Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (KA1270/3-1/2) und BONFOR (O-112,0040) unterstützt.

Ein. Tiere Männliche C57Bl6 / J-Mäusen mit einem mittleren Gewicht von 25 g wurden von Harlan Winkelmann (Borchen, Deutschland) erhalten. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Bundesgesetz über den Schutz von Tieren durchgeführt. Die Grundsätze der Labor animal care folgten. Die Tiere wurden auf einer 12-Stunden Licht / Dunkel-Zyklus gehalten und mit handelsüblichen Nagetierfutter und Leitungswasser ad libitum. Die Tiere sollten mindestens 7 Tage nach der Ankunft in Ihrem Tier Anlage vor Experimenten untergebracht werden. Beachten Sie, dass alle Experimente leicht an Ratten oder andere Arten angepasst werden und mit leichten Modifikationen in großen Tiermodellen. 2. Operative Verfahren <ol><li> Anästhesie induziert wird und mit Isofluran (Abbott, Wiesbaden, Deutschland) in Sauerstoff aufrechterhalten wird. Nach Beginn der Anästhesie statt Tiere in Rückenlage und fix Extremitäten mit Klebeband (Leukosilk, Beiersdorf, Hamburg, Deutschland). </li&gt; <li> Nach der Rasur und chirurgischen Desinfektion der Bauchwand Bauchschnitt ein Medianwert ist auf einer Länge von 2 Zentimetern durchgeführt. Geben Sie die Bauchhöhle über einen Schnitt entlang der Linea alba. Legen Sie zwei sterile Retraktoren zu halten das Abdomen offen. Sorgfältig eventerate den Dünndarm nach links und legen Sie es auf einem nassen Wattebausch. </li><li> Evakuierung der gesamten Dünndarms luminalen Inhalte mit zwei feuchten und sterilen Watteträger (MaiMed, Neunkirchen, Deutschland) durch gleichzeitiges Walzen der Applikator aus dem Pylorus zum Blinddarm. VORSICHT: Vermeiden Sie Blutungen des Dünndarms Wand oder Läsionen der Darm Schiffe. Setzen Sie den Darm wieder in der peritonealen Höhle ohne Verdrehen Ischämie oder mechanische Behinderung zu verhindern und schließen Sie den Bauchschnitt mit einem Zwei-Schicht kontinuierliche 5/0 Polyamid nicht resorbierbares Nahtmaterial (Ethicon, Norderstedt, Deutschland). </li></ol> 3. Postoperative Pflege <ol><li> Nach dem Eingriff platzieren das Tier unter einer Wärmelampe, observing, bis es aus der Narkose erholt. Legen Sie die Maus wieder in seinem Käfig und den Zugang zu Wasser und Nahrung. Aufgrund der Eigenschaft von Opioiden zur Peristaltik beeinflussen, führen wir perioperative Analgesie mit NSAIDs (z. B. Metamizol) in Trinkwasser. </li></ol> 4. Funktionelle Studien 24 Stunden nach IM <ol class="lalpha"><li> Magen-Darm-Transit (GIT) <ol><li> Betäuben Mäusen leicht mit Isofluran in Sauerstoff 22,5 Stunden nach IM. Sorgfältig überstreckt den Kopf der Maus und ziehen Sie die Zunge mit einer stumpfen Pinzette. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit mindestens 100 ul Fluorescein-markiertem Dextran (FITC-Dextran, 70.000 MW, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Deutschland), verbinden Sie es mit einem arteriellen Katheter (Vygon, Ecouen, Frankreich) und sorgfältig den Katheter ein Magensonde in den Magen. </li><li> Kurz injizieren 100 ul FITC-Dextran und ziehen Sie den Katheter. Lassen Sie das Tier wach und warten 90 min. Während dieser Zeit Mäuse haben Zugang zu Nahrung oder Wasser. &lt;/ Li&gt; <li> Bereiten fünfzehn 2 ml Spinnhülsen und kennzeichnen sie nacheinander. </li><li> Einschläfern Mäusen 90 min nach der Magensonde und entfernen Sie den gesamten Magen-Darm-Trakt vom Magen bis zum Rektum. Setzen Sie den Darm auf einen Polystyrol-Pad und vermeiden Stretching. CAVE: Es ist wichtig, den Darm entfernen sanft zu vermeiden Verschiebung der Flüssigkeit FITC-Dextran in den nahe gelegenen Segment. Für den Beginn könnte es hilfreich, um Clips am Anfang und am Ende eines jeden Segments zu verwenden. </li><li> Messen volle Länge des Dünndarms und in voller Länge des Dickdarms. Teilen Sie den Dünndarm in 10 gleich große Segmente durch Pinning es auf die Polystyrol-Pad mit Kanülen. Teilen Sie den Doppelpunkt in 3 Segmente. Sie haben 15 Segmente (Magen # 1), zehn gleich große kleine Darmabschnitte (# 2-11), Blinddarm (# 12) und