Diese Arbeit wurde durch das Center for Regenerative Therapies, der Medizinischen Fakultät der TU Dresden und dem DFG-Sonderforschungsbereich SFB655 (Teilprojekt A20) unterstützt. BA wurde durch ein Stipendium der DIGS-BB-Programm, Dresden unterstützt. Wir danken Drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Chichung Lie und Ravi Jagasia für wertvolle Ratschläge bei der Einrichtung in utero Elektroporation und stereotaktische viralen Injektion.

Vorbemerkung Operation muss von ausgebildeten Ermittlern nach Genehmigung der lokalen Behörden für den Tierschutz durchgeführt werden. Müssen alle erforderlichen Vorkehrungen getroffen, um die Schmerzen und Stress zugefügt, um das Tier, einschließlich tiefe Narkose, Verwaltung der postoperativen Analgesie und für Maßnahmen, die länger als 10 min, Anwendung eines Auges Schmiermittel Hornhaut Austrocknung und Erblindung verhindern zu minimieren. Narkotisierten Mäusen müssen ständig warmen bei 37 ° C bis zur vollständigen Genesung und jeder chirurgische Werkzeug und Lösung müssen steril sein. Obwohl die Verwendung eines biologischen Haube ist nicht unbedingt notwendig, muss der Betreiber alle zumutbaren Vorkehrungen treffen, um die Möglichkeit einer Infektion des Tieres während des Betriebs durch das Tragen eines Laborkittel, Maske und Handschuhe zu minimieren. Ebenso muss jeder Schritt über die Erzeugung und Verwendung von Viren zugelassen und müssen in S2 Gebiete gemäß den Vorschriften der örtlichen Behörden erfolgen.Schließlich muss eine gründliche Dekontamination aller Werkzeuge und Oberflächen, die in Kontakt mit Viren gewesen sein könnte nach anerkannten Einrichtung zu Praktiken (HIV durch Abreiben mit 70% Et-OH und / oder Autoklavieren) durchgeführt werden. Teil 1: Erweiterung der embryonalen NSC 1. In utero Elektroporation <ol><li> Nach Klonierung die Transgene (dh cdk4/cyclinD1) in PCM-EGFP (Clontech) oder PDSV-mRFPnls Vektoren 16, reinige die Plasmide unter Verwendung EndoFree Kit und resuspendieren in steriler PBS auf eine Konzentration von 3-5 ug / ul. Bald vor der Operation, mischen die Plasmide mit 0,05% FastGreen in PBS bei einem Endverhältnis von ca. 04.04.01 und zentrifugieren der Mischung für 2 min bei 16.000 × g zur Entfernung aller Präzipitate. </li><li> Legen Sie das DNA-Gemisch wird in eine zuvor gezogen Borosilikatglas Kapillare. Pulling Parameter mit einem P-97 Pipette Puller sind: Zug: 200; vel: 140; Zeit: 140. Wärme wird durch eine Rampe Test gegeben und hängt von der specific viele Kapillaren verwendet. Montieren Sie die Kapillare an der Düse des PicoPump, die nahe an die in utero Elektroporation Plattform (Abbildung 1A) und unter einem Stereomikroskop, biegen seiner Spitze und nick es am Wendepunkt. </li><li> Sterilisieren alle Operationen an einem trockenen Glasperlen Sterilisator und tief betäuben eine schwangere Maus am Tag 12-15 der Trächtigkeit mit einem Isofluran Verdampfer. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einer Heizplatte bei 37 ° C eingestellt und halten ständig unter Isofluran Verwaltung über eine Bugspitze. </li><li> Rasur die Haut des Bauches, mit Betaisodona mehrfach desinfiziert und schließlich wischte zwischen mit 70% Ethanol, und injizieren Buprenorphin (verdünnt in PBS) subkutan mit 0,1 mg / kg Konzentration als Präventivschlag Analgetikum. Verwendung einer feinen Schere, einen 2 cm Längsschnitt der Haut und in der Folge des zugrundeliegenden muskulären Wand, um die Bauchhöhle zu übersetzen. Verzichten in der Peritonealhöhle ca. 2ml IUE Lösung (D-PBS mit 100 U / ml Penicillin / Streptomycin) vorgewärmt auf 37 ° C und die Lösung auf einem Heizblock. </li><li> Decken Sie die Maus mit sterilen drap mit einem Riss, aus dem die Uteri entfernt werden. Ziehen Sie den Schnitt mit einem Wolfram-Retraktor identifizieren die Gebärmutter und ziehen Sie ihn heraus hielt sie mit einer Pinzette zwischen benachbarten Embryonen (Abbildung 1B; links) und schließlich lag es auf der sterilen