Los autores agradecen el apoyo financiero proporcionado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a través del centro de investigación en colaboración SFB 578 &quot;Del gen a la del producto&quot; en la Universidad Técnica de Braunschweig, Alemania.

1. Reactor de instalación e inicio del cultivo 4 cultivos de biorreactores en total se llevan a cabo. <ol><li> Utilizar un 3 L agitó biorreactor tanque con un volumen de trabajo de 2,2 L para el cultivo de A. niger SKAn1015. </li><li> Vierta 72,6 g de glucosa monohidrato en el reactor y llenarla con agua desionizada 1,9 L. </li><li> Efectuar la instalación del reactor tales como 3 deflectores, un dos seis palas rodete de la turbina de disco, un electrodo de pH, una entrada de gas con filtro de aire, un dedo de enfriamiento, un enfriador de aire de escape con filtro de aire, un tubo de inmersión para el muestreo estéril con filtro de aire y las mangueras de entrada para el medio, el inóculo, el ácido y la base. </li><li> Autoclave el reactor a 121 ° C durante 20 min. </li><li> Conectar el reactor con el depósito de ácido-base (2 M HCl, 2 M de NaOH) y las bombas correspondientes y establecer un valor de pH de 5,0 ± 0,05 con la unidad de control del pH. </li><li> Enlace del reactor con el sistema de refrigeración de agua y poner la camisa de calentamientoalrededor de la vasija del reactor. </li><li> Instale el sensor de temperatura con la unidad de control correspondiente y establecer una temperatura de 37 ± 0,1 ° C en la unidad de control de la temperatura. </li><li> Montar el motor de agitación encima del reactor y ponerla en servicio con una velocidad de agitación de 200 min -1. </li><li> Añadir la estéril medio mínimo crecimiento 11 por una de las mangueras de entrada estériles (250 ml). Para la preparación de todos los componentes medio se trataron en autoclave a 121 ° C durante 20 min y se mezclan juntos. Por tres cultivos los componentes incluyen talco en polvo (3MgO • 4SiO 2 • H 2 O) en las concentraciones de 1 g / l (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) y 10 g / l (reactor 4). Antes de usar, volver a suspender las partículas de micro en 50 mM de tampón de acetato sódico (pH 6,5) y añadirlo al medio estéril. En los cultivos de control (sin partículas) reemplazar la suspensión de partículas de micro por 50 mM de tampón de acetato sódico (pH 6,5). </li><li> Añadir la suspensión de esporas (inóculo) uns preparado en Wucherpfenning et. otros (2011) 11 por una de las mangueras de entrada estériles (50 ml) de modo que la concentración de esporas cantidades a 1x10 6 ml -1. La inoculación marca el inicio del cultivo (h = 0 h). </li><li> Iniciar la aireación con una tasa de 1,0 L min -1. </li></ol> 2. El muestreo estériles después de 24, 48 y 72 h de cultivo <ol><li> Tomar 50 ml de caldo de cultivo estéril en un tubo de frasco. </li><li> El uso de la muestra para la determinación del peso seco de biomasa, la actividad β-fructofuranosidasa y el análisis microscópico. </li></ol> 3. Determinación del peso seco de biomasa después de 24, 48 y 72 h de cultivo <ol><li> Las muestras de biomasa deben ser tomadas al menos por duplicado. </li><li> Peso un filtro de celulosa con una balanza micro después del secado en un desecador y colocar el filtro en un embudo Büchner con bomba conectada al vacío por chorro de agua. </li><li> Filtrar un volumen de muestra definida (por ejemplo 10 ml) unaND enjuagar el filtro con 10 ml de agua desionizada para eliminar compuestos medio de la biomasa. </li><li> Arruga el filtro una vez en el centro, colocarlo en una placa de Petri de vidrio y lo puso en un secador de compartimiento hasta constancia de peso (por lo menos 24 horas). </li><li> Enfriar el filtro en un desecador y medir el peso. </li><li> Calcular el peso de la biomasa seca como la diferencia entre el peso del filtro con y sin biomasa seca dividido por el volumen de la muestra utilizada. </li></ol> 4. Determinación de la actividad enzimática extracelular de la β-fructofuranosidasa por DIOS / POD-ensayo después de 24, 48 y 72 h de cultivo Almacene las muestras en hielo constantemente mientras se trabaja con ellos. <ol><li> Filtrar 1,5 ml de cultivo suspensión través de un filtro de acetato de celulosa pulsando el cultivo en suspensión con una jeringa a través del filtro en un tubo de reacción. Almacenar el tubo de reacción a -20 ° C hasta su uso. </li><li> Para la mezcla de reacción utiliza 20l muestra y añadir 200 l de sacarosa 1,65 M disuelto en tampón fosfato 0,05 M (pH 5,4) para iniciar la reacción de la sacarosa en glucosa. Cary a cabo la reacción al menos por duplicado. </li><li> Incubar la mezcla de reacción a 40 ° C durante 20 min en un bloque de calentamiento. Se detiene la reacción mediante la incubación a 95 ° C durante 10 min en un bloque de calentamiento. Se enfría la mezcla de reacción mediante el almacenamiento en hielo y centrifugar