Dieses Modell der Chemotherapie-induzierten Schleimiskann kann verwendet werden, um wichtige Endpunkte und vermehrte Marker für kleine Darmverletzungen und kompensatorische Hyperproliferation bei Mäusen zu bestimmen. Diese Methode ist zeit- und kosteneffizient und einfach durchzuführen. Bei einer standardisierten Methode wie dieser ist es einfacher, analytische Endpunkte mit wenigen Variationen zu vergleichen.
Für die Induktion von 5-Florauracil oder 5FU Schleimhaut eine 1-Milliliter-Spritze mit einer 27-Meter-mal-19-Millimeter-Nadel mit dem entsprechenden Volumen von 5FU laden und eine Empfängermaus manuell zurückhalten. Während Sie die Maus in einem festen, aber sanften Griff halten, legen Sie die ventrale Seite des Tieres aus und legen Sie die Nadel in die intraparitoneale Höhle in einem der unteren Quadranten des Bauches ein. Dann aspirieren Sie, um die richtige Nadelplatzierung zu gewährleisten und injizieren Sie die 5FU.
Am entsprechenden experimentellen Endpunkt, 4-Bromo-Deoxyuridin oder BrdU-Quantifizierung, wiegen Sie eine 5FU verletzte Tiermaus und liefern 5 Milligramm pro Kilogramm BrdU durch intraperitoneale Injektion in einer Dunstabzugshaube. 150 Minuten nach der BrdU-Injetion, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenstich, notieren Sie das Gewicht der anästhesierten Maus, und legen Sie das Tier in die Rückenlage. Führen Sie eine Laparotomie durch, um die Bauchhöhle freizulegen und einen Schnitt der Brusthöhle vorzunehmen, um Pneumothorax einzuführen.
Schneiden Sie besser als der Pylorus, und sorgfältig extrahieren ziehen Sie das Darmgewebe weg vom Tier, bis das Cecum erreicht ist. Mit Zangen, klemmen Sie das proximale Lumen vorsichtig zu und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Meter-Nadel ausgestattet ist, um den Dünndarm mit Einer Saline zu spülen. Dann legen Sie den geleerten Darm auf sauberes Blotting-Papier, um die überschüssige Salzlösung vorsichtig zu entfernen.
Für die Gewebesammlung, ernten Sie den Dünndarm aus dem injizierten Tier, wie gerade gezeigt und das Gewicht des gespülten Gewebes aufzeichnen. Nach der histologischen Verarbeitung kann das Gewebe unter dem 10-fachen Objektiv eines Lichtmikroskops abgebildet werden, das mit einer Kamera verbunden ist, um histologische Fotos des geernteten Gewebes zu erhalten. Um den Bereich der immunreaktiven BrdU-Zellen zu messen, öffnen Sie das Bild von Interesse für Bild J, und öffnen Sie das Bühnenmikrometerbild.
Verwenden Sie das Auswahlwerkzeug für gerade Linien, um eine gerade Linie auf einem Mikrometerbild zu zeichnen, um eine bekannte Entfernung zu definieren und im Analysemenü einen festgelegten Maßstab auszuwählen. Geben Sie einen Wert in das Feld "Bekannter Abstand" ein, und definieren Sie die Längeneinheit im Feld Längeneinheit. Öffnen Sie ein von Interesse sinddes Bild, um den Bereich der immunreaktiven BrdU-Zellen pro Krypta zu messen, und legen Sie die Farbgrafiken unter dem Bildtypmenü auf 8 Bit fest.
Erhöhen Sie den Kontrast des Bildes unter prozessverstärktem Kontrast, und legen Sie die gesättigten Pixel auf 0,4 % fest, um einen Schwellenwert auf das Bild anzuwenden, um die Immunpositivität zu segmentieren und die Bildanpassung auszuwählen. Wählen Sie Schwellenwert und Rot aus, und verschieben Sie den Schwellenwertbalken, um einen Schwellenwert von etwa 10 bis 20 Prozent auszuwählen. Wählen Sie dann eine gut orientierte Krypta aus, und verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um den Bereich um sie herum zu markieren.
Um den Schwellenwertbereich zu messen, öffnen Sie die Registerkarte Analysieren, und wählen Sie Partikel analysieren aus. Legen Sie im Partikelanalysefenster die Größe auf 20 bis unendlich fest, und klicken Sie auf die Feldpixeleinheiten. Legen Sie die Zirkularität auf Null auf eins fest, und legen Sie Show auf Umrisse fest.
Klicken Sie dann auf die Anzeigeergebnisse, fassen Sie löcher und schließen Sie Bohrungsfelder ein. Die Messergebnisse werden im Zusammenfassungsfenster angezeigt. Um die Tiefe der Krypta zu messen, öffnen Sie ein Bild in Zen Light und verbinden Sie sich mit der Kamera.
Erstellen Sie Schnappschüsse im Kameramodus mit einem 20-fachen Objektiv, und wechseln Sie in den Verarbeitungsmodus, um den Snapshot zu öffnen. Wechseln Sie zur Measureansicht. Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Zeile am unteren Rand einer gut orientierten Krypta zu starten und die Zeile oben in der Krypta zu beenden.
Exportieren Sie dann die Messungen und berechnen Sie den Durchschnitt der Kryptatiefe und Füllen als Höhe. Das Dünndarmgewicht nimmt von Tag 2 bis Tag 4 ab, was auf einen Verlust der Enterozytenmasse hindeutet. Bemerkenswert ist, dass sich das Gewicht am 5. Tag nicht wesentlich von dem Gewicht des Tages 0 bei behandelten Tieren unterscheidet.
Die gemessene Proliferation durch BrdU-Einarbeitung wird an den Tagen 1 und 2 fast abgeschafft, aber an den Tagen 4 und 5 ist die Proliferation etwa vier- bzw. fünffach. Diese Hyperproliferation wird auch bei der Messung der Kryptatiefe beobachtet. In der regenerativen Phase der Schleimhautgibtung besteht eine starke Korrelation zwischen BrdU-Einarbeitung und Kryptatiefe, die während der akuten Phase nicht beobachtet wird, was darauf hindeutet, dass die Verwendung der Kryptatiefe als Endpunkt in der akuten Phase der Mukositis geeignet sein könnte.
Transgene Mäuse mit einer unzureichenden L-Zell-Sekretion zeigen einen signifikanten Verlust des Körpergewichts und eine Abnahme des Dünndarmgewichts in der Erholungsphase, verglichen mit der bei wilden Typ-5-FU-Mäusen. Darüber hinaus zeigen die transgenen Mäuse keine kompensatorische Hyperproliferation, da die Krypten deutlich kürzer sind als bei Wildtypmäusen und gesunden Kontrollen. Während dieses Verfahrens versuchen, stellen Sie sicher, den Dünndarm vollständig zu entleeren, und die überschüssige Saline zu entfernen, bevor Sie das Gewebe wiegen, um das kleine Darmgewicht nur zu erhalten.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie wichtige Endpunkte kleiner Darmverletzungen durchführen, sammeln und bestimmen können. Und um reproduzierbare Daten effektiv zu erhalten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chemischen Verbindungen wie 5FU und BrdU gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie die Verwendung eines Labormantels, Handschuhe und eine Dunstabzugshaube immer bei der Durchführung dieser Verfahren getroffen werden sollten.
