstrate the use of this approach for the identification of viral/host nucleolar factors that maintain the HIV-1 infectious cycle. The concepts used in this approach are applicable to other viral and disease models requiring the characterization of understudied pathways.

Here we describe Rev immunoprecipitation in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. The methods described can be used for the identification of nucleolar factors involved in the HIV-1 infectious cycle and are applicable to other disease models for the characterization of understudied pathways.

Identifizierung von Nukleolar-Faktoren während der HIV-1-Replikation durch Rev-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the brain. The BBB is mainly formed out of endothelial cells embedded in collagen IV and fibronectin-rich basement membranes. Several pathologies result from dysfunction of the BBB followed by microbial traversal, causing diseases such as meningitis. In order to test the effect of multiple parameters, including different drugs and anesthetics, on the permeability of the BBB we established a novel human cell culture model mimicking the BBB with human brain microvascular endothelial cells. The endothelial cells are grown on collagen IV and fibronectin-coated filter units until confluence and can then be treated with different compounds of interest. In order to demonstrate a microbial traversal, the upper chamber with the apical surface of the endothelial cells is inoculated with bacteria. After an incubation period, samples of the lower chamber are plated on agar plates and the obtained colonies are counted, whereby the number of colonies correlate with the permeability of the BBB. Endogenous cellular factors can be analyzed in this experimental set-up in order to elucidate basic cellular mechanisms of the endothelial cells contributing to the BBB. In addition, this platform allows performing a screen for compounds that might affect the permeability of the endothelial cells. Finally, bacterial traversal can be studied and linked to different pathologies, such as meningitis. It might be possible to extend the model and analyze the pathways of the bacteria through the BBB. In this article, we provide a detailed protocol of the described method to investigate the permeability of the BBB.

The human blood-brain barrier selectively prevents penetration of hydrophilic molecules and pathogens into the brain. Several pathologies, including meningitis and postoperative delirium, are associated with an increased permeability of the blood-brain barrier. Here, we describe an endothelial cell culture model to test the barrier permeability by microbial traversal.

Analyse der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Barriere durch mikrobielle Traversale durch mikrovaskuläre Endothelzellen

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

Quantifizierung der menschlichen Norovirus-Virus-ähnlichen Partikelbindung an commensale Bakterien mittels Durchflusszytometrie

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...