el agua condensada por centrifugación a 13,000 g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Para tener en cuenta el pH y la división dependiente de la temperatura de la sacarosa en glucosa, llevar a cabo un valor en blanco mediante el uso de agua de 20 l desionizada en lugar de 20 l de la muestra. </li><li> Para dar cuenta de glucosa residual en el caldo de cultivo, llevar a cabo un control negativo para cada muestra. Para que el uso final 20 l de la muestra e inactivar β-fructofuranosidasa por calentamiento a 95 ° C durante 10 min antes de añadir la sacarosa y se incuba como se describe en el paso 4,3. </li><li> Diluir las muestras de tal manera que las medi siguientesured adsorción está en el intervalo valor calibrado. </li><li> Llevar a cabo todos los ensayos enzimáticos, por triplicado. Aplicar 2 muestra diluida l en una placa micro título así. Aplicar una gama estándar para la calibración en la placa de micro titulación por cada uno usando 2 l de diez soluciones de glucosa con diez concentraciones conocer diferentes (de 1 mM a 15 mM) en lugar de 2 l de la muestra. Para la calibración del cero punto dos utilizan el agua desionizada l en lugar de 2 l de la muestra. </li><li> Añadir 200 l de la solución del reactivo a cada pocillo utilizando una pipeta multicanal. </li><li> Incubar la mezcla durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Guarde la placa de titulación de micro a 6 ° C hasta que la medición (un par de horas a lo sumo). </li><li> Medir la absorción a 450 nm utilizando un 96-así Amanecer lector de placas de micro y el software Magallanes recuperación de datos. Establecer el tiempo de mezcla hasta 5 seg. y el resto hasta el 1 seg. </li><li> Abra la tabla de resultados con una hoja de cálculo y la construcción de una línea de calibración mediante el uso de la gama estándar: glucose = concentración de absorción de una X + b </li><li> Calcular la actividad: = actividad (absorción X factor de dilución-valor en blanco) a + b X </li><li> Calcular la actividad β-fructofuranosidasa mediante el cálculo de la diferencia entre las actividades de la muestra y el control negativo apropiado. </li><li> Calcular la productividad específica para el uso siguiente, teniendo en cuenta el peso de biomasa seca y β-fructofuranosidasa de actividad de 11. </li></ol> 5. Microscopía y análisis automatizado de imágenes a las 72 h de cultivo <ol><li> Lugar en torno a 3 ml de suspensión de cultivo en una placa Petri de plástico ydiluir con solución fisiológica de cloruro sódico hasta que las estructuras morfológicas se separan. </li><li> Situar la placa de Petri con un microscopio, que cuenta con una cámara integrada o conectada. Adquirir y guardar aproximadamente 100 imágenes (Figura 2) de las estructuras morfológicas por muestra. Preste atención a que en cada imagen por lo menos un objeto está completamente representado. </li><li> Abra todas las imágenes de la misma muestra con el programa de procesamiento de imágenes ImageJ 12. Convierte las imágenes en blanco y negro mediante el uso de la herramienta de proceso de &quot;Make binario&quot; (Figura 2). Para aplicar el comando de toda la serie de imágenes utilizar un código de macro de la siguiente manera. ejecutar (,, Hacer Binario &quot;) </li><li> Abra las imágenes binarias procesados ​​con ImageJ nuevo. Calcular el diámetro de la forma de factores de Feret, la proyección del área, perímetro, circularidad, la relación de aspecto, solidez redondez und para cada imagen con el &quot;Juego de Medición&quot; herramienta de análisis. Para la aplicación de la orden de un serioES de imágenes utilizar un código de macro de la siguiente manera. ejecutar (&quot;8 bits&quot;); ejecutar (&quot;Make Binario&quot;); ejecutar (&quot;Escala de Ajuste ...&quot;, &quot;distancia = X = 1000 píxeles conocidos = 1 unidad = m mundial&quot;); ejecutar (&quot;Medidas Set ...&quot;, &quot;Área de visualización de la forma del perímetro de Feret límite reorientar = Ninguno decimal = 3&quot;); ejecutar (&quot;analizar partículas ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity circularidad = 0.00-1.00 = mostrar contornos de pantalla&quot;); Determinar X como el número de píxeles que se correlaciona con 1000 m mediante la construcción de una línea recta a través de una barra de escala. Correlacionar el número de pixels de la línea recta con la longitud de la barra de escala en micras. </li><li> Abra la tabla de resultado que contiene los valores para cada factor de forma de la imagen con una hoja de cálculo. Calcular el número de Morfología de la siguiente manera para cada imagen. <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Calcular el valor medio y la desviación estándar para el número de Morfología, teniendo en cuenta todas las imágenes de una muestra. </li&gt; <li> Utilice un programa de gráficos y análisis de datos para la correlación gráfica del