drei 3 gleich große Kolon Segmente (# 13-15) vorbereitet. </li><li> Transekt den Darm an den markierten Stellen, greifen sie mit einer Pinzette und spülen Sie diese einmal mit 1,0 ml KHB in die zuvor vorbereiteten KHB containing 2,0 ml Röhrchen und Vortex kräftig für 20 Sekunden. Der Magen und Blinddarm direkt und platziert geschnitten in die vorbereiteten Röhrchen. Füllen Sie diese Röhrchen mit 1,0 ml KHB, wodurch Spülen Spuren von luminalen Inhalte aus der Schere in die Rohre. </li><li> Zentrifugieren der Sonden bei 12.000 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur in einer Tischzentrifuge. Während der Zentrifugation vorzubereiten weitere 15 durchnummeriert 1,5 ml Röhrchen. </li><li> Übertragen Sie die klaren Überstände in die neue 1,5 ml-Tube und dunkel lagern bei 4 ° C bis zur Analyse (nächster Schritt). Die Sonden können über mehrere Tage bei 4 ° C ohne wesentlichen Verlust von FITC-Signal gespeichert werden. Für eine längere Lagerung hinzuzufügen 0,09% Natrium-Azid oder Shop bei &lt;-18 ° C. </li><li> Je 100 ul Duolen der Überstände auf einem schwarzen 96-Well-Platte (Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland). Pipette zwei 100 ul Proben von KHB als leer. </li><li> Lesen Sie die Platte in einem Fluoreszenz-Reader (Safire, Tecan, Crailsheim, Deutschland) und Quantifizierung der fluorescence bei 494 nm (Absorption) / 521 nm (Emission) Wellenlänge. Subtrahieren leere Werte von Proben. </li><li> Berechnen den geometrischen Mittelpunkt (GC) von FITC-Dextran Verteilung, die eigentlich der Schwerpunkt für die Verteilung des Markers, die durch die folgende Formel: GC = Σ (% der gesamten Fluoreszenzsignal pro Segment Segmentnummer *) / 100 </li></ol> Anmerkung: Durch Multiplizieren Prozentsatz der Fluoreszenz jedes Segment mit seiner Segmentnummer ein gewichteter Mittelwert der Verteilung der Marker innerhalb des Darms wird beurteilt. Dieser Punkt wird sowohl durch die Verteilung und Entfernung von Marker Paar beeinflusst, sondern übernimmt keine spezifische zugrundeliegenden Verteilung. 7 Der berechnete Wert GC oft in Kombination mit einem Graph, der die Verteilung von FITC-Dextran über den Gastrointestinaltrakt (1A) dargestellt. </li><li> Colonic Transit <ol><li> Mäuse sollten schwach narkotisiert mit isoflurane 2% Sauerstoff. ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass das Tier weckt innerhalb von 40 sek. </li><li> Sorgfältig prüfen Kolon Durchgängigkeit durch Einfügen einer Fistel-Sonde (Metallstange, 2 mm Durchmesser) durch den Anus in den Darm. </li><li> Mit der Fistel-Sonde voranzutreiben eine 2 mm Glaskugel 3 cm in den Dickdarm und ziehen Sie die Sonde sofort. Platzieren Sie die Maus in einem durchsichtigen Käfig und Messen der Zeit nach der Fistel-Sonde wurde aus dem Darm gezogen. Halten Sie ein Auge auf die Maus und stoppen Sie die Zeit direkt nach der Glaskugel wurde ausgeschieden. </li></ol></li></ol> 5. Histochemische Analyse von isolierten ME Proben <ol><li> Midjejunal Segmente aus dem Darm geschnitten und in kaltem KHB in einem Sylgard gefüllte Schale. </li><li> Mesenterium in die Schale mit 0,2 mm Insekten Nadeln (Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland) merken. </li><li> Schneiden Sie das Segment entlang der mesenterialen Grenze und strecken, um ~ 120% seiner Länge und Breite. Schließen Sie die Fixierung mit InsektenStifte auf gegenüberliegenden Seite der Mesenterium. Spülen Sie die Sylgard Gericht sorgfältig mit frischem eiskaltem KHB, wodurch Spülen aller luminalen Inhalte. ME können jetzt mechanisch von der Tunica mucosa ab dem Mesenterium getrennt. Während der Vorbereitung zu ersetzen frisch, gekühlt KHB mehrmals. </li><li> Abgetrennten Tunica mucosa kann Schock in flüssigem Stickstoff zur weiteren Analyse eingefroren werden oder verworfen werden. </li><li> Befestigen Sie den isolierten ME ganze Berg mit 100% Ethanol für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die ganze Berg dreimal mit gekühltem KHB. Hinweis: andere Fixative (dh 4% Formaldehyd, Essigsäure, Aceton) können auch nach der