Diese Arbeit wurde von der DFG-Exzellenzcluster &quot;Entzündung an Grenzflächen&quot; (RA-Falls, RA-D) unterstützt. Wir sind dankbar für die ausgezeichnete technische Unterstützung von Kristin Wischnat.

1. Vorbereitung von Chlamydia trachomatis Serovar D Lager <ol><li> Infect konfluente 175 cm 2 Zellkulturflasche mit HeLa-229 Zellen mit 4 ml C trachomatis D in SPG-Puffer. </li><li> Inkubieren Sie für 1 Stunde bei 37 ° C während ständigem Schütteln. </li><li> 20 ml DMEM mit 10% FCS und 240 ul Cycloheximid. </li><li> Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator für 48 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> 5 ml steriler Glasperlen, starkes Schütteln zu lösen und zu zerstören C. trachomatis beherbergen HeLa-229 Zellen. </li><li> Sammle Überstand und fügen Sie eine weitere 5 ml steriler Glasperlen. </li><li> Felsen dreimal für 1 min, alles zu zerstören HeLa-229 Zellen und Freisetzung C. trachomatis. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 1000 RPMI und 4 ° C zu beseitigen Zelltrümmer. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit für die Infektion von 8 bis 10 175 cm 2 Zellkulturflaschen konfluent grown mit HeLa 229-Zellen. </li><li> Inkubieren Sie jede Flasche mit 4 ml SPG-Puffer und 4 ml Überstand aus früheren Infektionen für eine Stunde bei 37 ° C unter ständigem Schütteln. </li><li> Nach einer Stunde mit 15 ml DMEM mit 10% FCS und 230 ul Cycloheximid nach 48 h Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 an. </li><li> 5 ml steriler Glasperlen, schütteln zu lösen und zu zerstören C. trachomatis beherbergen HeLa-229 Zellen. </li><li> Sammeln Sie den Überstand und fügen Sie eine weitere 5 ml steriler Glasperlen. </li><li> Felsen dreimal für 1 min, alles zu zerstören HeLa-229 Zellen und Freisetzung C. trachomatis. </li><li> Zentrifuge für 5 min bei 1000 RPMI bei 4 ° C zu beseitigen Zelltrümmer. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit. </li><li> Füllen Sie 40 ml Überstand in 50 ml Falcon-Röhrchen, Zentrifuge für 99 min mit 11000 RPMI. </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und Waschen des Pellets mit 1 ml SPG-Puffer. </li><li> Homogenisieren derPellet in 1 ml SPG und 20 ul Aliquot in einem 1, 5 ml Eppendorf-Röhrchen, Lagerung bei -70 ° C bis zur Verwendung. Biologische Aktivität der hergestellten Stammlösung wurde in einem etablierten HeLa-229 Zellinfektion Modell bestätigt. </li></ol> 2. Preparation of Human Eileiter <ol><li> Shop menschlichen Eileiter (HFT) von Frauen, die sich einer Hysterektomie unmittelbar nach der Operation in RPMI mit 5% FCS ohne Antibiotika in 4 ° C bis Vorbereitung. Das Protokoll wurde von der Ethikkommission der Universität zu Lübeck (09-153) genehmigt. Frauen in die Studie eingeschlossen (Alter 34 bis 53) hatte keine Geschichte vor C. trachomatis-Infektion. Gewebe der Eileiter wurde auf peripartalen Sterilisation auf Wunsch der Mutter während der Kaiserschnitte oder während Hysterektomien wegen symptomatischer Uterusmyome in der Lutealphase gesammelt. Alle HFT wurden negativ getestet C. trachomatis durch PCR. </li><li> Präparieren Sie die HFT in eine Petrischale mit RPMI mit5% FCS ohne Antibiotika. Während der gesamten Bearbeitung des Gewebes sollte in Medien ein Austrocknen zu verhindern untergetaucht werden. </li><li> Abgeschnitten und entsorgen Bindegewebe und Gewebe während der Operation zerstört. </li><li> Nach Dissektion öffnen Sie die HFT vorsichtig mit einem kleinen Skalpell. </li><li> Weitere Experimente vorzubereiten Gewebestücke in der Größe von 0,5 cm x 0,5 cm bis 1 cm × 1 cm. </li><li> Zur Infektion Shop HFT Probe in 1 ml RPMI mit 5% FCS ohne Antibiotika. HFT Proben wurden mit 5.5x10 5 IFU (inclusion forming units) von C infiziert trachomatis. </li><li> Inkubieren HFT Muster in 37 ° C, 5% CO 2 und 21% O 2 als auch in 37 ° C, 5% CO 2 und 2% O 2 für 24 Stunden. </li><li> Nach Inkubationszeit die Probe entnehmen und lagern in Monti Fixativ für mindestens drei Tage bei 4 ° C bis SEM / TEM Vorbereitung. </li></ol> 3. Vorbereitung der Proben für TEM-HFT <ol><li> FürTEM entfernen Probe aus Montis Fixiermittel und geschnitten 2 x 2 mm bis 4 x 5 mm große Stücke. Der verbleibende Gewebe für SEM verwendet werden. </li><li> Waschen Stücke mit Natriumcacodylatpuffer, pH 7,35 für 1 h. </li><li> Inkubieren in 1% (w / v) Osmiumtetroxid in Aqua dest. über Nacht. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Osmiumtetroxid durch Waschen 6x5 min in Natriumcacodylatpuffer, pH 7,35. </li><li> Entfernen Wasser durch Inkubation in steigenden Konzentrationen von Ethanol in Wasser (v / v) (30% für 2 h, 40% für 2 h, 50% für 2 h, 60% für 2 h, 70% über Nacht, 80% für 2 h, 90% für 1 h, 95% für 1 h, 100% für 1 h. </li><li> Auswaschen Ethanol für 2 x 15 min in Propylenoxid und anschließend zu einer Mischung von 50% (v / v) frisch hergestellt Araldit (einschließlich aller Komponenten) in Propylencarbonat übertragen und über Nacht inkubieren. </li><li> Transfer zum frisch zubereiteten Araldite (einschließlich aller Komponenten) für mindestens 1 h. </li><li> Transfer zum flachen Einbettformen und füllen mit Araldite. </li><li> Lassen Araldite aushärtenmindestens 48 h bei 60 ° C </li><li> Nach dem Trimmen von Embedded-Probe geschnitten halb Dünnschliffen (700 nm) auf einem Ultramikrotom Verwendung von Glas-Messer oder eine Histo Diamantmesser und Flecken mit Richardson-Färbung. </li><li> Schneiden Sie ultra-dünne Schnitte (ca. 70 nm) mit Hilfe einer Diamant-Messer und Transfer zum Kupfer-Grids (zB 150 quadratischen Maschen). </li><li> Stain ultradünne Schnitte mit 0,5% (w / v) Uranylacetat in Aqua dest. gefolgt von 3% (w / v) Bleicitrat in Aqua dest. in einem automatischen Abschnitt Stainer. Alternativ können Abschnitte manuell durch Verlassen Grids 15 min auf einem gesättigten zentrifugierten Lösung von Uranylacetat in Aqua dest gefärbt werden. gefolgt von 0,3% Bleicitrat (w / v) in Aqua dest. </li></ol> 4. Vorbereitung der Probe HFT für SEM <ol><li> Für SEM entfernen Probe von Monti Fixativ, orientieren mit Epithel nach oben auf einem 1,5 x 1 cm Korkplatte und fixieren Position mit Insekten-Nadeln. </li><li> Übertragen Probe auf Kork zu geeigneten Metall und KörbeWaschen für 30 Minuten in Natriumcacodylat, pH 7,35. </li><li> Entfernen Wasser durch Inkubieren Muster in steigender Konzentration von Aceton / Wasser-Mischungen (v / v) 30% für 6 h, 40% für 6 h, 60% für 8 h, 70% über Nacht, 80% für 2 h, 90% für 2 h und 100% über Nacht (äußerst vorsichtig sein, damit Probe kontinuierlich unter Wasser). </li><li> Transfer zum frischen 100% Aceton und trockenen Probe durch kritische Punkt-Trocknung (Temperatur 40 ° C, Druck 80 bar). </li><li> Entfernen Sie Nadeln, Kork und Leim Probe mit dem Epithel nach oben auf SEM Probenhalter mit einem leitfähigen Kohlenstoff Registerkarte mit leitfähigem Kohlenstoff Zement ausgestattet. Verwenden Sie flüssiges Leitsilber, um die Leitfähigkeit zwischen der Halterung und dem leitfähigen Kohlenstoff-Register zu verbessern. </li><li> Bereiten Sie eine leitende Platin, Gold oder Palladium-Beschichtung der Probe mit einem Sputtergerät. </li></ol> 5. Die Färbung der Semi Dünnschliffen mit Richardson-Färbung <ol><li> Lassen halb dünne Schnitte auf dem Objektträger trocken. </li><li> Stain Abschnitte mit Färbelösung bei 60 ° C für 1-2 min. </li><li> Waschen in Aqua dest. </li><li> Trockene Abschnitte und Deckglas. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Innerhalb des menschlichen Eileiter Infektionsmodell konnten wir Unterschiede in der epitheliale Morphologie zwischen den nicht-infizierten Kontrollen (Abbildung 1) und dem C visualisieren trachomatis - infizierten Röhren (Abbildung 2) unter normoxischen Zustand. Charakteristische morphologische Unterschiede impliziert Pathogen-induzierte Schwellung und Lyse der Eileiter Epithelzellen, die nicht in nicht-infizierten Kontrollen nachgewiesen werden konnte. Mit halb dünne Schnitte und Transmissions-Elektronenmikroskopie konnten wir nachweisen intrazellulären C trachomatis Einbeziehung Bildung in der ex vivo infiziert menschlichen Eileiter Gewebe (Abbildung 3, 5), aber nicht in nicht-infizierten Kontrollen (Abbildung 4). Als Sauerstoff-Konzentrationgen in den weiblichen Genitaltrakt sind bereits unter physiologischen Bedingungen 11, und weiteren Rückgang gering während eines entzündlichen Prozesses untersuchten wir auch unser Modell unter hypoxischen Bedingungen. Vorläufige Ergebnisse zeigen, das Modell ist nützlich, um Chlamydien-Wachstum und die Nachkommen unter verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen zu analysieren. Chlamydien-induzierten Epithelzellschädigung muss von Artefakten, die durch unvorsichtige Handhabung der Zubereitung und der Eileiter vor der Infektion (Abbildung 6) vermittelt werden, getrennt werden. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="1" /> Abbildung 1. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) eines nicht-infizierten menschlichen Eileiter nach einem Tag Inkubation in Medium-Steuerung (grüner Pfeil zeigt bewimperte Zelle, blauer Pfeil zeigen nicht-bewimperte Zelle). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="2" /> Abbildung 2. Rasterelektronenmikroskopie<html> Kopie (SEM) von einem Ex-vivo C. trachomatis infiziert menschlichen Eileiter 1 Tag nach der Infektion (weißer Pfeil rupturierten Inklusion). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Semi Dünnschliffe zeigen typische intrazelluläre Einschlüsse (weiße Pfeile) 1d nach der Infektion des menschlichen Eileiter mit C. trachomatis ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> 4. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) aus einem nicht-infizierten menschlichen Eileiter nach einem Tag Inkubation in Kontrollmedium. <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von einem Ex-vivo C. trachomatis infiziert menschlichen Eileiter 1 Tag nach der Infektion (weiße Pfeile markieren Chlamydien-Einschlüsse). ve_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="6" /> Abbildung 6. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) der Eileiter Epithel durch unvorsichtige Herstellung und Handhabung der Proben (weiße Pfeile markieren zerstört Epithelgewebe) beschädigt.

