1. Chemischen Mutagenese Hinweis: Es wird festgestellt, dass die replikative Form RB zugänglicher chemische Mutagenese als die EB vorliegt. In der Mitte des Zyklus (zwischen 18 bis 20 hpi), sind bei der größten RBs Zahlen vor RB-EB Übergang. Weil Chlamydia trachomatis ist ein obligat intrazelluläre Erreger, können die Auswirkungen der Mutagen auf dem Host Gesundheit zu begrenzen Bakterienwachstum. Vero-Zellen erwiesen sich als widerstandsfähiger gegen die negativen Auswirkungen der hohen EMS als andere Zelllinien getestet. Segregation von Mutationen durch Rekombination erfordert die Auswahl für Antibiotika-resistente rekombinante Nachkommen. Wir empfehlen die Verwendung von Drogen-resistenten Stämme (z. B. Rifampicin, Spectinomycin oder Trimethoprim) zur Erzeugung von Mutanten für die Fähigkeit, rekombinante Analyse durchzuführen und isogenen Stämmen zu isolieren. Antibiotika-resistente Stämme wurden durch eine schrittweise Auswahl (15, 16) erzeugt wird. Nichte: Chlamydia trachomatis (Stamm L2 / 434/Bu / ATCC VR902B) ist BSL2 Erregers. Siehe institutionellen Standard Operating Procedures (SOP) für den Umgang mit solchen Erregern. <ol><li> Vorbereitung von kultivierten Zellen und Infektion: <ol><li> Seed etwa 1 x 10 6 Vero-Zellen (ATCC CCL-81) pro 25 cm 2 (T25) Kolben in 3 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Bei 37 ° C, 5% CO 2. Die Zellen sollten eine Monolayer innerhalb von 24 h zu bilden. </li><li> Saugen Medium. Infect konfluenten T25-Kolben von Vero-Zellen mit Chlamydia in einer Multiplizität der Infektion (moi) von 5 (~ 14 × 10 6) in einem Gesamtvolumen von 3 ml Medium (DMEM, 200 ng / ml Cycloheximid, 10% FBS). </li></ol></li><li> Beginnen Mutagenese auf 18 Stunden nach der Infektion (HPI): <ol><li> Es werden 20 mg / ml EMS (Ethylmethansulfonat) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,9 mM CalciumChlorid und 0,49 mM Magnesiumchlorid in einer chemischen Schutzhaube als EMS ist eine flüchtige Flüssigkeit. Hinweis: EMS ist ein potentes Mutagen und krebserregend. Neutralisieren EMS verschwenden und zu dekontaminieren, Leckagen, Kunststoff, Papier, Glas und mit 1 M Natriumhydroxid. </li><li> Saugen mittlere und waschen Sie die Zellen einmal mit 3 ml PBS / MgCl 2 / CaCl 2. Inkubieren Zellen mit 3 ml 20 mg / ml in PBS EMS / MgCl 2 / CaCl 2 für eine Stunde im Abzug bei Raumtemperatur. Vero-Zellen sind in der Lage, diese Konzentration von EMS und Bedingungen außerhalb des Inkubators für kurze Zeit überleben. Denken Sie daran, eine Kontrollprobe, der bisher nicht mutiert sind. </li><li> Entfernen Medium mit EMS und legen Sie sie in einen Behälter mit 1 M NaOH auf die Mutagen inaktivieren. Waschen infizierten Zellen 3 mal in 3 ml PBS + MgCl 2 / CaCl 2, um das restliche erbgutverändernd zu entfernen. In 6 ml DMEM/10% FBS mit 200 ng / ml Cycloheximid und 25 ug / ml Gentamicin, und Inkubation bei 5% CO <sub&gt; 2, 37 ° C für 48-72 h. Einschlüsse erscheinen frei von Bakterien etwa 36 Stunden nach der Mutagenese. Bei 72 h etwa 10% der Einschlüsse sind mit Bakterien gefüllt, während der Rest leer bleiben. </li><li> Auszug EBs durch hypotone Lyse: vollständig absaugen Medium. 1,0 ml H 2 O und Rock, um Zellen für 10 min zu entfernen. Lyse von Zellen und Abpipettieren für mindestens 10-mal. Sammle Lysat in einer Mikrofuge und fügen 0.250 ml 5x Saccharosephosphatsynthase Glutamat-Puffer (SPG), um es auf 1x Endkonzentration bringen. Lagerung bei -80 ° C. Hinweis: Die Höhe der Mutagenese durch die Induktion von Rifampin Widerstand bewertet. Zum Nachweis der Frequenz Rifampin Widerstand, Plaque 1 x 10 8 und 7 x 10-fache serielle Verdünnungen von Bakterien in Gegenwart von 200 ng / ml Rifampicin. Die Frequenz Rifampin Widerstand wird als die Anzahl von Rifampicin resistent Plaques Gesamtzahl der Bakterien