drap. Während der gesamten Operation, spülen Sie die Gebärmutter mit IUE Lösung, um die Orgel und Körperhöhle befeuchten und verhindern Austrocknung des Tieres. </li><li> Behandeln Sie die Gebärmutter vorsichtig hielt sie zwischen Daumen und Zeigefinger und drehen ein Embryo bis ihr Kopf ist sichtbar und orientiert sich an der Betreiber. Identifizieren der telencephalen Halbkugeln und Injizieren eines von ihnen aus dem dorsolaterale Seite. Lassen Sie 1-2 ul der DNA-Lösung mit dem Fußschalter eines PicoPump bis die Ventrikel FastGreen (Abbildung 1B, rechts) erläutert wird. </li><li&gt; Platz die Anode der Elektroden auf der Injektionsstelle und der Kathode auf der kontralateralen Seite (1C) und liefern 6 Impulse von 30 V für 50 ms mit 950 ms-Intervall zwischen jedem Impuls mittels eines Elektroporators Erzeugen quadratischen elektrischen Feldern betrieben durch einen Fußschalter. Vermeiden die Elektroden mit der Plazenta zu schließen, da dies zur Beschädigung der Hämorrhagie und Embryos führen kann. </li><li> Wenn alle Embryonen injiziert werden und elektroporiert, legen die Gebärmutter wieder in die Bauchhöhle und schließen Sie die muskulösen Wände mit einer Naht String Nähen alle 3-4 mm. Die Knoten sollten auf den Muskel eng anliegen, aber nicht zu eng, um ein wenig Schwellung des Gewebes ermöglichen. Schließlich schließen die darüber liegende Haut mit Metallklammern. Desinfizieren Sie die Haut mit Betaisodona, entfernen Sie die Maus aus der Isofluran-Maske und übertragen sie in einem Gehäuse Käfig, wenn hellwach. Überwachen Sie die Erholung der Maus, bis Bewegungsapparates Verhalten ist normal. </li></ol> 2. Die Verarbeitung des samspiel <ol><li> Ein oder mehrere Tage nach der Elektroporation, opfern die Maus, sammeln die Embryonen und diejenigen identifizieren, richtig elektroporiert mit einem fluoreszierenden Stereomikroskop (1D). Sezieren die Gehirne auf eiskaltem PBS, und befestigen Sie sie über Nacht in 4% PFA (Paraformaldehyd in Phosphatpuffer pH 7,4). Schließlich kann BrdU vor der Tötung nach verschiedenen Paradigmen verabreicht werden, um Zellzykluskinetik und Zellproliferation 3 untersuchen. </li><li> Die Gehirne werden dann zum Schneiden und Immunfärbung für die mehreren Marker der radialen Gliazellen, basale Vorläuferzellen und Neuronen (Pax6, Nestin, tbr2, Tbr1, Tuj1 usw.), um die Wirkung der funktionellen Transgenen auf gezielte NSC und deren Nachkommen, die auszuwerten sind verarbeiteten identifiziert durch die Expression des Co-elektroporierten Reportergens. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1.In utero Elektroporation. (A) Schematische Darstellung eines in utero Elektroporation Plattform. (B) Die Zeichnungen, die die Positionierung der schwangeren Maus während der Operation (rechts) und Injektion der DNA / FastGreen Mischung (blau) in der Halbkugel telencephalen einer Maus Embryo (links). (C) Schematische Darstellung der Anordnung der Elektroden in Kontakt mit der Uteruswand mit der Anode (+) benachbart zu der Injektionsstelle (blau). Pfeile zeigen die Wanderung der DNA zur Anode. (D) Bild von einer Maus-Embryo 24 Stunden nach Elektroporation mit GFP Plasmide an embryonalen Tag 13. Eine gestrichelte Linie grenzt die telencephalen Hemisphäre. Schema in einer modifizierten aus Calegari et al., 2004 17. Teil 2: Expansion of Adult NSC Ein. Produktion von HIV-abgeleiteten Viruspartikel <ol><li> Tag 1: Platte 5 x 10 6 293T-Zellen auf einer 10 cmSchale mit 8 ml D-MEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin (Kulturmedium). Verwenden Sie 15 Gerichte für ein Viruspräparats und Kultur über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Tag 2: Zu jeder Schüssel, in 1 ml Ebene D-MEM 5 ug von jeder der drei Plasmide, die für i verdünnen) VSVG (Vesicular Stomatitis Virus Typ G) Hüllprotein, ii) gag / pol (gruppenspezifische Antigen / Polymerase) und iii) eine polycistronische Konstrukt exprimiert die funktionellen und Reporter-Transgenen (dh