Prüfung ihrer Vereinbarkeit mit dem anschließenden Analyse verwendet werden. </li><li> Die ME ganzen Halterungen sind bereit für weitere histochemische oder immunhistochemische Färbung: </li></ol><ol class="lalpha"><li> Histochemistry: Myeloperoxidase (MPO)-Färbung Infiltrierten PMNs kann durch die folgende MPO Färbeprotokoll untersucht werden. <ol><li> Lösen Sie 10 mg Hanker Yates Reagenz (Polyscience Europa, Eppelheim, Deutschland) in 10 ml KHB und 100 ul von 3% H 2 O 2. Bereiten Sie die Lösung kurz vor Gebrauch frisch und nicht wiederverwenden. </li><li> Inkubieren ganze Halterungen für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Proben ausgiebig mit kaltem KHB und Inkubation für 10 min. </li><li> Montieren Proben in wässrigen Eindeckmedium (Aquatek, Merck, Darmstadt, Deutschland) Nach dem Trocknen für 2 Stunden zu analysieren Dias unter einem Lichtmikroskop. </li><li> Count Anzahl von Zellen in 5 zufällig ausgewählte Felder und berechnen, wie MPO-positiven Zellen / mm 2. </li></ol></li><li> Immunhistochemische Färbung: Entsprechend dem histochemischen MPO-Färbung, kann immunhistochemische Färbungen der ganzen Halterungen durchgeführt werden. Prinzipiell kann Ihren etablierten Protokollen immunhistochemische Färbung von Zellkulturen oder Gewebeschnitten leicht zu einer whole mount Färbung angepasst werden. Die Optimierung des Verfahrens für spezifische antiKörper wird dringend empfohlen. <ol><li> Cut Proben in 5 x 5 mm Stücke und Färbungen bei 2,0 ml Rundkolben Zentrifugenröhrchen in ~ 150 ul - 200 ul Antikörper-Lösung. </li><li> Fixierung und blockierende Prozedur (dh 3% BSA in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur) kann in der &quot;Sylgard Schale&quot; durchgeführt werden. </li><li> Waschschritten in PBS oder andere Puffer können in 12-Well-Platten durchgeführt. </li><li> Übertragen Sie die. Proben vorsichtig mit einem scharfen Pinzette zwischen Färbung Rohre und Waschen der Platten. </li><li> Nach dem abschließenden Waschvorgang Mount Proben in Anti-Fading-Eindeckmedium mit Deckgläsern und analysieren mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol></li></ol> 6. Organ Culture of ME <ol><li> Der gesamte Dünndarm 24 Stunden nach IM reseziert und in kalten KHB enthaltend 200 U / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin (KHB + P / S). </li><li> Schneiden Sie den Darm in 3 cm Länge und Pin jedes Segment auf eine Sylgard mit glass Gericht. </li><li> Entfernen Sie die Mesenterium mit feinen Scheren und schlüpfen im Darm auf einer Stricknadel. </li><li> Gently einschneiden die mich mit einem scharfen Zangen und befreien Sie ihn von der Submukosa mit einem feuchten Watteträger. Die Tunica mucosa bleibt auf der Stricknadel und kann zur weiteren Untersuchung Snap eingefroren sein. Die ME wird in kaltem KHB gesammelten + P / S. </li><li> Schneiden Sie die isolierten ME Streifen in kleine Stücke von 2 - 4 mm Länge und inkubieren sie in eiskaltes KHB + P / S für eine halbe Stunde und spülen die Probe mehrmals. </li><li> Übertragen etwa 50-60 mg ME (ME mindestens die Hälfte eines Dünndarms) in einem sterilen 24-Well-Platte mit 500 ul Dulbecco s modifiziertem Eagle-Medium (DMEM). </li><li> Bei 37 ° C und 5% CO 2 für weitere 24 Stunden. </li><li> Überprüfen Sie die Zellkulturen für bakterielle oder Pilzbefall unter dem Mikroskop. </li><li> Sammle Überstand, Spin-down für 5 min bei 1.000 rcf und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff. Inzwischen trockentupfen die muscle Gewebe auf einer sauberen Gewebes für 30 sec und Gewicht. </li><li> Überstände können für die anschließende Analyse der freigesetzten Zytokine (IL-6) durch ELISA oder anderen Metaboliten (dh Nitrit) in dem Überstand werden durch folgende Anweisungen verwendet herstellt. </li><li> Normalisieren gemessenen Konzentrationen pro Gewicht ME Gewebe. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse <ol><li> Funktionelle Studien Der wichtigste Parameter, um die Schwere des POI zu bewerten, ist die Prüfung des GIT in vivo. 1A zeigt eine typische Verteilung von FITC-Dextran entlang des Magen-Darm-Trakt in unbehandelten Kontrollen und intestinal manipulierten Mäusen 24 Stunden nach der Operation. &quot;Sham betrieben&quot; Tiere zeigten eine normale GIT mit einer berechneten geometrischen Mittelpunkt (GC) im Caecum, während IM führte zu einer signifikanten Verzögerung des GIT im proximalen Jejunum (1B) Kolonmotilität wurde separat auf durch Messung der Kugel-Ausscheidung Zeit o konzentriertfa 2 mm Glaskugel. Sham betrieben Mäuse zeigen eine Ausscheidung Zeit von 48 - 200 sec, während IM führte zu einer längeren Zeit zwischen Ausscheidung von 470 bis 775 sec (Abbildung 1C). </li><li> Morphologische Studien Um die entzündliche beschreiben innerhalb der ME mehrere Phänotypen von Leukozyten verlängern könnte unter Verwendung Histochemie oder Immunhistochemie werden. In 2A + B eine geringe Anwesenheit von PMNs in &quot;sham betrieben&quot; Tieren beobachtet wurde (39 ± 7 Zellen / mm 2). IM des Dünndarms führte zu einem starken PMN-Infiltration (660 ± 86 Zellen / mm 2) im Vergleich mit Sham behandelten Tieren </li><li> ME Organ Culture Viele Entzündungsmediatoren aus Zellen freigesetzt sind schwierig in Gewebelysaten detektieren. Organkulturen ermöglichen Detektion der freigesetzten Mediatoren im Kulturüberstand. Ein Vertreter Vermittler im POI NEIN ist, was als wichtige hemmende Neurotransmitter im Magen-Darm-Trakt. 5 NO konnte nicht in ME Orgel Kultur erkannt werdentur Überstände der nicht operierten Kontrolltieren (5 ± 6 pM / 24 h / mg Gewebe). In Sham (Laparotomie) Mäusen basale NO-Spiegel von 53 ± 36 pM / 24 h / mg Gewebe wurden beobachtet. ME Kulturen intestinal manipuliert (geerntet 24 Stunden nach der Operation) Mäuse produzieren deutlich mehr NO (2254 ± 853 pM / 24 h / mg Gewebe) während 24 Stunden ME Organkultur (Abbildung 3). </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig1.jpg" /> Abbildung 1. Effekt von IM auf GIT (A + B) und Kolontransitzeit (C) wurde als das GIT Prozent der nicht absorbierbaren Fluorescein-markiertes Dextran in 15 Segmente gastrointestinalen-Magen (Sto), Dünndarm (SI 1-9 gemessenen ), Blinddarm (KEK) und Dickdarm (Co) -90 min nach der oralen Einnahme. Darmpassage wurde als die Zeit vom Herausziehen der Fistel-Sonde bis Ausscheidung eines 2 mm Glasperlen gemessen. (A) Gastrointestinal Verteilung von Fluoresceinisothiocyanat-dextran nach Sham-Operation oder IM. In scheinoperierten Tieren meisten der Markierer im Caecum oder dem proximalen Kolon verglichen mit proximalen Jejunum Lage im manipulierten Tieren. Gestrichelten Linien zeigen berechnete GC. (B) Die Berechnung der GC zeigte eine verlängerte gastrointestinale Transitzeit nach IM. (C) Colonic Laufzeit zeigten eine signifikante Verzögerung in IM Mäusen verglichen mit sham operierten Tieren. GC für die 15 Darmabschnitten sind als Mittelwert (n = 5) dargestellt. Colonic Laufzeiten angezeigt wurden meine mit allen einzelnen Werten (n = 6). *** = P &lt;0,001, Student-t-Test. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig2.jpg" /> Abbildung 2. Nachweis von MPO positiven Zellen innerhalb Dünndarms ME. (A) ME ganze Halterungen wurden mit Hanker Yates Reagenz zum Nachweis von MPO positiven PMN 24 Stunden nach Laparotomie (Sham) oder IM Verfahren angefärbt. (B) Quantifizierung der MPO positive Zelle innerhalb 5 zufällig ausgewählte Felder pro Maus. n = 6 animals pro Gruppe. *** = P &lt;0,001, Student-t-Test. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig3.jpg" /> Abbildung 3. NO-Produktion in Kulturüberständen von ME. Muscle Proben aus operierten Kontrollen, betrieben Schein und IM Mäuse wurden 24 Stunden nach der Operation entnommen und kultiviert für 24 Stunden. Unbehandelte Mäuse zeigten nur eine sehr geringe basale Produktion von NO. Nach Laparotomie NO Befreiung ohne Messung signifikante Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und Sham behandelten Tieren erhöht. 24 Stunden nach IM NO-Produktion ist drastisch im Vergleich zu unbehandelten oder Sham behandelten Tieren erhöht. n = 5 Tiere pro Gruppe. *** = P &lt;0,001, 1 ANOVA.