überzogen, definiert. Siehe folgenden Abschnitt für die Plaque-Anweisungen. </li></ol></li></ol> 2. Geklonte Isolierung von Chlamydia trachomatis Mutanten durch Plaque-Reinigung <ol><li> Set konfluente Monoschichten von Vero-Zellen in 6-Well-Platten: Samen ~ 0,4 × 10 6 Zellen in 3 ml DMEM/10% FBS pro Vertiefung. Erlauben Zellen, um eine homogene Monoschicht über die nächsten 24 h zu bilden. </li><li> Auftauen Stammlösung mutagenisierter Chlamydia auf Eis. Führen 6 x 10-fach serielle Verdünnungen in einem Gesamtvolumen von 200 ul pro Verdünnung in DMEM/10% FBS und setzte sie auf dem Eis. Hinweis: Bakterielle Titer in die Aufnahme bildenden Einheiten (IFU) ist eine gute Schätzung der Plaque-bildende Einheiten (PFU). Richten Sie die Plaque 10, 100, und 1000 pfu. </li><li> Waschen Vero Zellen zweimal mit 3 ml PBS pro Vertiefung. </li><li> In 3 ml DMEM in jede Vertiefung für 6-Well-Platten und 100 ul der bakteriellen Verdünnungen in zweifacher Ausfertigung. Swirl die Platte sogar Mischung zu gewährleisten. </li><li> Spin infizierten Platten bei 2.700 xg für 30 min bei 15 ° C, dann bei 37 ° C in einer befeuchteten inkubieren,5% CO 2-Inkubator für 1-2 Std. </li><li> Bereiten 0,54% Agarose in DMEM (für 6 Wells): <ol><li> Fügen Sie die folgenden Zutaten: 18,9 ml kaltem 2x DMEM, 4,2 ml FBS, 0,42 ml 100x NEAA, 0,042 ml 200 ug / ml Cycloheximid, 0,021 ml 50mg/ml Gentamicin. Gut mischen. </li><li> Mix in 18,9 ml heißem sterilen 1,2% igen / H 2 O, Rühren, um Klumpen zu vermeiden. Mischung sollte handwarm. Halten Sie in einem warmen Wasserbad bei 55 ° C vor der Zugabe zu infizierten Zellen. </li></ol></li><li> Saugen Bakteriensuspension von Gerichten und gelten 6 ml 0,54% igen Agarose / DMEM pro Well. Erlauben Agarose vollständig erstarren bei Raumtemperatur außerhalb der Haube für 15 min. Trocknen Sie die Platten mit dem Deckel entfernt, in der Biosicherheit Haube für 15 min. Hinweis: Vibration aus der biologischen Einschlußglocke können die erstarrenden Agarose verzerren. </li><li> Bei 37 ° C in CO 2-Inkubator für 7-10 Tage. Plaques sichtbar sein soll mit Hilfe eines Binokular. (Refer bis 3 für ein typisches Bild von Plaques Abbildung.) </li><li> Ein Tag vor der Isolierung von Mutanten, seed 1 x 10 4 Vero-Zellen in 100 ul pro Vertiefung einer 96-Well-Platte. Zellen werden innerhalb von 24 h konfluent. </li><li> Mit einem Dissektionsmikroskop, zu markieren Plaques abgeholt werden. Sammle Stecker von Plaques mit einer sterilen 1,0 ml Barriere Pipettenspitze. </li><li> Resuspendieren Plaques in 100 ul DMEM mit 10% FBS, 400 ng / ml Cycloheximid, 50 ug / ml Gentamicin. </li><li> Um Mutanten zu erweitern, überlagern die Aussetzung auf konfluente Monolayer von Vero-Zellen. Spin Platten bei 2.700 xg, 15 ° C für 30 min. </li><li> Bei 37 ° C / 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. Ernte EBs, wenn&gt; 50% der Zellen infiziert sind, die auftreten, so früh wie 48 hpi und so spät wie 14 Tagen. Diese Menge an infizierten Zellen ermöglicht genügend lebensfähige Bakterien gespeichert werden. Mutant Stämme unterscheiden sich in Wachstumsraten und Infektiosität. Erlauben langsam wachsende Stämme naturally erneut infizieren benachbarte Zellen, bis genügend Zellen infiziert sind. </li><li> Auszug EBs durch hypotone Lyse von infizierten Zellen: <ol><li> Vollständig absaugen Medium. </li><li> In 160 ul sterilem Wasser. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Stören Zellen durch Auf-und Abpipettieren mehrmals, um eine vollständige Lyse zu gewährleisten, verwenden Barriere Tipps, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> Übertragen Sie 160 ul von Lysaten zu Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Mischen Sie in 40 ul 5x SPG. Lagerung bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Assay und Bildschirm Mutanten Phänotyp (e) von Interesse. </li></ol> 3. Whole Genome Sequencing von Selected Chlamydia Mutanten <ol><li> Extrahieren genomischer DNA aus Gradienten-gereinigten EBs, die weitgehend frei von verunreinigenden Wirts-DNA sind. Protokolle für große Kultur von Chlamydia und Reinigung von EBs in ref gefunden werden. (17). Verwenden kommerziellen genomische DNA Aufreinigungskits (zB Qiagen Katze. 