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	<li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping.">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li><li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility.">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li><li>Peipert, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Genital+chlamydial+infections.">Clinical practice. Genital chlamydial infections.</a> N. Engl. J. Med. 349, 2424-2430 (2003).</li><li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubal+factor+infertility,+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis.">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li><li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells.">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55 (2006).</li><li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells.">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li><li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+and+not+men:+differences+between+mouse+and+human+immunology.">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li><li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection.">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li><li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo.">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li><li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin.">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li><li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring.">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Visualisierung von Pathogen-induzierte Schädigung des infizierten Gewebes ist mühsam und oft beschränkt auf experimentelle Verfahren bei Mäusen. Wir gründeten eine ex-vivo Modell Infektion im menschlichen Eileiter zu analysieren C. trachomatis-Infektionen des oberen weiblichen Genitaltrakt. Durch die Verwendung dieses Verfahrens konnten wir C visualisieren trachomatis - induzierte Schäden an der menschlichen Eileiter Epithel innerhalb eines Tages nach der Infektion. Cellular Schwellung und Lyse waren typisch für morphologische Veränderungen, die in C beobachtet wurden, trachomatis - infizierten Eileiter, aber nicht in nicht-infizierten Kontrollen. TEM-Analysen zeigten, dass Chlamydien einen typischen intrazellulären Entwicklungszyklus implementieren innerhalb infizierten Geweben, welche große Einschlüsse mit Re-differenzierte elementaren Körper, sondern auch kleinere Einschlüsse mit erweiterten Retikularkörper, die Persistenz hinweisen könnten. Allerdings ist die morphologische Bild allein nicht ausreichen, um zwischen repl diskriminierenicating und persistierende Infektionen, die durch reduzierte Stoffwechsel charakterisiert sind und eine erhöhte Resistenz gegen antimikrobielle Substanzen 10. Die Zerstörung des Epithels in infizierten Eileiter ist entweder infolge der Unterbrechung des C. trachomatis - infizierten Epithelzellen nach Abschluss der intrazellulären Entwicklungszyklus und Freisetzung infektiöser elementaren Körper oder die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen 8. Pathogen Gewebeschädigung und Host-induzierte Immunreaktionen gegen C. trachomatis sollen die wichtigsten Faktoren, die zu einem Verlust von epithelialen Zell-Funktion, Fibroblasten-Umbau und schließlich Eileiterunfruchtbarkeit in vivo 8,11 sein. Eine der wichtigsten Grenzen dieses Modells ist die Abwesenheit von Entzündungszellen, die die Analyse der sekundären Effekte behindert auf die ursprüngliche C. trachomatis-Infektion der Eileiter Epithel. Jedoch ist das Modell apchenden an verschiedene Umweltbedingungen (zB Sauerstoffgehalt) und die erste Host-Immunantwort bei akuten C. untersuchen trachomatis-Infektionen 8,9. Weitere Pläne sind, um ein Modell zum Testen von Antibiotika gegen C. etablieren trachomatis in ganzen menschlichen Eileiter und die metabolische Zustände der verschiedenen Entwicklungsstadien im Epithel der Eileiter durch 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet zu charakterisieren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> PAA </td><td> E15-843 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> PAA </td><td> R15-802 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximid </td><td> Sigma - Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SPG-Puffer </td><td> verschiedene </td><td></td><td> siehe Rezept unten </td></tr><tr><td> Monti Fixativ </td><td> verschiedene </td><td></td><td> siehe Rezept unten </td></tr><tr><td> Natriumcacodylatpuffer </td><td> verschiedene </td><td></td><td> siehe Rezept unten </td></tr><tr><td> Richardson-Färbung </td><td> verschiedene </td><td></td><td> siehe Rezept unten </td></tr></tbody></table> Rezepte: 1. SPG-Puffer <ol><li> Fügen Sie 75 g Saccharose. </li><li> In 2,47 g Dinatriumphosphat. </li><li> In 0,36 g Mononatriumphosphat. </li><li> In 0,72 g Glutaminsäure. </li><li> Füllen Sie auf 1 l mit Aqua dest. </li><li> Der pH-Wert auf 7,3. </li></ol> 2. 0,1 M Natriumcacodylat, pH 7,35. <ol><li> In 42,80 g Dimethylarsensäure Natriumsalz. </li><li> In 68,46 g Saccharose. </li><li> Füllen Sie auf 1 l mit Aqua dest. bis 0,2 M Natriumcacodylatpuffer zu erhalten. </li><li> Vor dem Gebrauch verdünnten Lösung mit Aqua dest. auf die gewünschte Konzentration und pH-Einstellung auf 7,35, wenn nötig. </li></ol> 3. Monti Fixativ <ol><li> In 156 ml 0,12 M Natriumcacodylatpuffer. 3,2 25 ml 25% Glutardialdehyd in aqua dest. </li><li> Fügen Sie 19 ml10% Paraformaldehyd in Aqua dest. </li><li> 3 ml 3% CaCl 2 in aqua dest. </li><li> Der pH-Wert auf 7,35 und füllen mit Aqua dest. bis 312 ml Endlösung. </li></ol> 4. Richardson-Färbung <ol><li> Mischen Sie zu gleichen Teilen von 1% Methylenblau in 1% ige wässrige Lösung Borax und 1% Azur II in Aqua dest. </li></ol>

