Die Autoren bedanken sich bei Dr. Lubor Borsig (Institut für Physiologie, Universität Zürich) für seine Ratschläge danken auf der Technik der Lungenperfusion. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Krebsliga des Kantons Zürich, der Walter L. und Johanna Wolf-Stiftung, Zürich, der Lydia Hochstrasser-Stiftung, Zürich, der Swiss National Science Foundation, SNF, der Schweiz, Schweizerischer Verein Balgrist und der Universität unterstützt Zürich.

1. In-situ Lung Perfusion und Fixation <ol><li> Anästhesieren Mäusen durch ip Injektion von ~ 150 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 112,5 mg / kg (Körpergewicht) Ketamin, 16,5 mg / kg Xylazin und 15 mg / kg Acepromazin (oder durch eine andere geeignete Anästhesie enthält Schmerzmittel). </li><li> Wenn Reflexe der Maus nicht mehr beobachtet werden, fixieren sie auf dem OP-Tisch zurück-down-und benetzen das Fell mit 70% Ethanol zu slick den Haaren nach unten. </li><li> Öffnen Sie die Haut vom Bauch bis zum Hals und ziehen Sie sie an den Seiten oder entfernen. </li><li> Öffnen Sie das Bauchfell und den Brustkorb auf eine reichliche Größe. Verhindern von großen Brüchen Gefäße (zB die Vena jugularis) in reduzierter Effizienz der nachfolgende Perfusion vermeiden. </li><li> Schneiden Sie die Vena cava caudalis unter der Leber. </li><li> Verwenden eines 20-ml-Spritze mit einer 21G ausgestattet - 24G Nadel langsam 10-15 ml PBS in den rechten Ventrikel des schlagenden Herzens zu injizieren, bis die Lungen vollständig weiß unddas Herz aufhört zu schlagen (Asystolie). </li><li> Abkneifen die Blutgefäße der Leber und der Membran mit einer Gefäßklemme. </li><li> Eine 10 ml Spritze mit einer 21G ausgestattet - 24G Nadel auf ~ 2 ml 3% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in den rechten Ventrikel zu injizieren. </li><li> Entdecken Sie die Luftröhre außerhalb des Thorax. Verwenden das gleiche Spritze auf ~ 3 ml 3% PFA in PBS kraniale (außerhalb des Thorax) injizieren in die Trachea bis zur Lunge aufgeblasen wird. Unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel, abkneifen die Luftröhre kaudalen der Punktion mit einer Gefäßklemme und für 10 min, um die Fixierung zu ermöglichen. </li><li> Durchschneiden die Blutgefäße oberhalb der Gefäßklemme, entfernen die Klemme und injizieren ~ 2 ml PBS in die rechte Herzkammer, um überschüssiges PFA entfernen. </li><li> Punktieren der unteren Teile aller Lungenlappen mit einer Nadel, entfernen die Gefäßklemme an der Trachea und injizieren 3-5 ml einer Lösung von PolyFreeze Einbettungsmedium / PBS 1:1 in der Luftröhre kaudalen des ersten Punktion bis PFA in der LungeLappen durch die Lösung ersetzt. </li><li> Entfernen Sie die Lunge sorgfältig, indem das Herz mit einer Pinzette und durch Durchschneiden des Bindegewebes Bändern, Blutgefäßen und der Luftröhre. Halten Sie das Herz an der Lunge. </li><li> Je nachdem, wie mit dem Lungengewebe Analyse gehen mit den Protokollen in den Abschnitten 2 und 3 beschrieben fortsetzen. Wenn Sie beide Analysen durchführen möchten, entfernen Sie ein Lungenlappen und wie unter 3 beschrieben. Verarbeiten Sie die verbleibenden Lappen mit dem Herzen wie unter Punkt 2 beschrieben. </li></ol> 2. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Entire Lungenlappen <ol><li> Legen Sie die Lunge in einen Plastikbecher mit engen schließenden Deckel aufsetzen und mit 2% Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30-60 min. </li><li> Entfernen Fixierungslösung und gründlich 3-mal mit PBS. </li><li> Hinzufügen mindestens 10 ml frisch hergestellte 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal) Färbelösung (X-Gal Stammlösung [40 mg / ml inDimethylformamid] 1:40 verdünnt in Basic Färbelösung; pH 7,1 (Tabelle 1); vor Licht schützen). </li><li> Legen Sie ein Stück Gaze auf der Oberseite des Swimming Lungen, um es vollständig zu halten in der Lösung und setzen Sie den Deckel nur lose auf dem Topf, den Austausch von Luft zu ermöglichen. </li><li> Inkubation bei 37 ° C für 3-5 Stunden vor Licht geschützt. </li><li> Entfernen X-Gal-Lösung, einmal mit PBS spülen, um restliches X-Gal-Lösung (optional) entfernen und 4% PFA. </li></ol> 3. Visualisierung von lacZ-markierten metastatischen Tumorzellen in Lung Kryoschnitte <ol><li> Vorfüll ein markiertes Einbettform bis 1/3 mit unverdünntem PolyFreeze Einbettungsmedium. Legen Sie die Lungenlappen oben und füllen sich mit Einbettmedium bis der Lappen vollständig bedeckt ist. Versuchen Sie, um Blasen zu verhindern. </li><li> Inkubieren der eingebetteten Lungen bei 4 ° C für 20 min. </li><li> Dann frieren die eingebettete Lunge langsam in einer Mischung aus Trockeneis und Isopentan und bei -80 ° C. </li><li> Cut 7-10 um KryoAbschnitte auf einem Kryostaten und montieren sie auf SuperFrostPlus Objektträger. </li><li> Inkubiere die Abschnitte sofort mit X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer. </li><li> Spülen Sie die Objektträger in PBS 2 mal für 5 min und dann kurz in destilliertem Wasser. </li><li> Counter-Fleck mit Kernechtrot für 10-30 sec gründlich in destilliertem Wasser und montieren Sie die Folien mit Immu-Mount. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Asai et al. Im ursprünglichen Artikel auf der Dunn-OS abgeleiteten LM8 Mausmodell dass sc Primärtumoren von den parentalen Dunn Zellen abgeleitet, die sich von denen aus der hoch metastatischen LM8 Sub-Zelllinie abgeleitet sind, nicht spontan bilden nachweisbare Lungenmetastasen in gemeldet syngenen C3H Mäusen 14. Mit den hier berichteten Techniken, untersuchten wir die Bildung von Metastasen in den Dunn/LM8 Maus OS-Modelle. Wir nutzten stabile lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zelles und eines Protokolls für in-situ Lungenperfusion und Fixierung in Mäusen. Repräsentative Bilder perfundierten und nicht-perfundierten Lungen von Mäusen subkutan injiziert mit lacZ-transduzierten und nicht-transduzierten Steuerung Dunn und LM8 Zellen in Abbildung 1 gezeigt. In Mäusen, die mit Zellen injiziert Steuerung Dunn blieb makroskopischen und mikroskopischen Metastasen in nicht nachweisbar nicht perfundierten und perfundierten Lunge (1A, i-iv). Aber interessanterweise in Mäusen mit Dunn-lacZ-Zellen injiziert, offenbarte X-gal-Färbung blauen mikrometastatischen Foci von Einzelzellen oder kleinen Zellaggregaten (&lt;0,1 mm) auf der Oberfläche des nicht-perfundierten Lunge (Abbildung 1A, vi). Im situ Perfusion und Fixierung der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Dunn-lacZ Mikrometastasen (1A, viii). Jedoch wurde Auswuchs auf makroskopische Foci nicht beobachtet (Abbildung 1A, V, VII). &lt;/ P&gt; Bei Mäusen mit Steuerung LM8 Zellen, transluzent, kaum nachweisbar macrometastatic Foci injiziert größer als 0,1 mm Durchmesser wurden im nicht-perfundierten Lunge (1B, i) erfasst. Perfusion der Lunge (1B, iii) nicht verbessert die Erkennung der Brennpunkte. Jedoch in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen injiziert mehrere X-Gal blau gefärbt makro-(1B, v) und Mikrometastasen (1B, vi) wurden auf der Oberfläche von nicht-perfundierten Organen detektiert. Darüber hinaus Perfusion der Lunge weiter verbessert die Erkennbarkeit von Makro-und Mikrometastasen (Abbildung 1B, VII - VIII). Folglich wurde der Mikro-und sichtbaren Makrometastasen bei einer höheren Dichte und einer größeren Anzahl, hauptsächlich aufgrund der Durchsichtigkeit