69504) an extRACT DNA aus 2 x 10 9 Bakterien nach Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verwenden Sie ein Fluorometer (Qubit, Invitrogen Katze. Q32866) zur genauen Messung der DNA-Menge. 1-5 ug gereinigte DNA wird für die Illumina-Sequenzierung Plattform erforderlich. Hinweis: Mehrere Plattformen zu sequenzieren bakteriellen Genomen, einschließlich Illumina/Solexa- und Solid-Systemen verwendet werden. Wir entschieden uns, HiSeq (Illumina) verwenden, da es hohe Dichte von kurzen produziert, aber qualitativ hochwertigen Sequenzierung liest. Kleinere Skala Genom Sequencer, wie IonTorrent (Life Technologies) und MySeq (Illumina) eignen sich auch, und mehr als ausreichend für Multiplexen diese Sequenzierung von bis zu 4 Chlamydia Genome in einer Zeit, die die minimale Abdeckung von 25X übersteigt angemessene Genom Montage. Herstellung von DNA-Bibliotheken für die Sequenzierung Illumina Plattform beschrieben. </li><li> Fragment DNA entsprechende Größe (300-400 Basenpaar für Illumina Sequenzierung) unter Verwendung eines adaptiven Focused Acoustics S220 instrument (Covaris) nach dem vom Hersteller vorgeschlagenen Einstellungen. Hinweis: DNA-Fragmentierung durch Vernebelung Ergebnisse in größeren Verlust der Probe aufgrund Aerosolisierung Probe. </li><li> Bereiten Sie die genomische Sequenzierung Bibliotheken mit handelsüblichen Baukästen (Illumina FC-102-1001), folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Bibliotheken können indiziert mit Barcode-Primer (Illumina FC-121-1003), so dass mehrere Proben gepoolt werden können und gleichzeitig sequenziert werden. </li><li> Führen Sequenzierungsproben. Dieser Schritt wird in der Regel durch kommerzielle Dienste oder Kern von engagierten technischen Personals betrieben durchgeführt. Folgen Sie ihre Verfahren und Empfehlungen. </li><li> Illumina liest (FASTQ Format) können mit einer Referenz-Genom mit benutzerfreundliche grafische Benutzeroberfläche Software zusammengesetzt werden, wie Geneious (Biomatters), die auch für die SNP / Mutation Identifizierung verwendet werden. Zur Karte Mutationen, parametriert zu 90% für minimale Variante Frequenz und 50X für Mindestdeckung. Offene SOURCe Genom Monteure wie MAQ (18) und BWA (19), können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Bestätigen Mutationen durch Sanger-Sequenzierung nutzen genomischer DNA als Matrize für die PCR-Amplifikation von 300-500 bp flankierenden Regionen identifiziert Mutationen und Sequenz gereinigt oder verdünnt (1:20) PCR-Produkte durch Sanger-Sequenzierung. </li></ol> 4. Generierung von Chlamydia Rekombinanten Hinweis: Chlamydia kann DNA während der Infektion austauschen, können die zur Erzeugung von rekombinanten Stämme (12, 13, 20). Nach der Co-Infektion von Zellen mit zwei einzigartigen Antibiotika-resistente Stämme, rekombinant &quot;Nachkommen&quot; für Dual Antibiotikaresistenz (12, 13). Wir nutzten dieses Phänomen, um Mutationen zu trennen und die Zusammenarbeit isogenen Stämmen zu erzeugen. Daher wurden Mutanten in antibiotikaresistenten Hintergrund erzeugt (z. B. Rifampicin Widerstand (R rif) H471Y in CTL0567 (rpoB)), so dass sie mit dem Wildtyp-Stamm bearin überquert werden kann,ga verschiedenen Antibiotika-resistente Allel (zB Spectinomycinresistenz (SPC R), G1197A in r01/r02 (16sRNA kopiert 1 und 2)). Angaben zur DNA Austausch und die Rekombination in Chlamydia, um Referenzen (12, 13) beziehen. <ol><li> Co-infizieren