cdk4/cyclinD1/GFP) zuvor in einem HIV-basierten Transfer-Vektor (p6NST90) 9 kloniert. Mischen dieser Lösung mit 1 ml D-MEM mit 45 ul von Polyethylenimin, die vorher gelöst wurde in PBS auf 1 mg / ml Stammlösung, und Inkubation für 15-30 min bei Raumtemperatur. In der Zwischenzeit, entfernen Sie die Medien aus den Zellen und 4 ml pro Schale von frischen D-MEM mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin / Streptomycin. Fügen Sie die 2 ml Transfektionsgemisch und Kultur über Nacht. </li><li> Tag 3: add 120 ul 500 mM pro Gericht, um die Expression der Transgene zu verbessern Na-Butyrat, vorsichtig mischen und Kultur für 6-8 Stunden nach dem die Transfektion Medium mit 5 ml Kulturmedium ersetzen. </li><li> Tag 4: sammeln die Überstände (ca. 70 ml insgesamt), durch einen 0,22 um Filter und Transfer in 2 Polyallomer Zentrifugenröhrchen (35 x 89 mm) passieren. Ultrazentrifuge bei 110,000 × g für 90 min bei 4 ° C unter Verwendung einer Schaukel Rotors. Überstand verwerfen, 6 ml PBS in jedes Röhrchen pipettieren und auf Eis für 1 Stunde. Das Pellet und übertragen sie in ein Polyallomer Zentrifugenröhrchen (14 x 95 mm). Ultrazentrifuge bei 110,000 × g für 90 min bei 4 ° C unter Verwendung einer Schaukel Rotors. Überstand verwerfen, das Pellet in 50 ul PBS, machen 5 ul Aliquots und bei -80 ° C. Virustiter wird in dem Bereich von 10 8 -10 9 KBE / ml betragen. (Hinweis: Viren sind sehr temperaturempfindlich und Lagerung, avoid re-Gefrieren, auf Trockeneis zu halten während des Transports und auftauen kurz vor Gebrauch.) </li></ol> 2. Stereotaktische Injektion <ol><li> Anesthetize einen 6-10 Wochen alten Maus mit Isofluran und legen Sie das Tier in Bauchlage auf einem stereotaktischen Rahmen (2A) mit den Ohren Bars und den Gaumen Unterstützung richtig fix den Kopf. Das Tier wird warm gehalten auf einem Heizkissen bei 37 ° C und unter ständiger Isofluran-Administration festgelegt. </li><li> Inject subkutan 100 ul von Buprenorphin Gebrauchslösung wie präventive analgetische, rasieren einen Streifen Haut auf dem Kopf der Maus, und desinfizieren wie unter 1.4 beschrieben. Mit einem Skalpell eine ca. 1,5 cm lange longitudinale Einschnitt auf der Kopfhaut Aussetzen des Schädels auf der Ebene der Sagittalnaht. Fahren Sie die Haut auftragen und sanft reinigen Knochenoberfläche mit einem sterilen Wattestäbchen. </li><li> Half-füllen eine Glaskapillare (Angaben in 1,2) mit Paraffinöl und klebe sie auf der Einspritzpumpe Einsetzendie Kapillare, bis der zweite Ring (Abb. 2B). Bewegen des Kapillarhalters in der x, y und z-Achse, bis die Spitze der Kapillare auf dem Bregma, die Verbindung zwischen der sagittalen und seitliche Nähte (2C) (mit Hilfe eines Stereomikroskops bestimmt werden kann) positioniert ist, und Reset-x, y und z Werte auf 0. </li><li> Bewegen der Kapillare um ± 1,6 mm in der medio-lateralen Achse (x) und -1,9 mm in der anterior-posterioren-Achse (y) und markieren den Knochen unter Verwendung eines chirurgischen Marker. Machen Sie ein Loch von ca. 0,5 mm Durchmesser auf dem Schädel mit einem elektrischen Bohrer Aufmerksamkeit nicht auf das Gehirn schädigen. </li><li> Setz einen 5 ul Tröpfchens von viralen Suspension (1 Aliquot) auf ein Stück Parafilm auf den Balken gelegt und Ohr tauchen die Spitze der Kapillare in dem Tröpfchen. Saugen ca. 3,5 ul Virussuspension mit einem Nanoliter Injektor eingestellt bei 55 nl / sec. Führen Sie diesen Schritt schnell wie der Tropfen verdampft. </li><li> Bewegen Sie die Kapillare auf die Website of Einspritzung und bewegen Sie ihn nach unten, bis die Spitze berührt die Pia-Oberfläche. Setzen Sie den dorso-ventralen Achse (z) auf 0 gesetzt. Zu diesem Zeitpunkt in das Gewebe eindringen mit der Kapillare zur -1,9 mm und freizugeben 1,5 ul viralen Suspension mit einer Geschwindigkeit von 4 nl / sec. Warten für 2-3 Minuten, um den Rückfluss von Virussuspension Trog die Kapillarspur minimieren und dann zurückziehen Kapillare. Eine zweite Injektion können in der kontralateralen Halbkugel ausgeführt werden. </li><li> Naht der Haut, desinfizieren, und lassen Sie das Tier aus der Narkose wieder wie zuvor in utero Elektroporation (1,8) beschrieben. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Stereotaxischen viralen Injektion. (A und B) Schematische Darstellung der Komponenten benötigt wird, um stereotaktische Injektion (A) und eine demontierte Kapillarhalter zeigt das Einsetzen eines ca. durchzuführenpillary bis der zweite Ring (B). (C) Bild von der Maus Kopf durch das Ohr Bars und Gaumen Unterstützung mit der Haut immobilisiert geschnitten, um den Schädel (links) auszusetzen. Die Vergrößerung des gestrichelten Kasten (rechts) zeigt die laterale und sagittalen Nahtmaterial, das Bregma und die Injektionsstelle (Kreis). 3. Verarbeitung der Probe <ol><li> Ein bis drei Wochen nach der Infektion, versorgen die Maus mit ca. 100 ml 4% PFA, sezieren das Gehirn und das Post-fix über Nacht in 4% PFA. Schließlich kann BrdU und / oder Tamoxifen vor der Tötung nach unterschiedlichen Paradigmen verabreicht werden, um Zellzykluskinetik untersuchen und die Expression der viralen Transgenen von loxP-Stellen flankierten Stop bzw. 9. </li><li> Das Gehirn kann dann zur Immunfärbung unter Verwendung mehrerer Marker von Stamm-und Vorläuferzellen und Neuronen (zB Sox2, GFAP, Nestin, tbr2, Doublecortin usw.) verarbeitet werden. </li></ol>

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BA und FC haben eine Patentanmeldung beschreibt die bedingte Ausweitung der adulten somatischen Stammzellen durch cdk4/cyclinD1 Viren (EP 10.160.288,6) eingereicht.

Ein entscheidender Schritt in utero Elektroporation ist die Qualität und Reinheit der DNA seit seiner gerichtete Migration während der Lieferung der elektrischen Felder hängt seine Ladung. Protokolle für DNA-Reinigung, die keine Entfernung der zusätzlichen geladenen Molekülen wie Endotoxinen, kann auf die Maskierung der natürlichen DNA negativen Ladungen was zu schlechter Lieferung führen. Klar ist, dass die Berührung der Uteruswand mit den Elektroden möglichst nahe zu dem Bereich gezielt zu verbessern Elektroporationseffizienz. Ebenso wichtig ist die Qualität der verwendeten Elektroden, da dies grundlegend für die Lieferung der optimale elektrische Felder. Mikrokratzer nicht sogar mit bloßem Auge sichtbar und / oder organische Reste, wie Spuren von Serum, Lipide, und so weiter, wird unweigerlich Laufe der Zeit ansammeln, was zu Elektroden verliert ihre Eigenschaften. Alt und / oder verschmutzte electropes sind die wahrscheinlichste Ursache für einen plötzlichen Abfall bei der Elektroporation Effizienz und damit sollte r seineplaced sobald dies bemerkt wird. Während relativ einfach, in utero Elektroporation erfordert in der Regel ein paar Wochen Training, um zufrieden und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Diese Technik ist sehr vielseitig, da sie angewendet, praktisch ist, um alle Organe und Gewebe des sich entwickelnden Embryos. Sicherlich sind Organe enthält einen Hohlraum, wie Gehirn, besonders einfach zu richten und damit für einen hohen Anteil an transfizierten Zellen auf Grund der Leichtigkeit des Einspritzens ein relativ großes Volumen von DNA. Ein häufiges Problem bei der Einrichtung stereotaxischen viralen Injektion auftritt, ist auf wenige infizierte Zellen und / oder zu einer unerwünschten Bereichen auszurichten. Das erste Problem wird hauptsächlich mit der Injektion von niedrigem Titer Viren korreliert. 