des perfundierten Gewebe, in dem Brennpunkte unterhalb der Organoberfläche wurde ebenfalls sichtbar. Ein zusätzlicher histological Analyse mit Gefrierschnitten des Lungengewebes bestätigt die verbesserte Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bei Mäusen mit lacZ-transduzierten Dunn und LM8 Zellen injiziert. Bei Mäusen mit Primärtumoren von Dunn-lacZ oder lacZ LM8-Zellen abgeleitet wurden im Gegensatz zu Mäusen, die mit primären Tumoren der jeweiligen Kontrollzellen, Mikrometastasen oder sogar einzelne Zellfoci in Lungenschnitten (Abbildung 2) erfasst. Darüber hinaus waren auch Makrometastasen deutlicher sichtbar in Mäusen mit LM8-lacZ-Zellen als bei Tieren mit der Steuerung LM8 Zellen (2C, D) injiziert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Abbildung 1. Nachweis von spontanen Metastasen von nicht-transduzierten (i-iv) und lacZ-transduzierten (v-viii) Dunn (A) und LM8 (B) Zellen im nicht-perfundierten (i, ii, v, vi) und perfundierten (iii, iv, vii, viii) Lungen in C3H-Mäusen. Metastasen in repräsentativen X-Gal-stained ganzen Lunge (v, vii in A und B) und die entsprechenden Nahaufnahmen (vi, viii in A und B) blau erscheinen. Macrometastatic Brennpunkte (&gt; 0,1 mm) in den Organen von Mäusen mit nicht-markierten Zellen LM8 (i-iv in B) eingespritzt sind durch Sternchen gekennzeichnet. Bereiche, in Nahaufnahmen sind repräsentativ für die gesamte Lunge. Maßstab Balken zeigen 1 mm in Bildern ganzer Lunge und 0,1 mm in Nahaufnahmen. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Abbildung 2. Erkennung von Dunn und LM8 Mikrometastasen in der Lunge Kryoschnitten. Abschnitte von OCT eingebettet Lungengewebe wurden in X-Gal-Färbung Lösung bei 37 ° C für 24 Stunden in einer befeuchteten Kammer inkubiert und dann gegengefärbt mit Kernechtrot. Pfeile zeigen auf mikrometastatischen Foci in Lungenschnitten von Mäusen mit Dunn-lacZ (B) oder LM8-lacZ-Zellen (D) eingespritzt erfasst. Micrometastases blieb nicht nachweisbar in Lungenschnitten von Mäusen mit nicht-transduzierten Dunn (A) oder LM8 Zellen (C) injiziert. Maßstab Balken zeigen 0,1 mm.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellten Ergebnisse im Dunn/LM8 Maus OS Modells demonstrieren die Macht des neu gegründeten Methode, die die X-Gal-Färbung von lacZ-markierten Tumorzellen mit in-situ Perfusion / Fixierung von Lungengewebe kombiniert. Diese Kombination der beiden Techniken ermöglicht eine hohe Empfindlichkeit Nachweis von Mikrometastasen Läsionen bis zum einzelnen Zellebene und verbessert auch die Visualisierung von Makrometastasen auf der Lungenoberfläche (Abbildung 1) als auch in der Lunge Abschnitten (Abbildung 2). Während die X-Gal-Färbung ermöglicht auch die Detektion von (Mikro-) Metastasen in anderen Organen, in-situ-Perfusion / Fixierung verbessert die Erkennbarkeit der metastatischen Foci in anderen Geweben als der Lunge nur leicht aufgrund der natürlichen Blut-und Gewebe-bezogene Farbe 13 dieser Organe. Selbst wenn die Perfusion einem anderen Organ gerichtet ist, zB der Leber, wären Entfernung des Blutes nur teilweise Verbesserung des Kontrasts Wetteschen X-Gal-Färbung und die natürliche Farbe des Organs. Jedoch ist das Verfahren anwendbar auf jede Art von lacZ-markierten Tumorzellen ist, wird die Gewinnung und Nachweisbarkeit von Lungenmetastasen bis auf die Ebene der ruhenden einzelligen Mikrometastasen und ermöglicht eine einfache und zuverlässige Quantifizierung von Makro-und Mikrometastasen. Eine Einschränkung dieses Verfahrens und alle anderen Techniken, die auf Reportergenen, einschließlich Luciferase und fluoreszierende Proteine, bezogen sind, ist die Stabilität der Transgen-Expression. Wie in 2d