Wildtyp und Mutante klonale Stämme durch centrifuging6 x 10 5 Bakterien aus jedem Stamm auf konfluente Monolayer von Vero-Zellen auf einer 24-Well-Platte gewachsen. Parallel infizieren Monoschichten mit jedem Stamm allein. </li><li> Mit 44 hpi, Ernte EBs durch hypotone Lyse von infizierten Zellen: <ol><li> Vollständig absaugen Medium. </li><li> In 0,4 ml steriles Wasser und lassen Sie stehen für 10 min. </li><li> Lyse Zellen durch kräftiges Pipettieren up &amp; down für mindestens 10-mal. Transfer-Lysate zu einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Mischen in 0,1 ml 5x SPG eine Endkonzentration von 1x SPG. </li><li> Rohlysaten kann sofort verwendet werden oder bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Plaque 50 ul des rohen EB preps eind 5 x 1.10 serielle Verdünnungen in Agarose / DMEM ergänzt mit geeigneten Antibiotika für Rekombinanten auszuwählen. (Siehe Tabelle für typische Konzentrationen von Antibiotika zur Selektion von Rekombinanten.) </li><li> Plaque reinigen und bereichern rekombinanten Stämme wie oben. Ergebnis Rekombinanten Anwesenheit oder Abwesenheit des gewünschten Phänotyp. Extrahieren von DNA aus rekombinanten Stämmen von DNAzol Behandlung (nächster Abschnitt) zur Genotypisierung auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Mutationen. </li><li> Kreuze mit anderen Stämme tragen Antibiotikaresistenzmarkern weiter trennen Mutationen und erzeugen isogenen Stämmen wiederholt werden. Co-infizieren ausgewählten Rekombinanten zu einem anderen Wildtyp-Stamm mit einer unterschiedlichen Antibiotika-Marker. </li></ol> Tabelle 1: Antibiotika-Konzentrationen für die Selektion von Rekombinanten: <table border="1"><tbody><tr><th> Endkonzentration </th><th> Anweisungen für die Zubereitung </th></tr><tr><td> 200 ng / ml Rifampicin </td&gt; <td> Machen Sie 25 mg / ml Lagerung Lager in Dimethylsulfoxid (DMSO). Make-up 200 ug / ml Arbeitslösung durch Verdünnen der Lagerung Lager mit H 2 O. Lagerung bei -20 ° C in der Dunkelheit. </td></tr><tr><td> 200 ug / ml Trimethoprim </td><td> Machen Sie eine 100 mg / ml in DMSO Lager. Lagerung bei -20 ° C </td></tr><tr><td> 200 ug / ml Spectinomycin </td><td> Machen Sie eine 100 mg / ml in Wasser stock in 100 ul Aliquots. Lagerung bei -20 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. </td></tr></tbody></table> 5. Extraktion genomischer DNA aus rekombinanten Stämmen zur Genotypisierung Hinweis: Spaltenbasierte Aufreinigungskits können ebenfalls verwendet werden. Ein Vorteil der DNA-Extraktion durch DNAzol Behandlung kosten. <ol><li> Infect 1,2 x 10 5 Chlamydien auf Einzelschichten von Vero-Zellen in 12-well Platten kultiviert. </li><li> Bei 36-48 hpi absaugen Medium und fügen 0,375 ml DNAzol (Invitrogen 10503-027). Vorsichtig geschwenkt, die Zellen und die Pipette lysates in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Niederschlag DNA durch Zugabe von 0.188 ml 100% Ethanol. Durch Umdrehen mischen. </li><li> Auszug DNA von Spulen mit einer Pipettenspitze und legen Sie sie in ein sauberes Röhrchen. Alternativ Pellet die DNA durch Zentrifugation bei Höchstgeschwindigkeit für 2 min bei Raumtemperatur oder 4 ° C, und dekantieren. </li><li> Waschen DNA auszufällen zweimal mit 1,0 ml 75% Ethanol. </li><li> Air-dry DNA nach dem Entfernen des Ethanol für 15 Sekunden. </li><li> Löslich DNA mit 0,2 ml 8 mM NaOH auf pH 8,0 neutralisiert mit 20,2 ul 0,1 M HEPES. Bringt bis zu einem Gesamtvolumen von 0,5 ml mit Wasser oder TE. Alternativ resuspendieren DNA in TE-Puffer (DNA-Pellet nicht vollständig. Gelöst). </li><li> Verwenden DNAzol extrahierten DNA als Matrize für die PCR-Amplifikation von 300-500 bp flankierenden Regionen identifiziert Mutationen. Sequence gereinigt oder verdünnt (1:20) PCR-Produkte durch Sanger-Sequenzierung. </li></ol>