número de Morfología de la productividad específica y determinar la relación matemática de la regresión matemática. </li></ol> 6. Los resultados representativos Mediante la adición de talco micro partículas A. niger SKAN 1015 se cambia la morfología de una verdadera morfología precipitado a una morfología dispersa o incluso micelial. Considerando que la morfología de pellets se exhibe en condiciones normales una morfología micelial se crea por la suplementación del medio con 10 g / L de talco micro partículas (Figura 4.). Al mismo tiempo la actividad de β-fructofuranosidasa aumenta alrededor de 3 veces 3-5. Un suplemento de 1 o 3 g / l de polvo de talco conduce a una morfología dispersa, con una actividad fructofuranosidasa duplicado (Figura 4.). La morfología de las partículas depende de micro puede ser descrita con detalle por el Morfología número que puede ser calculada utilizando parámetros determinados por análisis de imágenes automático. Bolitas redondas y lisas que en las imágenes microscópicas aparecen como círculos perfectos. Para tales partículas en el número de Morfología tiene un valor de 1. El fragmento más pequeño de la morfología del micelio se puede simplificar como una línea unidimensional obteniéndose un número de 0 Morfología. Todas las formas morfológicas intermedias, como pastillas alargadas irregulares o grupos por lo tanto, tienen valores entre 0 y 1. Bastante partículas grandes se traducirá en partículas a altas, fúngicas con una gran superficie o partículas alargadas, en un número bastante bajo Morfología 11. En condiciones normales la morfología en el reactor 1 muestra una serie Morfología en torno a 0,8. La morfología en el reactor 4 con 10 g de polvo / L talco tiene un Mn alrededor de 0,1. El número de morfología reactores 2 y 3, con concentraciones de polvo de talco de 1 y 3 g / l, se encuentra entre estos dos extremos, lo que demuestra una dispersa morfología. Desde morfología de las partículas depende de micro está estrechamente relacionado con la productividad de β-fructofuranosidasa, una correlación matemática del número de Morfología y productividad similar a la Figura 5 se obtiene. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema general del diseño experimental y el procedimiento analítico. A. niger se cultiva (con o sin micro partículas) en forma de L 3 biorreactor de tanque agitado durante 72 horas. Después de 24, 48 y 72 hectáreas muestra se toma para la determinación del peso de la biomasa seca y la actividad β-fructofuranosidasa, que de nuevo se utilizan para el cálculo de la productividad específica. Después de 48 h, la morfología de hongos es examinado por microscopio y se caracteriza por análisis de imagen digital. Los parámetros pertinentes de análisis de imagen se combinan para un número Morfología, que es matemático correlacionada con la productividad específica. <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Pasos de procesamiento de imágenes microscópicas de las imágenes generadas por las estructuras morfológicas de A. niger. Paso 1: adquisición de imágenes por microscopio. Paso 2: mejora de la imagen si es necesario. Paso 3: binarización de la imagen, negro y negro (binario) de la imagen generada en ImageJ. Paso 4: la imagen binaria es procesada por objeto deseado y se borran. Paso 5: análisis morfológico se realizó con el &quot;Análisis de partículas&quot; en función de la fuente abierta del programa ImageJ. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Figura 3. Diferentes formas morfológicas de A. dependiente de la concentración de agregado micro partículas niger. Con la creciente concentración de las partículas de micro agregó el tamaño de las pastillas puede ser, precisamente, disminuyó hasta pequeñas core-shell pellets, pequeñas bandadas y el micelio libremente, incluso dispersa. Morfología de ingeniería de ComoAspergillus niger SKAn1015 por la suplementación con micro partículas en cultivo sumergido. Sin micropartículas (A), 10 mg / l (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / l (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (S), 10 g / l (P), 15 g / l (Q), 20 g / l (R), 30 g / L (S) y 40-50 g / l (T). Las imágenes fueron tomadas por microscopía de luz después de 72 h de cultivo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> Figura 4. Actividad fructofuranosidasa en dependencia de talco micro partículas concentración de 1 g / l (reactor 2), 3 g / L (reactor 3) y 10 g / l (reactor 4). Reactor 1 no se complementa con micro partículas; aquí el cultivo se lleva a cabo bajo condiciones estándar. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Figura 5. Representante buena correlación (R2 = 0,91) de la morfologíanúmero y la productividad específica. El número Morfología se traza (abscisa) en contra de la productividad específica (ordenadas). Regresión no lineal se obtiene la correlación exponencial.

