Diese Arbeit wurde von der Florida Center for Brain Tumor Research, Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapie und den National Institutes of Health (1R21CA141020-01) unterstützt.

Ein. Vorbereiten Glioblastoma Single Cell Suspension <ol><li> Gliomasphere Kultur aufgebaut und gepflegt mit dem Neurosphäre Assay (NSA), wie zuvor beschrieben 2,11,12. </li><li> Zum geeigneten Zeitpunkt für Passagieren der gliomaspheres wird das Medium mit den Kugeln entfernt, in einer geeigneten Größe sterilen Zellkulturgefäß und zentrifugiert bei 800 rpm (110 g) für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Der Überstand wird verworfen und das Pellet von Kugeln wird in 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA resuspendiert und bei 37 ° C in einem Wasserbad für 3-5 min. </li><li> Ein gleiches Volumen von Sojabohnentrypsininhibitor wird dann verwendet, um die Trypsin-Aktivität zu stoppen. </li><li> Die Zellsuspension wird sanft auf und pipettiert auf Homogenität und eine vollständige Neutralisation der Trypsin-Aktivität zu gewährleisten. </li><li> Die Zellsuspension wird erneut bei 800 UpM für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Zellen werden gewaschen und in 1 ml NeuroCultNSC Basal Medium. </li><li> 10 ul der Einzelzell-Suspension wird mit 90μl der Trypanblau eine Zellzahl durchzuführen vermischt. </li></ol> 2. Färbung mit Cell Trace Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE) Green Fluorescent Dye <ol><li> Für jede 1 Mio. Zellen angefärbt werden, wird 1 ml Färbereagenz durch Zugabe von 1 ul 5 mM Zelle Trace CFSE Farbstoff (Molecular Probes, Invitrogen) zu 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium, um eine endgültige Färbung Konzentration von 5 uM geben bereit . </li><li> Das Färbereagens, welche die Zellen ist gut bis Homogenität gemischt und bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Während der Inkubation wird eiskalten NeuroCult NSC Basal Medium als Abschrecken Lösung hergestellt. </li><li> Um die Färbung zu beenden, wird ungefähr 5-10 Volumina eiskaltem Abschrecken Lösung der CFSE-beladenen Zellen zugegeben. </li><li> Die Lösung wird dann bei 800 Upm 5 min zentrifugiert und der Überstand wird verworfen. </li><li> An thPunkt ist, sollte es ein Pellet von Zellen am Boden des Röhrchens werden mit einem hell-grünen Farbton der Farbe, der angibt, die Färbung war erfolgreich. </li><li> Die Zellen werden durch Resuspendieren des Pellets in 1-2 ml frisches NeuroCult NSC Basal Medium, Zentrifugieren bei 800 UpM für 5 min und Verwerfen des Überstands gewaschen. Diese Prozedur wird für insgesamt drei Waschungen wiederholt. </li><li> Nach der dritten Wäsche werden die Zellen in 1 ml NeuroCult NSC Basal Medium und eine Zellzahl resuspendiert durchgeführt wird. </li><li> Die CFSE gefärbten Zellen werden dann in sterilem Gewebekulturflaschen in angemessener Dichte [50.000 Zellen / ml] plattiert und in einem 37 ° C / 5% CO2 befeuchteten Inkubator. </li></ol> 3. CFSE Loading Verification <ol><li> Zellen in Kultur NSA ausplattiert können unter einem Fluoreszenzmikroskop zu CFSE Färbung überprüfen zu überwachen. In diesem Stadium weisen alle Zellen hellgrüne Farbe (Abbildung 1). Alternativ kann ein Tropfen der Zellsuspension ausCFSE gefärbten Zellen konnten auf einem Objektträger platziert und mit einem Deckglas abgedeckt, um Zellen unter dem Fluoreszenz-Mikroskop sichtbar zu machen. </li><li> Erfolgreiche CFSE Kennzeichnung ist ferner über Durchflusszytometrie bestätigt. So viele wie 1-5 x 10 5 Zellen von jeder Gruppe ist ausreichend für CFSE Färbung Verifikation. Die CFSE geladen Zellen und unbelasteten negativen Kontrollzellen jeweils in 1 x PBS-oder NeuroCult NSC Basal Medium bei einem Gesamtvolumen von 500 ul resuspendiert und in separaten FACS-Röhrchen. </li><li> Das Durchflusszytometer wird auf der Grundlage seiner Bedienungsanleitung