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Es gibt nichts zu offenbaren.

Diese Methode entspricht den grundlegenden Anforderungen für die genetische Analyse, wie es Verbindung zwischen Genotypen und Phänotypen herstellt. Wichtig ist, dass diese ohne Hilfe üblicher molekulare Werkzeuge für die rekombinante DNA-Transformation und Insertions-Inaktivierung von Genen in Bakterien, die oft eine geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der Analyse der Genfunktion in nicht-Modell Mikroben erreicht. Ein kritischer Schritt ist Klonalitätsanalyse von plaquegereinigt Muta...

Die obligat intrazelluläre Bakterium Chlamydia trachomatis Konten für schätzungsweise 2,8 Millionen Genitaltrakt Infektionen pro Jahr in den Vereinigten Staaten (Center for Disease Control) mit assoziierten Folgeerkrankungen wie Adnexitis, ektope Schwangerschaften und Unfruchtbarkeit (1). Chlamydia spp haben eine einzigartige Physiologie mit einem zweiphasigen Entwicklungszyklus bestehend aus zwei Formen: die ansteckende, aber nicht-replizierenden elementaren Körper (EB) und der infektiösen aber replikativen reticulate Körper (RB). Infektion beginnt mit der Befestigung der EBs Epithelzellen durch endoctyotosis (2). Innerhalb einer membrangebundenen Vakuole bezeichnet eine Aufnahme, EBS in die RB Form, die dann repliziert durch binäre Spaltung unterscheiden. In der Mitte des Zyklus, RBs Übergänge zurück in EBs, die dann in den extrazellulären Raum ausgestoßen werden, um neue Runden der Infektion zu initiieren, wenn die Wirtszelle lysiert (3). C. trachomatis istrefraktär Routinemanipulation mit Standard molekulargenetische Werkzeuge, wie gezielte Gen-Ersatz, Transposons und Transduzieren Phagen, die von zentraler Bedeutung für die meisten Studien in Bakteriengenetik haben, ist es unklar, in welchem ​​Umfang einzelne Chlamydia Gene tragen zur Umgehung der angeborenen Immunität , Nährstoff Erwerb, Entwicklung Übergänge oder andere Prozesse wichtig für das Überleben des Erregers in einem eukaryotischen Wirt (4). Folglich bleibt diese Erreger schlecht charakterisiert trotz ihrer klinischen Bedeutung. Die Genome von Chlamydia spp. sind relativ klein (~ 1 Mb) (5) mit mehreren Arten und Biovare sequenziert mit Next Generation Sequencing-Technologien. Vergleichende Genomanalyse von WGS hat einzigartige Einblicke in die Evolution der Chlamydien-Arten und ihre Anpassung an den Menschen (6-8) und in gewissem Umfang zur Verfügung gestellt hat einige Informationen zur Verfügung gestellt, um das Potenzial in Abhängigkeit von Virulenzfaktoren (9, 10). Ter genetischen Vielfalt von klinischen Isolaten angezeigt nicht die Auflösung erforderlich ist, um systematisch Karte die Funktion der meisten Virulenzfaktoren, vermutlich, weil Mutationen in solchen Genen wäre leicht gegen ausgewählt haben. Ohne verwirrende Effekte aus natürlichen Selektion, erbgutverändernd-induced gene Variante mit definierten Tests, die Maßnahme Mängel in der Virulenz, das Spektrum von Mutationen, die befragt werden können, erweitern können gekoppelt. Chemische Mutagene, insbesondere, sind nützlich, da sie null, bedingten, hypomorphen (reduzierter Funktion) zu erzeugen, und hypermorphic (gain of function) Allele. Mit der Ankunft der robusten nächsten Generation Genom-Sequenzierung Technologien können solche Mutationen leicht identifiziert werden und kartiert. Auf diese Weise können starke Assoziationen zwischen Mutationen in einem Gen oder einer genetischen Weg und einem gemeinsamen Phänotyp gebildet werden, wodurch die Anwendung von Vorwärts genetische Ansätze. Die Genomsequenzen von klinischen Stämmen offenbarte mosaicism bwischen Serovare und loci der häufigen Rekombination (11). Empirische Daten der Rekombination wurde durch Co-Infektion von zwei verschiedenen Antibiotika-resistenten Stämmen und Selektion resistenter Dual rekombinanten Nachkommenschaft, die offenbarte genetischen Beiträge von beiden Stämme (12, 13) nachgewiesen. Somit ermöglicht genetischen Austausch zwischen Wildtyp und Mutanten in einem Ko-Infektion Einstellung Trennung von chemisch induzierten Mutationen, die betroffene Gen, das den beobachteten Phänotyp führt zu lokalisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese, WGS, und ein System für die DNA-Austausch innerhalb infizierter Zellen (14) (Abbildung 1) durchzuführen.