293T-Zellen mit geringeren Zahl von Passagen in Kultur wachsen schneller und führen zu höheren Virustiter. Verwendung von Zellen älter als ca. 20 Passagen wird nicht empfohlen, und Mittel der Transfektion mit weniger als 80% Wirkungsgrad nicht gewährleisten eine gutevirale Produktion. Resuspension des viralen Pellet ist auch kritisch, hat die virale Suspension homogen und virale Klumpen, verschließen die Kapillare müssen vermieden werden könnte erscheinen. Viren sind sehr temperaturempfindlich Tropfen und Langzeitlagerung. Aus diesen Gründen müssen Aliquots dauerhaft bei -80 ° C gelagert werden und kann nicht wieder eingefroren werden. Auch unter diesen Bedingungen konnte eine Abnahme der Infektivität nach 6-12 Monaten Lagerung beachtet werden. In den Lernphasen, empfehlen wir, um das virale Titer von jedem Viruspräparats zu testen und es wieder tun nach längerer Lagerung. Die Anwesenheit von infizierten Zellen in unerwünschte Bereiche des Gehirns auf eine suboptimale Positionierung der Maus Kopf auf der stereotaktischen Rahmen, die einige Übung erfordert abhängen. Darüber hinaus ist es wichtig, nicht die Oberfläche des Gehirns beschädigen beim Öffnen der Öffnung an der Schädelbasis, weil sonst wird es nicht möglich sein, die 0 setzen korrekt auf der Pia-Oberfläche, was zu einer ungenauen Injektion. Die Koordinatendass wir in diesem Protokoll vorgesehen sind, um C57/BL6 6-10 Wochen alte Weibchen bezeichnet, und wir empfehlen sie bis zur anderen Stamm / Alter / Geschlecht. Erwerb dieser Technik kann mehr Zeit erfordern als in utero Elektroporation aufgrund der längeren Phasen benötigt, um die Viren vorbereitet und die Proben analysieren. Wir empfehlen dringend, dass Viren nur verwendet werden, nachdem der Maus Operation und stereotaktische Injektion geworden zuverlässig und reproduzierbar. Der erste Schritt, um dies zu erreichen ist es, Zell-permeierenden DNA Farbstoffe, wie Hoechst 33342, in Mäuse euthanasiert injizieren und analysieren die Gehirne sofort. In utero Elektroporation und stereotaktische viralen Injektion sind zwei leistungsstarke Systeme akut und Gewebe gezielt manipulieren Genexpression im ZNS während der Entwicklung von Säugetieren und Erwachsenenalter. Trotz ihrer Begrenzung Targeting nur eine Subpopulation von Zellen, bieten diese Systeme eine beispiellose Geschwindigkeit und Leichtigkeit zu herkömmlichen Methoden verglichen, in insbesondere die umständliche und zeitraubende Generierung von transgenen Mäusen. Doch trotz dieser Ähnlichkeit gibt einige Unterschiede zwischen den beiden Techniken, die erwähnenswert sind. Zuerst in Bezug auf die Ausrichtung der verschiedenen Zelltypen, die in utero Elektroporation führt zunächst zu der Transfektion von Stammzellen ordnungsgemäßen (auch als radiale Gliazellen), weil dies die einzigen Zellen begrenzenden Ventrikels wo die DNA eingespritzt werden. Als Ergebnis der Zellteilungen, wird anschließend von Plasmiden gezielte, Mutter Stammzellen ihre Vorläuferzellen und / oder neuronalen Tochterzellen, die zur Umverteilung der transfizierten Zellen in der Kortex als eine Funktion der Zeit geerbt werden. Im Gegensatz dazu führt die Verwendung von HIV Lentiviren im erwachsenen Gehirn auf die gleichzeitige Infektion von jedem Zelltyp wie Stammzellen, Vorläuferzellen Neuronen sowie reifen Gliazellen. Zu beachten ist, im Hinblick auf die Verwendung von HIV Lentiviren zu häufiger verwendeten Retroviren gegenüberliegenden ist die Tatsache, dass lentivirale Integration würde unabhängig von der mitotischen Zustand der Zellen auftreten, so dass die Targeting auch Erwachsene, ruhenden Stammzellen. Zweitens ist ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen Elektroporation und viralen Infektion, die eine vorübergehende, episomale Expression des früheren erreicht wird, wie zum irreversiblen Integration der DNA in das Genom der infizierten Zellen durch das letztere erreicht entgegengesetzt. Als Ergebnis der aufeinanderfolgenden Zellteilungen Verdünnung der elektroporierten Plasmiden und Abbau des ektopischen CyclinD1 Protein würde an jedem Zellzyklus eintreten. So wurde Ausbau des NSC während der Embryonalentwicklung nur zuletzt für etwa zwei Tage 15 gezeigt, während im erwachsenen Gehirn dieser Effekt wurde festgestellt, dass für mehrere Monate (unveröffentlichte Ergebnisse) dauert. Drittens, da i cdk4/cyclinD1) hat eine stärkere Wirkung auf Zellen mit einer längeren G1 und ii) gebunden neuralen Vorläuferzellen während der