Anweisungen für Parameter angepasst. CFSE eine Wellenlänge Anregungsmaximum von 492 nm und einer Emission von maximal 517 nm aufweist. </li><li> Zunächst werden die unbeladenen Kontrollzellen laufen und die erworbenen Ereignisse in Vorwärts-und side scatter (FSC vs SSC) und Histogramm aufgezeichnet und die wichtigsten Zellpopulation gated (Abbildung 2A). </li><li> Ähnlich werden die CFSE beladenen Zellen analysiert unter Verwendung der gleichen Parameters verwendet für Kontrollzellen (Abbildung 2B). </li></ol> 4. Isolierung der Slow-Division [dh CFSE Sicherungsring] Zellpopulation mit Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) <ol><li> Nach Spaltung wird CFSE Intensität verringert und hGBM Zellen zu bilden, der aus Zellen gliomaspheres ausstellenden verschiedenen Ebenen der grünen Fluoreszenz-Intensität (Abbildung 3) zusammengesetzt sind. Wenn die gliomaspheres haben eine durchschnittliche Größe von etwa 150 bis 200 um Durchmesser (ca. 5 bis 10 Tage nach der CFSE Beladung in Abhängigkeit von der Zelllinie Wachstumsrate) erreicht, wird das Medium mit den Kugeln entfernt, in einer geeigneten Größe steriler Gewebekultur Rohr und zentrifugiert bei 800 UpM für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Eine Einzelzell-Suspension wird hergestellt, wie im Stand der beschriebenen Schritte und die Zellen werden in PBS für eine Zellzahl resuspendiert, um eine Zellsuspension mit einer Dichte von bis zu 10 7 Zellen pro Milliliter vorzubereiten. </li><li> Achterner Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen PBS wird Propidiumiodid (PI, Sigma, 500 ug / ml) in einer Konzentration von 1 ul / ml Zellsuspension, um tote Zellen auszuschließen, wenn sortiert / mittels Durchflusszytometrie analysiert zugegeben. </li><li> Zwei 15 ml steriler Gewebekultur Röhrchen mit jeweils 1 ml der vollständigen NeuroCult NSC Medium verwendet wird, um die sortierten langsamen teilende Zellen (CFSE Zurückhalten Zellen) und die schnellen teilenden Zellen (CFSE Verdünnen Zellen) zu sammeln. </li><li> Zuerst wird die Zellsuspension aus der unbelasteten Zellengruppe durch das Durchflusszytometer laufen. </li><li> Die Zellen (Ereignisse) basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC) versus Seitenstreuung (SSC) und Spannungsparameter für beide Parameter aufgetragen werden so eingestellt, dass die Mehrzahl der Zellen in der Strömung Parzelle enthalten sind. </li><li> Um tote Zellen auszuschließen oder beschädigt werden die Zellen basierend auf SSC gegen PI Reaktivität aufgetragen und die einzelne lebende Zellpopulation (PI negativ) ist gated. </li><li> Dann wird eine homogene Zellpopulation basierend auf f ausgewähltorward Scatter (FSC) versus seitliche Streulicht (SSC). </li><li> Die homogene einzelne lebende Zellpopulation wird dann in einem Histogramm Zelle Frequenz gegenüber CFSE Intensität auf einer logarithmischen Skala eingestellt Basis aufgetragen. Die CFSE Laserintensität eingestellt wird, um das negative Signal zwischen 0 und 100 zu platzieren. </li><li> Mit den gleichen Parametern und eine ähnliche Gating Strategie werden die markierten Zellen durch CFSE Durchflusszytometer laufen und analysiert (4C). </li><li> Anschließend werden ein langsames Dividieren Population von Zellen und einer Gesamtpopulation (schneller teilenden Zellen), basierend auf ihrer Fähigkeit, CFSE (CFSE Hochspitze 5% und CFSE niedrigem Boden 85%, jeweils) zu halten identifiziert. </li><li> Diese unterschiedlichen Zellpopulationen werden dann in separate 15 ml sterile Zellkultur Röhrchen 1ml von kompletten NSC Medium sortiert. </li><li> Sortierten Zellen werden dann bei 800 Upm 5 min zentrifugiert. </li><li> Überstand wird verworfen und das Pellet wird resuspendiert in einem entsprechendsprechende Volumen Medium (abhängig von der Anzahl der getrennten Ereignissen oder Pelletgröße) und einer Zellzahl erfolgt. </li><li> Zellen aus den verschiedenen sortierten Populationen werden dann bei 50.000 Zellen pro Milliliter in einer geeigneten sterilen Zellkulturflasche ausplattiert und in einem 37 ° C / 5% CO2 befeuchteten Inkubator für 5-10 Tage, bevor sie seriell passagiert oder zur nachgeschalteten Experimenten. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Nach CFSE Laden, präsentieren alle Zellen eine intensive grüne Fluoreszenz sichtbar unter dem Mikroskop (Abbildung 1). Diese grün getönten Farbe kann sogar mit dem bloßen Auge (siehe Video) gesehen werden. Die Analyse dieser Zellen mit Durchflusszytometrie zeigt auch sehr intensive grüne Fluoreszenz im Vergleich zur Kontroll-Zellen (Abbildung 2). Nach plating CFSE geladen Zellen in Neurosphäre Kultur, vermehren sich diese Zellen und bilden 150-200 um gliomaspheres in 5-10 Tagen. Da die Zellen proliferieren, t<html> er Fluoreszenzfarbstoff gleichmäßig zwischen Tochterzellen auf Bereiche verteilt werden, was zu einer Halbierung der Fluoreszenzintensität mit jeder Zellteilung. Glioblastome sind funktionell heterogen und werden von Zellen proliferieren auf unterschiedlichen Zeitskalen zusammengesetzt. Das Verfahren in dieser beschriebenen Protokoll ermöglicht einem, zu identifizieren und zu isolieren, schneller und langsamer teilenden Zellen durch ihre Fähigkeit, zu verdünnen oder zu behalten CFSE bzw. (Abbildung 3, siehe auch die Video). Durchflusszytometrieanalyse von dissoziierten gliomaspheres aus CFSE-beladenen Zellen im Vergleich zur unbelasteten Zellen erzeugt zeigt diverse CFSE Retentionseigenschaften (Abbildung 4). Schnell teilende Zellen (unten 85%) oder langsam teilenden Zellen (die obersten 5% - CFSE hoch) Ausstellung gliomapshere Fähigkeit zur Bildung, wenn in den Neurosphäre Testbedingungen (Abbildung 5) kultiviert. gure 1 &quot;/&gt; Abbildung 1. Dissoziierte Tumorzellen unmittelbar nach dem Laden mit CFSE Farbstoff. Die Zellen zeigen hellgrüne Farbe zeigen erfolgreiche Kennzeichnung. Ursprüngliche Vergrößerung, 10 x. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. CFSE Laden der Bestätigung mittels Durchflusszytometrie. A) unbeladen Zellen, B) CFSE geladen Zellen und C) im Vergleich CFSE Fluoreszenzintensität im beladenen gegenüber unbelasteten Zellen. Beachte, dass es mehrere Größenordnungen Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den markierten und unmarkierten Zellen. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Ein Vertreter gliomasphere aus einer CFSE-beladenen Zelle 6 Tage nach dem Ausplattieren abgeleitet. Einige Zellen weisen sehr hell CFSE Färbung. Ursprüngliche Vergrößerung, 63 x. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; alt = &quot;Bild 4&quot; /&gt; Abbildung 4. Vertreter Durchflusszytometrie Grundstücke / Histogramme zur Isolierung von schnellen und langsamen teilenden Zellen 6 Tage nach CFSE Färbung. A) FSC vs SSC den gesamten Zellpopulation zeigen, B) SSC vs PI Reaktivität, um tote oder beschädigte Zellen auszuschließen, C) FSC vs SSC zum Gate eine homogene Live Zellpopulation, D) zeigt das Vorhandensein von CFSE Beibehaltung Zellen 6 Tage nach CFSE Kennzeichnung durch eine größere Intensität der Fluoreszenz im Vergleich zur negativen Kontrolle nachgewiesen. Das Histogramm zeigt auch, dass die CFSE Intensität über die Zeit. E verfiel) Histogramm zeigt die Gating-Strategie CFSE Beibehaltung Zellen (Top 5%) und CFSE Verdünnen Zellen (unten 85%) zu identifizieren. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Vertreter gliomaspheres generiert aus <strong&gt; A) schnell teilenden Zellen (CFSE niedrig) und B) langsam teilenden Zellen (CFSE hoch). Original Vergrößerung:. 10x und 20x bzw. C) Vertreter Zellzahl von schnell oder langsam teilenden Zelle abgeleitete Kultur Durchlaufzeit erhalten. P &lt;0,05, t-Test. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