<ol>
	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates.">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li><li>Zuccaro, A., G&#195;&#182;tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering.">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li><li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+glucose+oxidase,+peroxidase,+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose.">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li><li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity.">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

No tengo nada que revelar.

La modificación de la morfología de hongos ha sido de interés en la biotecnología desde hace muchas décadas. Diversos estudios han tratado de variar los parámetros seleccionados del proceso tales como valor de pH, entrada de alimentación, temperatura, nutrientes medio o concentración de inóculo 1, pero sufren de control en lugar imprecisa e incompleta de la morfología, los altos costos de energía, los efectos de inhibición o la inestabilidad del producto, En contraste, la suplementación de micro partículas permite una ingeniería precisa de la morfología de hongos a través de afinado variación de tamaño de partícula y la concentración. Esto abre nuevas posibilidades de usar las partículas de micro para la optimización y de hecho a la medida del diseño de la morfología de alta producción en la producción biotecnológica con A. Níger y otros microorganismos filamentosos. El análisis digital de imágenes es un método fácil para caracterizar la morfología reproducibles macro hongos. Sin embargo, la variedad de parámetros para características de tamaño, forma y superficieter de las estructuras morfológicas descritas en la literatura hace que la evaluación rápida de la morfología de hongos complicado. El número Morfología presenta como una combinación de parámetros relevantes, evita esta deficiencia y se puede utilizar no sólo para la caracterización integral de las estructuras morfológicas, sino también para la correlación directa con la productividad matemática. De nuevo, esto hace que una estimación de la productividad por la morfología dado y por lo tanto una personalización de la morfología de proceso necesita posible. Utilizando el número de Morfología, es posible distinguir entre las diversas morfologías de las matas de pellets y 4,5. Para un mayor desarrollo del número de Morfología de la consideración de la dimensión fractal parece ser prometedor. Una dimensión fractal da una medida de la complejidad y la masa de relleno propiedades de un objeto 13 y por lo tanto predestinado para la caracterización integral de la morfología del micelio. El creation de una alta morfología del micelio que produce, sin embargo, podría llevar a problemas con el rendimiento del proceso, especialmente en el cultivo a gran escala, debido a la forma de crecimiento del micelio se ha demostrado previamente para exhibir mucho mayores viscosidades caldo de cultivo 2. Esto conduce a problemas con la transferencia de calor y masa y la formación de zonas estancadas no mezclados, que requieren una potencia de entrada superior y hacer que el cultivo más caro de operar 1. Por lo tanto la relación entre la morfología de hongos y viscosidad caldo de cultivo debe ser considerado cuando se cambia la morfología y ser incorporado en otros modelos.