Entwicklung eine längere Zellzyklusals Stammzellen, während das Gegenteil der im Erwachsenenalter wahr, wurden unsere beiden Manipulationen gefunden, um die Expansion, vor allem von neuralen Vorläuferzellen während der Entwicklung und Stammzellen im Erwachsenenalter auslösen. In jedem Fall eine Zunahme der Neuronen wurde von beiden Methoden erreicht. Viertens viralen Injektion leicht durchgeführt, zuverlässig und reproduzierbar, in vielen unterschiedlichen Bereichen des erwachsenen Gehirn durch einfaches Ändern der stereotaktischen Koordinaten. Im Gegensatz dazu könnte Zielgenauigkeit bestimmter Regionen des zentralen Nervensystems, wie Hirnstamm, Hippokampus, oder Rückenmark durch Elektroporation in utero schwieriger sein, reproduzierbar zu erreichen. Darüber hinaus, während stereotaktische Injektion bei Mäusen jeden Alters durchgeführt werden kann, wird eine optimale Leistung des in utero Elektroporation von etwa E11 bis E16 begrenzt. Stufen vor E11 würde erfordern entweder den Einsatz eines Ultraschall-Backscatter-Mikroskop 18,19 oder eine ganze Embryo kulture-System 17,20. Vor kurzem hat ein zunehmendes Interesse an grundlegenden zellbiologischen von somatischen Stammzellen gefördert worden, weil ihre Studie und Manipulation gedacht werden, um grundlegend zur Entwicklung neuartiger Zell-basierte regenerative Therapien. Insbesondere für die Überexpression von cdk4/cyclinD1 stellt unser Protokoll die Mittel, um vorübergehend erhöhen die Expansion von NSC in vivo (3B und C und 4B und C), um die Zahl der Neuronen im erwachsenen Gehirn generiert erhöhen. Wir glauben, dass diese Manipulation kann beispielsweise in einer Anzahl von unterschiedlichen Kontexten wichtig zum besseren Verständnis der Rolle der NSC der Entwicklung des Gehirns, der Evolution und Homöostase sowie ihr Beitrag zu kognitiven Funktion oder Erholung von neuronalen Degeneration oder Verletzung.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / Ausrüstung </td><td> Lieferant </td><td> Katalog # </td><td></td></tr><tr><td> Endofree maxi Plasmid Kit </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming / Brown Pipette puller </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat Kapillaren mit Filament </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69 bis 10 </td><td></td></tr><tr><td> Tischplatte Versuchstier Anästhesie-System </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter </td><td> HDG9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 Glasperlen Sterilisator </td><td> Southpointe Surgical </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> Iris Pinzette </td><td> WPI </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> Betaisodona Lösung </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> Pico Pump </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 Rechtecksignal Elektroporator </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> Round Pinzette Elektroden </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> Nahtmaterial </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> ReflexClip-Applikator für den Wundverschluss </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Temgesic Injektionslösung </td><td> Essex Pharma AG </td></tr><tr><td> DMEM w / Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovin Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> Gewebekulturschale </td><td> Falke </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenimin 250 ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> n-Buttersäure, Natriumsalz </td><td> Sigma </td><td> B 5887 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Tube, dünnwandige, Polyallomer </td><td> Beckman </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> Modell 900 kleines Tier stereotaktischen Instrument </td><td> Kopf Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI pico-Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Controller und Micro4 Nanoliter2000 Injektor </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> Glas Ersatz 3,5 Nanoliter </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR Bohrer allgemeine Anwendung </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td><strong&gt; Antikörper </td><td> Lieferant </td><td> Katalog # </td><td> Verdünnung </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD Biosciences </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> Tabelle von Antikörpern. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