a human fallopian tube model for investigation of c. trachomatis infections

Genitale Infektionen mit Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) sind die häufigste sexuell übertragene Krankheit bei Frauen weltweit. Ineffiziente Clearance oder Persistenz der Erreger können zu aufsteigenden Infektionen der oberen Genitaltrakt und sollen chronisch entzündliche Schäden an infizierten Geweben verursachen 1,2 führen. Als Folge können schwere klinische Folgen wie Adnexitis (PID), Eileiter und Unfruchtbarkeit auftreten 3,4. Ein Großteil der Forschung mit C. trachomatis in Epithelzelllinien (z. B. HEp-2 Zellen und HeLa-229) oder an Mäusen durchgeführt. Wie bei Zellkultur-Modelle, während sie weder die Physiologie von nativem Gewebe noch die Pathophysiologie von C. trachomatis Genitaltrakt Infektionen in vivo 5. Weitere Einschränkungen sind durch die Tatsache gegeben, dass zentrale Signalkaskaden (zB IFN-γ mediated JAK / STAT-Signalweg), die intrazellulären Chlamydien-Wachstum zu kontrollieren grundsätzlich zwischen Mäusen und Menschen 6,7 unterscheiden. Wir und andere daher ein ganzes Organ Eileiter Modell, um direkte Interaktionen zwischen C untersuchen trachomatis und menschlichen Eileiter Zellen ex vivo 8,9. Zu diesem Zweck wurden humane Eileiter von Frauen, die sich Hysterektomie gesammelt und mit C infiziert trachomatis Serovar D. Innerhalb von 24 h nach Infektion, Probe analysiert, wo mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) auf Chlamydia trachomatis erkennen vermittelt epithelialen Schäden sowie C. trachomatis Einbeziehung Bildung im Eileiter Gewebe.