gezeigt ist, werden nicht alle Tumorzellen innerhalb der Herde macrometastatic blau gefärbt, was auf ein Fehlen von beta-Galactosidase-Aktivität. Das könnte im Zusammenhang mit Nekrose, aber es ist wahrscheinlicher, auf einen Verlust der Transgenexpression. Wir beobachteten, dass die Dunn und LM8 Zellen sehr wirksam bei der Herabregulierung von lacZ und andere Transgene auch unter kontinuierlicher Selektion auf Expression sind. Deshalb schaltet in neueren Studien der murinen K12und K7M2 und die menschlichen HOS, 143B und Saos-2 Osteosarcom-Zelllinien, die alle stabil lacZ-Expression in vitro als auch in vivo bis zu 100% der Zeit beibehalten wird. Sobald stabile lacZ-Expression garantiert wird, kann diese Technik in Studien mit genmanipulierte Tumorzellen, zB um mechanistisch untersuchen den Prozess des Gewebes Kolonisierung 13 sowie für die Entwicklung und Erprobung neuer Therapien dem Ziel Tilgung der metastatischen Läsionen 15 angelegt werden , 16. Weiterhin kann als Richtwert für die Verbesserung des aktuellen radiologischen Bildgebung, wie PET, (Mikro-) CT-und MRI, für die frühe Erkennung des metastatischen Läsionen verwendet dienen. In einer kürzlich durchgeführten Studie PET (unveröffentlicht) mit unterschiedlichen Tracer wir überprüft die in vivo nachgewiesen Lungenmetastasen anschließend ex vivo mit dem beschriebenen Protokoll. In einer laufenden Studie mit einem neuen Kleintier Mikro-CT (SkyScan) sind wir so weit able, um Lungenmetastasen in vivo nachzuweisen bis zu einer Größe von 0,5 mm und ex vivo bis zu 0,3 mm, aber wir wollen mit einer Auflösung von 0,1 mm. Interessanterweise ist dies die maximale Größe, die wir zu unterscheiden Makro-von Mikrometastasen mit dem kombinierten Verfahren der in-situ Perfusion und X-Gal-Färbung eingestellt. Dies unterstreicht erneut die Empfindlichkeit und die Nützlichkeit dieses einfache und kostengünstige Technik.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Narketan10 (Ketamin) </td><td> Vétoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml Lösung </td></tr><tr><td> Xylazin (Xylazin) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml Lösung </td></tr><tr><td> Prequilan (Acepromazin) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml Lösung </td></tr><tr><td> Bulldog Typ Serrefine Gefäßklemme </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18051-35 </td><td> gekrümmten, 35 mm </td></tr><tr><td> Plastikbecher mit Deckel </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> 25 ml Becher mit Deckel </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal); Pulver </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> lösen sich in N, N-Di-Methylformamid bis 40 mg / ml, Lagerung Licht geschützt bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Grundlegende Färbelösung, äquilibriert auf pH 7,1, gelagert Licht geschützt bei 4 ° C für max. 1 Monat </td><td> selbst gemacht </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1,64 g / L K3Fe (CN) 6, 2,1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 ml / L 1M MgCl2, 2 ml / L 10% NP40, 1 ml / L 10% Natrium-Desoxycholat </td></tr><tr><td> PolyFreeze Embedding Medium </td><td> Polysciences; Schweizer Vertrieb: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Einbettform </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 Kryostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost Dias </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nuclear-Fast Red - Aluminium-Sulfat-Lösung </td><td> Abteilung Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> Immu-Mount </td><td> Thermo Electron, Schweizer Vertrieb: HistoCom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung.

improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and x-gal staining of lacz-tagged tumor cells

Metastasierung ist die häufigste Todesursache in den meisten Krebsarten und daher ein Schwerpunkt in der Krebsforschung. Allerdings bleiben die Detektion von Mikrometastasen durch radiologische Bildgebung und dem Erfolg in ihrer therapeutischen Tilgung begrenzt. Während Tiermodellen erwiesen haben unschätzbare Werkzeuge für die Krebsforschung 1 sein, bleibt die Überwachung / Visualisierung von Mikrometastasen eine Herausforderung und ungenaue Auswertung der Metastasierung in präklinischen Studien möglicherweise zu enttäuschenden Ergebnissen in klinischen Studien 2. Folglich besteht ein großes Interesse bei der Verfeinerung der Methoden, um endlich zu reproduzierbaren und zuverlässigen Nachweis von Metastasen bis in die einzelne Zelle Ebene in normalem Gewebe. Das Hauptaugenmerk liegt daher auf Techniken, die den Nachweis von Tumorzellen in vivo zu ermöglichen, wie Mikro-Computer-Tomographie (Mikro-CT), Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Biolumineszenz oder Fluoreszenzabbildung &lt;sup&gt; 3,4. Wir derzeit Optimierung dieser Techniken zur in vivo Überwachung des primären Tumorwachstum und Metastasierung in verschiedenen Modellen Osteosarkom. Einige dieser Techniken können auch für die ex vivo-Analyse von Metastasen neben klassischen Methoden wie qPCR 5, 6 oder FACS verschiedenen histologischen Färbung verwendet werden. Als Maßstab haben wir in der vorliegenden Studie stellte die stabile Transfektion oder Transduktion der Tumorzellen mit dem lacZ Gen, das das bakterielle Enzym β-Galactosidase, die das chromogene Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D metabolisiert -galactopyranosid (X-Gal) an einen unlöslichen Farbstoff Indigoblau 7 und ermöglicht hochempfindlichen und selektiven histochemische Färbung der Tumorzellen in der Maus Gewebe ex vivo auf der einzigen Zelle Ebene wie hier dargestellt. Dies ist ein Low-Cost-und nicht Geräte-intensive Werkzeug, das eine präzise Validierung von Metastasen 8 in Studien, in denen neue ein ermöglichtticancer Therapien 9-11. Ein limitierender Faktor X-gal-Färbung ist die geringe Unterschied zu blutsverwandten rote Färbung von gut vaskularisierten Geweben wie zB. Im Lungengewebe kann dieses Problem durch in-situ Lungenperfusion, eine Technik, die vor kurzem von Borsig et al. 12, der die Lungen von Mäusen unter Narkose perfundiert, um sie aus dem Blut zu löschen und zu fixieren und diese in-situ unter etabliert gelöst werden Inflation durch die Luftröhre. Diese Methode verhindert auch den Zusammenbruch der Lunge und hält dadurch die Morphologie der funktionellen Lungenalveolen, die die Qualität des Gewebes für die histologische Analyse verbessert. In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein neues Protokoll, das ausnutzt einer Kombination von X-gal-Färbung von lacZ-exprimierenden Tumorzellen und in-situ-Perfusion und Fixierung von Lungengewebe. Dieses elegante Protokoll ermöglicht hochempfindliche Nachweis von einzelnen metastatischen Zellen in der Lunge und es uns ermöglicht, in einer aktuellen Studie zu derwähle &quot;ruhend&quot; Lunge Mikrometastasen in einem Maus-Modell 13, die ursprünglich beschrieben wurde als nicht-metastasiertem 14.