Somatischen Stammzellen sich teilen, um weitere Stammzellen (Expansion) oder mehr differenzierte Zelltypen (Differenzierung), die von grundlegender Bedeutung für das Tissue Formation während der embryonalen Entwicklung und Gewebshomöostase im Erwachsenenalter 1 ist zu generieren. Derzeit werden große Anstrengungen zur Steuerung des Schalters von somatischen Stammzellen von der Expansion zur Differenzierung, da diese wird angenommen, dass von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung neuer Strategien für die regenerative Medizin 1,2 investiert. Allerdings ist eine große Herausforderung in der Studie und die Verwendung von somatischen Stammzellen, dass ihre Expansion hat sich als sehr schwer zu kontrollieren. Hier beschreiben wir ein System, das die Steuerung der neuralen Stamm / Vorläuferzelle (insgesamt als NSC bezeichnet) Expansion in der embryonalen Maus Kortex oder des Hippokampus Erwachsenen durch Manipulation der die Expression des cdk4/cyclinD1 Komplex, ein wichtiger Regulator der G1-Phase ermöglicht des Zellzyklus und somatischen Stammzellen differentiation 3,4. Insbesondere werden zwei unterschiedliche Ansätze beschrieben, mit dem die cdk4/cyclinD1 Komplexes in NSR wird in vivo überexprimiert. Durch den ersten Ansatz wird Überexpression der Zellzyklus-Regulatoren durch Einspritzen Plasmiden für cdk4/cyclinD1 im Lumen des Maus Telencephalon gefolgt von Elektroporation in utero Sie um NSC des lateralen Kortex liefern somit Auslösen episomalen Expression der erhaltene Transgene 5-8. Durch den zweiten Ansatz werden hochkonzentrierte HIV-Viren abgeleiteten stereotaktisch im Gyrus dentatus des Hippocampus erwachsenen Maus injiziert, damit Auslösen konstitutive Expression der Zellzyklusregulatoren nach der Integration des Konstrukts in der viralen Genom der infizierten Zellen 9. Beide Ansätze, deren Grundlagen wurden bereits von anderen Video-Protokolle 10-14 beschrieben, wurden hier, um i optimiert) zu reduzieren Gewebeschäden, ii) target breite Abschnitte von sehr spezifischen Gehirn regions, iii) erzielen hohe Anzahlen von manipulierten Zellen innerhalb jeder Region, und iv) auszulösen hohe Expressionsniveaus der Transgene in jeder Zelle. Transiente Überexpression der Transgene mit den beiden Ansätzen mit unterschiedlichen Mitteln durch natürliche Verdünnung der elektroporierten Plasmide durch Zellteilung oder Tamoxifen Verwaltung in Cre-exprimierenden NSC mit Viren Durchführung cdk4/cyclinD1 von loxP-Stellen flankiert infiziert bzw. 9,15 dh erhalten . Diese Methoden stellen eine sehr leistungsfähige Plattform, um akut und Gewebe gezielt manipulieren die Expression von jedem Gen im Gehirn der Maus. Insbesondere durch die Manipulation der die Expression des Komplexes cdk4/cyclinD1 ermöglicht unser System die zeitliche Steuerung der Expansion NSC und deren Schalter auf Differenzierung, damit letztlich eine Erhöhung der Anzahl von Neuronen im Gehirn von Säugern erzeugt wird. Unser Ansatz kann von entscheidender Bedeutung für die Grundlagenforschung und die Verwendung somatischer Stammzellen für die Therapiedes zentralen Nervensystem von Säugetieren und gleichzeitig ein besseres Verständnis der i) Stammzellen Beitrag zur Gewebebildung während der Entwicklung, ii) Gewebshomöostase im Erwachsenenalter, iii) die Rolle der adulten Neurogenese in der kognitiven Funktionen, und vielleicht, iv) besser mit somatischen Stammzellen Zellen in Modellen von neurodegenerativen Erkrankungen.