<table border="0" cellspacing="0" cols="4">
	<colgroup width="291">
	</colgroup>
	<colgroup width="123">
	</colgroup>
	<colgroup width="144">
	</colgroup>
	<colgroup width="84">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate (EMS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water (sterile, tissue culture grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential amino acids (NEAA)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.2% GTG Agarose , autoclaved</td>
			<td>Lonzo</td>
			<td>50070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA purification kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10503-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 mM NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemical safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#62;Dissection microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer (Qubit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptive Focused Acoustics S220 instrument</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forward genetic approaches in chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, der Erreger von sexuell übertragbaren Krankheiten und Augeninfektionen bleibt schlecht aufgrund seiner Unnachgiebigkeit der experimentellen Transformation dadurch mit rekombinanten DNA. Wir entwickelten einen Ansatz zur genetischen Analyse in C durchführen trachomatis trotz der fehlenden molekulargenetischen Werkzeugen. Unsere Methode beinhaltet: i) chemische Mutagenese schnell generieren umfangreiche Bibliotheken von genetisch definierten Mutanten mit unterschiedlichen Phänotypen, ii) Whole-Genome Sequencing (WGS), um die zugrunde liegenden genetischen Läsionen abzubilden und Assoziationen zwischen mutierten Gens (s) zu finden und.. eine gemeinsame Phänotyp;. iii) Generierung von rekombinanten Stämmen durch Co-Infektion von Säugerzellen mit Mutante und Wildtyp Bakterien. Dementsprechend konnten wir kausalen Beziehungen zwischen Genotypen und Phänotypen zu etablieren. Die Kopplung von chemisch-induzierte Gen Variation und WGS zu etablieren Korrelat Genotyp-Phänotyp-Assoziationen Should im Großen und Ganzen für die große Liste von medizinisch und ökologisch wichtige Mikroorganismen derzeit unlösbar zu genetischen Analyse.