Table of Equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Equipment</td>
			<td>
			Company</td>
			<td>
			Catalogue Number/model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			autoclave</td>
			<td>
			Systec</td>
			<td>
			V150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			B&uuml;chner funnel (plastic)</td>
			<td>
			VWR</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose filter (for biomass dry weight)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Filter Discs Grade 389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)</td>
			<td>
			Sartorius stedim biotech</td>
			<td>
			Midisart 200 PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for enzyme activity)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Midisart NML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Centrifuge 5415R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Biofuge fresco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus sepatech</td>
			<td>
			Varifuge 3.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			compartment dryer (105 &deg;C)</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Kelvitran t</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (temperature)</td>
			<td>
			Jumo</td>
			<td>
			Jumo iTron 08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (pH-value)</td>
			<td>
			meredos</td>
			<td>
			pH Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			desiccator</td>
			<td>
			Duran</td>
			<td>
			Vacuum stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Falcon tubes</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			FALC352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 40 &deg;C</td>
			<td>
			Biometra</td>
			<td>
			TB1 Thermoblock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 95 &deg;C</td>
			<td>
			HLC</td>
			<td>
			HBT 130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro plate reader</td>
			<td>
			Tecan</td>
			<td>
			Sunrise-Microplate-Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro scales</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			microscope (digital inverted)</td>
			<td>
			AMG</td>
			<td>
			EVOS xl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro pipettes and tips (different sizes)</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			5283303
			5283298 
			5283299 
			5283300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro titer plate</td>
			<td>
			Nunc</td>
			<td>
			MaxiSorp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			multi pipette and tips</td>
			<td>
			Eppendorf/ Omnilab</td>
			<td>
			5283611/ 5283611</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			pH-electrode</td>
			<td>
			Schott</td>
			<td>
			pH-Meter CG840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reaction tubes</td>
			<td>
			Roth</td>
			<td>
			E518.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			scale</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 3202 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			stirred tank bioreactor with equipment</td>
			<td>
			Applikon Biotechnology</td>
			<td>
			2L Bioreactor set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			syringe</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Combitips Plus 5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Reagents:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Name of the reagent</td>
			<td>
			Company </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Acetic acid</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose monohydrate, (&alpha;-D-)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrochloride acid (37 % w/v)</td>
			<td>
			Fiedel-de Ha&euml;n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrous magnesium silicate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Monopotassium phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			o-dianoisidine dihydrochloride</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Peroxidase (Typ II from horseradish)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium acetate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium hydroxide</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sucrose, D-(+)</td>
			<td>
			Fluka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Water (deionized)</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Solutions and Medium Composition:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Solution</td>
			<td>
			Components</td>
			<td>
			Amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)</td>
			<td>
			Sodium acetate
			Bring to volume with deionized water
			Adjust at pH 6.5 with acetic acid</td>
			<td>
			4.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			Monopotassium phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			6.805 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			7.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)</td>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			61.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			0.05M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			1.65 M sucrose solution</td>
			<td>
			D-(+)-sucrose
			Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			564.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reagent solution</td>
			<td>
			o-Dianisidin-Dihydrochlorid
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			25 mg
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose reagent solution</td>
			<td>
			Glucose oxidase
			Peroxidase
			Phosphate buffer (pH 7.0)
			reagent solution</td>
			<td>
			10.5 mg
			3 mg
			90 mL
			10 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