<ol><li> Insgesamt ergibt Elektroporation in utero 60-80% der elektroporierten Embryonen Anzeigen starke Expression des Reportergens in einem weiten Bereich des seitlichen Kortex (Abbildung 3A). Fluoreszierende Proteine ​​kann leicht auf whole mount Embryonen sobald 3-6 Stunden nach der Operation werden mit dem Signal einer Dauer von mehr als einer Woche erfaßt. Innerhalb der Zielregion, ungefähr 30-50% der Zellen in der Regel das Transgen exprimieren (n) mit dem Anteil an Zellen Co-Expression von zwei (oder mehr) mit-elektroporierten Transgene wobei üblicherweise oberhalb 90% (3B, links) 6,8 , 15. Während ein minimales Niveau der Apoptose (ca. 2,0-2,5%) nach ca. 2 Stunden von Elektroporation beobachtet werden konnte, wird dieser Wert auf physiologische Werte (ca. 0,5-1,0%) nach ca. 6 Stunden (FC, unveröffentlichte Daten) zurück. Der Anteil von Embryonen oder trächtigen Mäusen sterbenden aufgrund der Operation ist typischerweise sehr gering (&lt;5%). Co-Elektroporation mit cdk4/cyclinD1 unter diesen Bedingungen, gefolgt von 48 Stunden Entwicklung löst eine Zunahme der Dehnung von neuralen Vorläuferzellen um 30% (3B, rechts, und C) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Ausbau der neuralen Vorläuferzellen durch cdk4/cyclinD1 Überexpression. (A) Fluoreszenz-Bild eines Schnittes durch die laterale Kortex eines Mausembryo 24 Stunden nach Elektroporation mit GFP und RFP Plasmide an embryonalen Tag 13. (B) Fluorescent Bilder wie in einem 48 Stunden nach Ko-Elektroporation mit cdk4/GFP und cyclinD1/RFP Plasmide und Immunomarkierung für den basalen Vorläuferzellen Marker tbr2. Fluorescent Reporter mit DAPI counterstainig (links) und tbr2 (rechts) dargestellt. Linien zeigt die apikale Oberfläche der ventrikulären Zone (VZ; weiße Linie) und die Grenzen des subventrikulären Zone (SVZ, gelb gestrichelte Linien). Beachten Sie die erhöhten thickness des SVZ im elektroporierten Abschnitt des Cortex (weiße Pfeile) aufgrund einer erhöhten Erzeugung und Expansion von basalen Vorläuferzellen nach Überexpression cdk4/cyclinD1. P &lt;0,05;, n = 3 (c) Quantifizierung des Effekts in B. Bars = SD gezeigt. Balkendiagramm in C von Lange et al., 2009 15 übernommen. <ol start="2"><li> Nach viralen stereotaktische Injektion, ca. 80% der Mäuse zeigen betätigten starke Expression der Transgene in der gesamten Gyrus dentatus. Konstitutive Expression von GFP können leicht auf 40 um Abschnitte sobald von 4 Tagen nach der Operation festgestellt. Entlang der rostralen Beträge kaudalen Achse des Gyrus dentatus, etwa 10-30% der Zellen (entspricht einer Gesamtausbeute von ca.. 10.000-30.000 Zellen) exprimieren das Transgen Regel (n) (4A) 9. Der Anteil von Mäusen sterben infolge der Operation ist vernachlässigbar (&lt;5%). Drei Wochen Überexpression von cdk4/cyclinD1 unter diesen Bedingungen löst eine Erhöhung der NSC um mehr als zwei-Falten (4B), während abnehmende Neurogenese um 70% (4C) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Wirkungen von Virusinfektion. (A) 3D-Rekonstruktion von 7 Fluoreszenzaufnahmen von 40 um dicke seriellen Kranzschnitte (1 Sammeln jedes 6) entlang der rostralen-zu-Schwanz-Achse des Hippocampus entnommen. GFP + infizierten Zellen (grün) und DAPI Kernfärbung (blau) des Gyrus dentatus dargestellt (oben). Hellfeld Bilder der Kranzschnitte entsprechend denen in A (Mitte) und 3D-Darstellung (unten) des gesamten Gehirnhälfte mit dem Hippocampus in grün Falschfarbe (aus dem Allen Brain Atlas modifiziert; hervorgehoben dargestellt <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . Weiße Pfeile zeigen die Injektionsstelle. Laterale (L), rostralen (R) und dorsal (D) Achsen (x, y, und z stereotaktischen Koordinaten) sind angegeben (rechts). (B und C) Anteil der Nestin + NSC (B) und DCX + neugeborenen Neuronen (C) innerhalb der Population GFP + infizierten Zellen 3 Wochen nach stereotaktische Injektion von GFP (weiß) oder cdk4/cyclinD1/GFP (schwarz) Viren. Bars = SD, p &lt;0,005; n = 3. Graphs in B und C aus Artegiani et al., 2011 übernommen.

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Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.6K Aufrufe.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. Steuern der Expansion von somatischen Stammzellen ist ein Hauptfaktor, was ihrer Studie und therapeutischen Verwendung. Hier beschreiben wir ein System zur zeitlich steuern Nervenstammzellen Expansion während der Entwicklung und im Erwachsenenalter, die verwendet werden, um die Zahl der Neuronen im Gehirn der Maus erzeugt erhöhen kann.

Serie: Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Erzeugung von Aktuell transgenen Ratten durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Biolumineszenz Screening

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

In Vivo Direkte Reprogrammierung von Resident Glial Cells in Interneurons durch Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

In Vivo Targeting von neuronalen Vorläuferzellen in Ferret Neocortex durch Utero Elektroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Stereotaktische virale Injektion und Gradientenindex-Linsenimplantation für Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

Organotypische Kulturen des adulten humanen Kortex als Ex-vivo-Modell für die Transplantation und Validierung humaner Stammzellen

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...