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	<li>Wehner, S., Behrendt, F. F., Lyutenski, B. N., Lysson, M., Bauer, A. J., Hirner, A., Kalff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+macrophage+function+prevents+intestinal+inflammation+and+postoperative+ileus+in+rodents.">Inhibition of macrophage function prevents intestinal inflammation and postoperative ileus in rodents.</a> Gut. 56, 176-185 (2007).</li><li>Kalff, J. C., Schwarz, N. T., Walgenbach, K. J., Schraut, W. H., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+of+the+intestinal+muscularis:+their+phenotype+and+isolation.">Leukocytes of the intestinal muscularis: their phenotype and isolation.</a> J. Leukoc. Biol. 63, 683-691 (1998).</li><li>Kehlet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postoperative+ileus.">Postoperative ileus.</a> Gut. 47, iv85-iv86 (2000).</li><li>Wehner, S., Schwarz, N. T., Hundsdoerfer, R., Hierholzer, C., Tweardy, D. J., Billiar, T. R., Bauer, A. J., Kalff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IL-6+within+the+rodent+intestinal+muscularis+after+intestinal+surgical+stress.">Induction of IL-6 within the rodent intestinal muscularis after intestinal surgical stress.</a> Surgery. 137, 436-446 (2005).</li><li>Kalff, J. C., Schraut, W. H., Billiar, T. R., Simmons, R. L., Bauer, A. 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C., Turler, A., Speidel, N., Grandis, J. R., Billiar, T. R., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+jejunal+manipulation+causes+postoperative+pan-enteric+inflammation+and+dysmotility.">Selective jejunal manipulation causes postoperative pan-enteric inflammation and dysmotility.</a> Gastroenterology. 26, 159-169 (2004).</li><li>Engel, D. R., Koscielny, A., Wehner, S., Maurer, J., Schiwon, M., Franken, L., Schumak, B., Limmer, A., Sparwasser, T., Hirner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+helper+type+1+memory+cells+disseminate+postoperative+ileus+over+the+entire+intestinal+tract.">T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract.</a> Nat. Med. , (2010).</li><li>Stoffels, B., Schmidt, J., Nakao, A., Nazir, A., Chanthaphavong, R. S., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+interleukin+10+in+murine+postoperative+ileus.">Role of interleukin 10 in murine postoperative ileus.</a> Gut. 58, 648-660 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine vergleichende Studie zur Analyse unterschiedlicher IM (Dünndarm Eventration für 10 min gegenüber vorsichtig Inspektion des Dünndarms mit zwei Watteträger gegenüber IM mit der Evakuierung des Dünndarms Inhalte in den Blinddarm) zeigten eine Korrelation zwischen dem Ausmaß der chirurgischen Manipulation und POI. Im Vergleich mit den anderen Gruppen IM zeigte die höchste Menge an Leukozyten im ME (PNMS, Makrophagen und Mastzellen), die sich in langen und schweren POI. 8. <p class="jove_content"...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Equipment </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Ethilon 5/0 </td><td> Ethicon </td><td> 1666H </td></tr><tr><td> Watteträger </td><td> MaiMed </td><td> 71010 </td></tr><tr><td> Arterienkatheter </td><td> Vygon </td><td> 115-798 </td></tr><tr><td> 96-Well-Platte (schwarz) </td><td> Greiner Bio One </td><td> 655096 </td></tr><tr><td> Glaskugel (2 mm Durchmesser) </td><td> Worf </td><td> auf Anfrage </td></tr><tr><td> Insect Pins </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26000-25 </td></tr><tr><td> Hanker Yates Reagent </td><td> Polyscience </td><td> 560694 </td></tr><tr><td> Aquatek </td><td> Merck </td><td> HC109850 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-604 F </td></tr><tr><td> FITC-Dextran (MW 70000) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 46.945-500MG-F </td></tr></tbody></table>