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(56), e3633-e3633 (2011).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine wachsende Zahl von Studien haben die Bedeutung eines langsamen teilende Unterabteil von Zellen in Krebszellen, die Tumorbildung und Therapieresistenz 2-8 beitragen demonstriert. Daher ist es wichtig, zu beschreiben und zu standardisieren experimentellen Methoden, mit denen das Studium dieser spezifischen Subpopulation von Zellen oder mehr allgemein Subpopulationen mit unterschiedlichen Wachstumsraten vergleichen. Mit CFSE zu identifizieren und zu isolieren, Sub-Fraktionen von Zellen auf ihre Rate der Zel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Typ </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Basal Medium (Human) </td><td> Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) </td><td> Medium Ergänzung </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> 0,05% Trypsin-EDTA </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> Sojabohnentrypsininhibitor </td><td> Reagens </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin </td><td> Reagens </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25-Flasche </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 Kolben </td><td> Kultur ware </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> 50 ml Röhrchen </td><td> Kultur ware </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Wachstumsfaktor </td><td> R &amp; D </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit </td><td> Fluorescent Cell Division Markierungsfarbstoff </td><td> Molecular Probes, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse)

Tumorheterogenität stellt eine grundlegende Funktion tragenden Tumor Robustheit und stellt eine zentrale Hindernis für die Entwicklung von therapeutischen Strategien ein. Um das Problem der Tumorheterogenität zu überwinden, ist es wichtig, Tests und Tools ermöglichen phänotypische, (epi) genetische und funktionelle Identifizierung und Charakterisierung von Tumor-Subpopulationen, die spezifische Krankheit Krankheiten zu fahren und stellen klinisch relevante Ziele zu entwickeln. Es wird jetzt allgemein anerkannt, dass Tumore unterschiedlichen Sub-Fraktionen von Zellen mit unterschiedlichen Frequenzen der Zellteilung zeigen, und dass die funktionalen Kriterien der langsamen Rad positiv mit Tumorbildung Fähigkeit in mehreren Krebsarten einschließlich des Gehirns, der Brust, der Haut und die damit verbundenen Bauchspeicheldrüse sowie Leukämie 2-8. Der Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) hat zum Verfolgen der Teilung Häufigkeit von Zellen in vitro und in vivo im Blut übertragbaren t verwendetumors und soliden Tumoren wie zB Glioblastoma 2,7,8. Das Zell-permeierenden nicht fluoreszierenden Prodrug CFSE wird durch intrazelluläre Esterasen in eine fluoreszierende Verbindung, die innerhalb der Zellen durch kovalentes Binden an Proteine ​​durch Reaktion seiner Succinimidyl-Komponente mit intrazellulären Amingruppen zu bilden stabile Amidbindungen 9 zurückgehalten wird umgewandelt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird gleichmäßig zwischen Tochterzellen auf Bereiche verteilt werden, was zu einer Halbierung der Fluoreszenzintensität mit jeder Zellteilung. Dies ermöglicht die Verfolgung von Zellzyklus Frequenz von bis zu 8-10 Runden Teilung 10. CFSE Rückhaltevermögen wurde mit Hirntumorzellen zur Identifizierung und Isolierung eines langsamen Rad Subpopulation (obere 5% Farbstoff haltenden Zellen) nachgewiesen, bei Krebs Stammzellaktivität 2 angereichert werden. Dieses Protokoll beschreibt die Technik der Färbung von Zellen mit CFSE und die Isolierung einzelner Populationen innerhalb einer Kultur von menschlichen GlioBlastom (GBM)-abgeleiteten Zellen mit unterschiedlichen Teilungsraten mittels Durchflusszytometrie 2. Die Technik hat dazu gedient, zu identifizieren und zu isolieren, einen Hirntumor slow-cycling Population von Zellen, die aufgrund ihrer Fähigkeit, die CFSE Kennzeichnung erhalten.

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Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Diese Video-Protokoll zeigt die Anwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) zur Identifikation und Trennung von verschiedenen Subpopulationen von Zellen in humanen Glioblastomzellen nach der Häufigkeit des Zellteilung basiert.

Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

14.0K Aufrufe.  The University of Florida. Diese Video-Protokoll zeigt die Anwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) zur Identifikation und Trennung von verschiedenen Subpopulationen von Zellen in humanen Glioblastomzellen nach der Häufigkeit des Zellteilung basiert.

Serie: Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Isolation, Charakterisierung und vergleichende Differenzierung humaner Dental Pulp Stammzellen aus bleibenden Zähne mit zwei verschiedenen Methoden abgeleitet

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Forschung

Medizin

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolierung von Krebs Stammzellen aus menschlichen Prostatakrebs-Proben

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Intranasale Abgabe von therapeutischen Stammzellen an Glioblastom in einem Mausmodell

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...