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Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Das erfindungsgemäße Protokoll in der vorliegenden Studie berichtet ermöglicht selektiven Nachweis von Lungenmetastasen in einzelne Zelle Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Lungenperfusion und Fixierung und X-Gal-Färbung von<em&gt; LacZ</emTumorzellen&gt;-Tag.

Verbesserte Visualisierung von Lungenmetastasen bei Single Cell Auflösung in Mäusen durch kombinierte<em&gt; In-situ</em&gt; Perfusion des Lungengewebes und X-Gal Färbung von<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

17.2K Aufrufe.  Balgrist University Hospital, Zurich. Das erfindungsgemäße Protokoll in der vorliegenden Studie berichtet ermöglicht selektiven Nachweis von Lungenmetastasen in einzelne Zelle Auflösung in Mäusen durch kombinierte In-situ Lungenperfusion und Fixierung und X-Gal-Färbung von LacZ-Tag.

Serie: Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Methode Isolated<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Forschung

Medizin

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primärtumor und MEF Zellisolation zu Lungenmetastasen Studieren

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Beurteilung von Lungenmetastasen in Maus-Mammatumormodelle durch quantitative Echtzeit-PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Offene Tracheotomie Magensäure Aspiration Mausmodell der akuten Lungenschädigung Ergebnisse in Maximal Akute nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) used as 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) represent an elegant and biologically highly relevant 3D cell culture model, which highly resemble in situ tissue due to their complexity, biomechanics and molecular composition. Tissue slicing is widely applied in various animal models. 3D-LTCs derived from human PCLS can be used to analyze responses to novel drugs, which might further help to better understand the mechanisms and functional effects of drugs in human tissue. The preparation of PCLS from surgically resected lung tissue samples of patients, who experienced lung lobectomy, increases the accessibility of diseased and peritumoral tissue. Here, we describe a detailed protocol for the generation of human PCLS from surgically resected soft-elastic patient lung tissue. Agarose was introduced into the bronchoalveolar space of the resectates, thus preserving lung structure and increasing the tissue&#39;s stiffness, which is crucial for subsequent slicing. 500 &#181;m thick slices were prepared from the tissue block with a vibratome. Biopsy punches taken from PCLS ensure comparable tissue sample sizes and further increase the amount of tissue samples. The generated lung tissue cultures can be applied in a variety of studies in human lung biology, including the pathophysiology and mechanisms of different diseases, such as fibrotic processes at its best at (sub-)cellular levels. The highest benefit of the 3D-LTC ex vivo model is its close representation of the in situ human lung in respect of 3D tissue architecture, cell type diversity and lung anatomy as well as the potential for assessment of tissue from individual patients, which is relevant to further develop novel strategies for precision medicine.

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

Here, we present a protocol for the preparation of agarose-filled human precision-cut lung slices from resected patient tissue that are suitable for generating 3D lung tissue cultures to model human lung diseases in biological and biomedical studies.

Generation von menschlichen 3D Lungengewebe Kulturen (3D-LTCs) für Krankheit Modellierung

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Quantitative Analyse der zellulären Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen der glatten Muskulatur Zelle Abstammung-Tracing Mäuse