functional assessment of intestinal motility and gut wall inflammation in rodents: analyses in a standardized model of intestinal manipulation

Entzündung des Magen-Darm-Trakt ist eine häufige Ursache für eine Vielzahl von Krankheiten des Menschen. Tierforschung Modelle sind kritisch untersucht die komplexen zellulären und molekularen der intestinalen Pathologie. Obwohl der Tunica mucosa ist oft das Organ von Interesse in vielen entzündlichen Erkrankungen, aktuelle Arbeiten gezeigt, dass die muscularis externa (ME) ist auch ein sehr immunkompetenten Organ, das ein dichtes Netz von Resident Immunozyten birgt. 1,2 Diese Arbeiten wurden im Rahmen des standardisierten durchgeführt Modell der intestinalen Manipulation (IM), die zur Entzündung des Darms Wand führt, hauptsächlich zum ME begrenzt. Klinisch Entzündung führt zu verlängerten intestinale Motilitätsstörungen, wie postoperativer Ileus (POI), die eine häufige und unvermeidbare Komplikation nach abdominale Chirurgie ist bekannt. 3 Die Entzündung wird durch Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren, wie IL-6 oder IL-4 1β oder hemmende Neurotransmitter dadurch wie nitric-Oxid (NO). 5 Anschließend extravasieren enorme Anzahl von Immunzellen in das ME, dominiert von neutrophilen Granulozyten (PMN) und Monozyten und schließlich halten POI. 2 tagelangen, führt dies Darmlähmung zu einem erhöhten Risiko einer Aspiration, bakterielle Translokation und infektiöse Komplikationen bis zur Sepsis und Multiorganversagen und verursacht eine hohe wirtschaftliche Belastung. 6 In diesem Manuskript demonstrieren wir die standardisierten Modell von IM-und in vivo Beurteilung der Magen-Darm-Transit (GIT) und Darmpassage. Weiterhin zeigen wir, ein Verfahren zur Trennung des ME von der Tunica mucosa durch immunologische Analyse, die von entscheidender Bedeutung, um zwischen den Entzündungsreaktionen in diesen beiden stark immunaktives Darmwand Abteile zu unterscheiden gefolgt. Alle Analysen sind leicht übertragbar auf andere Forschungs-Modelle, die gastrointestinale Funktion.