Die Exposition gegenüber erbgutverändernd führt zu Einschlüssen, die frei von Bakterien, vermutlich wegen der bakteriellen Zelltod erscheinen. Typischerweise wird Serovar LGV-L2 vollständig lysieren infizierten Zellen innerhalb von 48 h nach der Infektion, aber die Behandlung mit Mutagene können diesen Zyklus auf&gt; 90 Stunden zu verlängern. Rund 10% der Einschlüsse werden erwartet zu erholen. In unseren Experimenten infizierten Vero-Zellen mit 20 mg / ml behandelt EMS führte zu einem 99% igen Rückgang bei de...

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Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Wir beschreiben eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese und Sequenzierung des gesamten Genoms basiert durchzuführen. Außerdem wird ein System zum Austausch DNA in infizierten Zellen beschrieben, die für die genetische Kartierung verwendet werden. Diese Methode ist breit anwendbar zu mikrobiellen Systemen fehlt Transformation Systeme und molekulargenetische Werkzeuge.

Vorwärts Genetische Ansätze in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

forward-genetic-approaches-in-chlamydia-trachomatis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

12.8K Aufrufe.  Duke University Medical Center.  Wir beschreiben eine Methode zur Genanalyse in Chlamydia auf chemische Mutagenese und Sequenzierung des gesamten Genoms basiert durchzuführen. Außerdem wird ein System zum Austausch DNA in infizierten Zellen beschrieben, die für die genetische Kartierung verwendet werden. Diese Methode ist breit anwendbar zu mikrobiellen Systemen fehlt Transformation Systeme und molekulargenetische Werkzeuge. 

Serie: Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Ein genetischer Screen zu isolieren Toxoplasma gondii Host-Zelle Egress Mutanten

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetische Manipulation in<em&gt; Δku80</em&gt; Die Stämme für Funktionelle Genomanalyse<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

VIGS-vermittelte Stürmer Genetics Screening zur Identifizierung von Genen in Nichtwirtresistenz Beteiligte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Verwendung Fluoreszierende Proteine, zu visualisieren und zu quantifizieren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vakuole Wachstumsdynamik in lebenden Zellen

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

Zukunfts Genetics Screens Mit Makrophagen zu identifizieren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gene wichtig für die Resistenz gegenüber IFN-γ-abhängige Zell autonome Immunität

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phage Phenomics: Physiologische Ansätze zur Charakterisierung Novel virale Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

A Simple Red Blood Cell Lysis Verfahren zur Etablierung von B Lymphoblastoidzelllinien

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

Eine effiziente und einfache Methode, NK und T-Zell-Linien von Patienten mit chronischen aktiven Epstein - Barr-Virus-Infektion zu etablieren

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.