El hongo filamentoso A. niger es una cepa muy utilizado en una amplia gama de procesos industriales de alimentos para la industria farmacéutica. Una de las características más intrigantes ya veces incontrolable, de este organismo filamentoso es su morfología compleja. Se extiende desde densos gránulos esféricos a viscoso micelio (Figura 1). Varios parámetros de proceso y los ingredientes se sabe que influyen en la morfología de hongos 1. Desde una óptima productividad se correlaciona fuertemente con una forma morfológica específica, la morfología de hongos a menudo representa un cuello de botella de la productividad en la producción industrial. Un enfoque sencillo y elegante para controlar con precisión la forma morfológica es la adición de partículas inorgánicas insolubles micro (como silicato de magnesio hidratado, óxido de aluminio u óxido de titanio silicato) al medio de cultivo que contribuye a la producción de enzimas aumentó 2-6. Dado que no hay una obvcorrelación entre pagarés morfología de las partículas de micro dependiente y la producción de enzimas que es deseable para vincular matemáticamente la productividad y la apariencia morfológica. Por lo tanto una descripción morfológica cuantitativa precisa e integral está dirigido. Por lo tanto, se presenta un método para generar y caracterizar micro partículas morfológicas estructuras dependientes y correlacionar la morfología de hongos con la productividad (Figura 1), que posiblemente contribuye a una mejor comprensión de la morfogénesis de microorganismos filamentosos. La cepa recombinante A. niger SKAn1015 se cultiva durante 72 horas en una L 3 biorreactor de tanque agitado. Mediante la adición de talco micro partículas en concentraciones de 1 g / l, 3 g / L y 10 g / l antes de la inoculación de una variedad de estructuras morfológicas se reproducible generado. Muestras estériles se toman después de 24 horas, 48 ​​y 72 para la determinación del progreso del crecimiento y la actividad de la enzima producida. Laproducto formado es la enzima de alto valor β-fructofuranosidasa, un biocatalizador importante para el neo-azúcar formación en los alimentos o la industria farmacéutica, que cataliza la reacción entre otros de la sacarosa en glucosa 7-9. Por lo tanto, la cuantificación de glucosa después de la adición de sacarosa implica la cantidad de β-fructofuranosidasa producida. Cuantificación de glucosa se ​​realiza por un DIOS / POD Ensayo-10, que está modificado para análisis de alto rendimiento en placas de titulación de 96 pocillos de micro. Morfología hongos después de 72 horas se examinaron al microscopio y se caracteriza por análisis de imagen digital. De este modo, los factores de forma de la partícula de la morfología de hongos, como la macro diámetro de Feret, el área proyectada, el perímetro, la circularidad, la relación de aspecto, solidez und redondez se calculan con la fuente abierta de procesamiento de imágenes ImageJ programa. Los parámetros relevantes se combinaron para un número adimensional Morfología (Mn) 11, que permite una caracterización completa demorfología de hongos. La estrecha relación del número de morfología y de la productividad se destacan por regresión matemática.

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Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Un método para generar con precisión y para caracterizar exhaustivamente la morfología de hongos filamentosos<em&gt; Aspergillus niger</em&gt; Se describe, que permite la correlación matemática de aspecto morfológico y la productividad.

La personalización de Aspergillus niger Morfología través de la adición de talco micro partículas

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

19.0K vistas.  Technische Universität Braunschweig. Un método para generar con precisión y para caracterizar exhaustivamente la morfología de hongos filamentosos Aspergillus niger Se describe, que permite la correlación matemática de aspecto morfológico y la productividad.

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

La detección de nanopartículas fluorescentes Interacciones con inmunodeficiencia primaria subpoblaciones celulares por citometría de flujo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Producción de partículas Pseudotyped estudiar coronavirus altamente patógena en un ambiente de nivel 2 de bioseguridad

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Medición de la fagocitosis de Aspergillus fumigatus Conidia por leucocitos humanos utilizando citometría de flujo

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infección De Larvas De Pez Cebra Con Esporas De Aspergillus Para El Análisis De Las Interacciones Huésped-Patógeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

Aprendizaje automático supervisado para la semi-cuantificación del ADN extracelular en glomerulonefritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Fecal (micro) RNA Isolation

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs from fecal samples of animal and human subjects. The aim is to isolate total RNA with high purity and quantity for downstream analyses such as RNA sequencing, RT-PCR, and micro-array. The advantages of this optimized protocol in the miRNA isolation are capabilities of isolating highly purified RNA products with additional washing steps described, increased quantity of RNA obtained with an improved method in the resuspension of sample, and important tips of decontamination. One limitation is the inability to process and purify larger sample of more than 200 mg as these sample sizes would cause a difficulty in the clear formation of the interphase. Consequently, the large sample size may contaminate the aqueous phase to be extracted as described in the protocol with organic matters that affect the quality of RNA isolated in the end. However, RNA isolates from a sample of up to 200 mg are sufficient for most of downstream analyses.

Fecal micro RNA Isolation

This protocol isolates high quality total RNA from fecal samples of animal and human subjects. A commercial miRNA isolation kit is used with significant adaption to isolate pure RNA with optimized quantity and quality. The RNA isolates are good for most downstream RNA assays such as sequencing, micro-array, and RT-PCR.

Aislamiento de (micro) ARN fecal

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

Análisis cuantitativo basado en microscopía de escaneo láser confocal de la distribución de conidios de Aspergillus fumigatus en pulmón de ratón ópticamente despejado de montaje entero

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Análisis del SARS-CoV-2 mediante tecnología de doble reportero y multiplex

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Avance de estrategias antivirales a través de nuevas técnicas de inmunocaptura y espectrometría de masas

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

Perfil de epítopos de proteínas de superficie en partículas virales mediante la estrategia Multiplex Dual-Reporter

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...