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Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Postoperativen Ileus (POI) ist eine Komplikation der Bauchchirurgie führt zu einer erhöhten Morbidität und einen längeren Krankenhausaufenthalt. Da prophylaktische oder therapeutische Strategien fehlen verstärkte Forschung notwendig ist. Deshalb haben wir eine standardisierte und machbar Mausmodell, um die Pathophysiologie von POI zu untersuchen und mögliche therapeutische Optionen zu studieren.

Functional Assessment of Darmmotilität und Darmwand Entzündung in Nagetiere: Analysen in einem standardisierten Modell der intestinalen Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

21.9K Aufrufe.  University of Bonn. Postoperativen Ileus (POI) ist eine Komplikation der Bauchchirurgie führt zu einer erhöhten Morbidität und einen längeren Krankenhausaufenthalt. Da prophylaktische oder therapeutische Strategien fehlen verstärkte Forschung notwendig ist. Deshalb haben wir eine standardisierte und machbar Mausmodell, um die Pathophysiologie von POI zu untersuchen und mögliche therapeutische Optionen zu studieren.

Serie: Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murine Endoskopie für<em&gt; In Vivo</em&gt; Multimodale Bildgebung der Krebsentstehung und Bewertung der Darm Wundheilung und Entzündung

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Forschung

Medizin

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Fluoreszenz-vermittelten Tomographie für die Erkennung und Quantifizierung von murinen Makrophagen bedingte Darmentzündung

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ischemia, when the blood supply and therefore oxygen is decreased to the intestine. This leads to intestinal barrier loss and damage to the underlying tissue. Intestinal stem cells reside at the base of the crypts of Lieberk&#252;hn and are responsible for intestinal renewal during homeostasis and following injury. Ex vivo cell culture techniques have allowed for the successful study of epithelial stem cell interactions by establishing culture conditions that support the growth of three-dimensional epithelial organ-like systems (termed "enteroids" and "colonoids" from the small and large intestine, respectively). These enteroids are composed of crypt and villus-like domains and mature to contain all of the cell types found within the epithelium. Historically, murine models have been utilized to study intestinal injury. However, a porcine model offers several advantages including similarity of size as well as gastrointestinal anatomy and physiology to that of humans. By utilizing a porcine model, we establish a protocol in which segmental loops of intestinal ischemia can be created within a single animal, enabling the study of differing time points of ischemic injury and repair in vivo. Additionally, we describe a method to isolate and culture the intestinal stem cells from the ischemic loops of intestine, allowing for the continued study of epithelial repair, modulated by stem cells, ex vivo.

This protocol will enable readers to successfully establish a porcine model of segmental intestinal ischemia and subsequently isolate and culture intestinal stem cells for the study of epithelial repair following injury.