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A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Wir beschreiben ein<em&gt; Ex-vivo-Infektion</em&gt; Modell zur Visualisierung von direkten Interaktionen von bakteriellen Erregern mit menschlichen Eileiter Zellen. Die ganze Organgewebe Modell wurde gegründet, um zu untersuchen<em&gt; C trachomatis</em&gt; Induzierten Pathologie der weiblichen Eileiter unter &quot;lebensechte&quot; Bedingungen.

A Human Eileiter Modell zur Untersuchung der<em&gt; C trachomatis</em&gt; Infektionen

Genital tract infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) are the most frequent transmitted sexually disease in women worldwide. Inefficient ...

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JoVE Journal

Medicine

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

12.8K Aufrufe.  University of Lübeck. Wir beschreiben ein Ex-vivo-Infektion Modell zur Visualisierung von direkten Interaktionen von bakteriellen Erregern mit menschlichen Eileiter Zellen. Die ganze Organgewebe Modell wurde gegründet, um zu untersuchen C trachomatis Induzierten Pathologie der weiblichen Eileiter unter "lebensechte" Bedingungen.

Serie: A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Verarbeitung von Human Reduction Mammoplastik und Mastektomie Gewebe für die Zellkultur

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Forschung

Medizin

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Mausmodell der Wundheilung

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induktion von beschleunigter Atherosklerose bei Mäusen: Das "Wire-Injury"-Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxidative Phosphorylierung Kapazität im menschlichen Skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Tubal Cytology of the Fallopian Tube as a Promising Tool for Ovarian Cancer Early Detection

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to the lack of markers or tools for the ovarian cancer identification, the early detection of HGSC remains challenging. Direct sampling of the fallopian tube can enhance sensitivity for detection of neoplastic cells when the tumor is not grossly visible. We developed a procedure to collect fallopian tube cells directly from freshly received surgical specimens, which has shown excellent correlation with histological findings. This approach lays a foundation for the future utility of minimally invasive laparoscopic screening in high-risk patient populations.

We explored a tubal cytologic method by sampling the fallopian tube directly post-surgical excision as a tool of ovarian cancer early detection. Here, we present a protocol to collect fallopian tube cells from freshly received surgical specimens.

Tubal-Zytologie der Eileiter als vielversprechendes Werkzeug für Eierstockkrebs Früherkennung

Currently, it is widely accepted that the vast majority of ovarian high-grade serous carcinoma (HGSC) originate from the fallopian tube. However, due to ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely correlated with a history of articular cartilage damage and ligament avulsion. Surgical animal models of OA of the knee play an important role in understanding the onset and progression of post-traumatic OA and aid in the development of novel therapies for this disease. However, non-surgical models have been recently considered to avoid traumatic inflammation that could affect the evaluation of the intervention. 
In this study, an intra-articular cartilage lesion rat model induced by in vivo cyclic compressive loading was developed, which allowed researchers to (1) determine the optimal magnitude, speed, and duration of load that could cause focal cartilage damage; (2) assess post-traumatic spatiotemporal pathological changes in chondrocyte vitality; and (3) evaluate the histological expression of destructive or protective molecules that are involved in the adaptation and repair mechanisms against joint compressive loads. This report describes the experimental protocol for this novel cartilage lesion in a rat model.

Here, we present the cyclic loading-induced intra-articular cartilage lesion model of the rat knee, generated by 60 cyclic compressions over 20 N, resulting in damage to the femoral condylar cartilage in rats.

Eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung des zyklischen Belastungsinduzierten intraartikulären Knorpelläsionsmodells des Rattenknies

The pathophysiology of primary osteoarthritis (OA) remains unclear. However, a specific subclassification of OA in relatively younger age groups is likely ...