Intestinale Stammzellen isoliert und Kultur in einem porcinen Modell der segmentalen kleinen intestinalen Ischämie

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated with an increased survival rate and greater quality of patient&#8217;s life when compared to conventional dialysis. Regrettably, transplantology suffers from a lack of reliable methods for organ quality assessment. Standard diagnostic techniques are limited to macroscopic appearance inspection or invasive tissue biopsy, which do not provide comprehensive information about the graft. The proposed protocol aims to introduce solid phase microextraction (SPME) as an ideal analytical method for comprehensive metabolomics and lipidomic analysis of all low molecular compounds present in kidneys allocated for transplantation. The small size of the SPME probe enables performance of a chemical biopsy, which enables extraction of metabolites directly from the organ without any tissue collection. The minimum invasiveness of the method permits execution of multiple analyses over time: directly after organ harvesting, during its preservation, and immediately after revascularization at the recipient&#8217;s body. It is hypothesized that the combination of this novel sampling method with a high-resolution mass spectrometer will allow for discrimination of a set of characteristic compounds that could serve as biological markers of graft quality and indicators of possible development of organ dysfunction.

The protocol presents utilization of the chemical biopsy approach followed by comprehensive metabolomic and lipidomic analysis for quality assessment of kidney grafts allocated for transplantation.

Verwendung einer chemischen Biopsie zur Graft-Qualitätsbewertung

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

Standardisierte histomorphometrische Bewertung von Osteoarthritis in einem chirurgischen Mausmodell

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable health and financial burden on individuals and society. Therefore, it is critical to investigate the mechanisms underlying the pathogenesis and development of IBD. Here, a gut microbiota antigen-specific T cell transfer colitis model is described. CBir1 flagellin has been recognized as the immunodominant gut bacterial antigen in experimental colitis and patients with Crohn&#39;s disease. CBir1 TCR transgenic na&#970;ve CD4+ T cells, specific to CBir1 flagellin, can induce chronic colitis after adoptive transfer into immune-deficient Rag1-/- mice. The disease severity is assessed by histopathology. The CD4+ T cell phenotypes in colonic lamina propria are also determined. This model closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In this protocol, a gut microbiota antigen-specific T cell adoptive transfer colitis model is described. CD4+ T cells are isolated from CBir1 TCR transgenic mice. These are specific for an immunodominant gut microbiota antigen CBir1 flagellin, which is transferred into recipient Rag1-/- mice, leading to intestinal inflammation.

Induktion von Darmentzündungen durch adoptive Übertragung von CBir1 TCR transgenen CD4+ T-Zellen auf immundefiziente Mäuse

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolierung des murinen intestinalen Mesenchyms, was zu einer hohen Ausbeute an Telozyten führt

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Standardisierte Tuina-Manipulation bei Kniearthrose bei Ratten

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its mechanism. Therefore, the manipulation of animal models of knee osteoarthritis is critical. This protocol provides a standard process for Tuina manipulation on KOA rats and a preliminary exploration of the mechanism of Tuina for KOA. The press and kneading manipulation method (a kind of Tuina manipulation that refers to pressing and kneading the specific area of the body surface) is applied on 5 acupoints around the knee joint of rats. The force and frequency of the manipulation were standardized by finger pressure recordings, and the position of the rat during manipulation is described in detail in the protocol. The effect of manipulation can be measured by pain behavior tests and microscopic findings in synovial and cartilage. KOA rats showed significant improvement in pain behavior. The synovial tissue inflammatory infiltration was reduced in the Tuina group, and the expression of tumor necrosis factor (TNF)-&#945; was significantly lower. Compared to the control group, chondrocyte apoptosis was less in the Tuina group. This study provides a standardized protocol for Tuina manipulation on KOA rats and preliminary proof that the therapeutic effects of Tuina may be related to reducing synovial inflammation and delayed chondrocyte apoptosis.

Autor im Rampenlicht: Verständnis des Mechanismus der Tuina-Manipulation bei Ratten 

We present a protocol for Tuina manipulation performed on plaster-immobilized-induced knee osteoarthritis rats. Based on the preliminary results, it suggested that the efficacy of the method relied on the reduction of inflammation and cartilage loss.

Tuina-Manipulation zur Verringerung von Entzündung und Knorpelverlust bei Ratten mit Kniearthrose

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...