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ quality exacerbated by excessive geographic transportation distance and stringent donor organ acceptance criteria pose limitations to current LTx efforts. Ex situ lung perfusion (ESLP) is an innovative technology that has shown promise in attenuating these limitations. The physiologic ventilation and perfusion of the lungs outside of the inflammatory milieu of the donor body affords ESLP several advantages over traditional cold static preservation (CSP). There is evidence that negative pressure ventilation (NPV) ESLP is superior to positive pressure ventilation (PPV) ESLP, with PPV inducing more significant ventilator-induced lung injury, pro-inflammatory cytokine production, pulmonary edema, and bullae formation. The NPV advantage is perhaps due to the homogenous distribution of intrathoracic pressure across the entire lung surface. The clinical safety and feasibility of a custom NPV-ESLP device have been demonstrated in a recent clinical trial involving extender criteria donor (ECD) human lungs. Herein, the use of this custom device is described in a juvenile porcine model of normothermic NPV-ESLP over a 12 h duration, paying particular attention to management techniques. Pre-surgical preparation, including ESLP software initialization, priming, and de-airing of the ESLP circuit, and the addition of anti-thrombotic, anti-microbial, and anti-inflammatory agents, is specified. The intraoperative techniques of central line insertion, lung biopsy, exsanguination, blood collection, cardiectomy, and pneumonectomy are described. Furthermore, particular focus is paid to anesthetic considerations, with anesthesia induction, maintenance, and dynamic modifications outlined. The protocol also specifies the custom device's initialization, maintenance, and termination of perfusion and ventilation. Dynamic organ management techniques, including alterations in ventilation and metabolic parameters to optimize organ function, are thoroughly described. Finally, the physiological and metabolic assessment of lung function is characterized and depicted in the representative results.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

This paper describes a porcine model of negative pressure ventilation ex situ lung perfusion, including procurement, attachment, and management on the custom-made platform. Focus is made on anesthetic and surgical techniques, as well as troubleshooting.

Normotherme Unterdruckbeatmung ex situ Lungenperfusion: Beurteilung der Lungenfunktion und des Lungenstoffwechsels

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ ...

Lung Rapid Recovery Procurement Combined with Abdominal Normothermic Regional Perfusion in Controlled Donation after Circulatory Death

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years confirm that the outcomes after lung transplantation from cDCD are similar to those from brain death donors; however, the utilization of lungs from asystole donors remains low. Several reasons may be involved: different legal frameworks among countries and centers with different premortem interventions, inadequate lung donor care before procurement, or even poor experience with cDCD procedures and protocols.
Initially, the rapid recovery technique was commonly employed for the procurement of thoracic and abdominal organs in cDCD, but, in the last decade, abdominal normothermic regional perfusion (ANRP) with extracorporeal membrane oxygenation devices has become a useful method to restore blood flow to abdominal organs, allowing their quality improvement and their functional assessment prior to transplantation. This makes the donation procedure more complex and generates doubts about injury to the grafts due to dual temperature.
The aim of this article is to describe a protocol based on a single center experience with Maastricht III donors combining lung cooling rapid recovery in the thorax and abdominal normothermic regional perfusion. Tips and tricks focused on premortem interventions and lung procurement procedure techniques are explained. This may help to minimize the reluctance among professionals to use this combined technique and encourage other donor centers to use it, despite the increased complexity of the procedure.

The protocol combines a lung cooling rapid recovery technique with abdominal normothermic regional perfusion for abdominal graft procurement in controlled asystole donors, which is a safe and useful method to expand the donor pool.

Schnelle Genesung der Lunge in Kombination mit abdominaler normothermer regionaler Perfusion bei kontrollierter Spende nach Kreislauftod

Controlled donation after circulatory death (cDCD) has contributed to increasing donor numbers all over the world. Experiences published in the last years ...

Innovative Lungenbildgebung mit Agarose-eingebetteten Vibratomschnitten

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural support for sectioning, pieces of lung tissue are commonly embedded in paraffin or OCT compound and cut with a microtome or cryostat, respectively. A more recent technique, known as precision-cut lung slices, adds structural support to fresh lung tissue through agarose infiltration and provides a platform to maintain primary lung tissue in culture. However, due to epitope masking and tissue distortion, none of these techniques adequately lend themselves to the development of reproducible advanced light imaging readouts that would be compatible across multiple antibodies and species. 
To this end, we have developed a tissue-processing pipeline, which utilizes agarose embedding of fixed lung tissue, coupled to automated vibratome sectioning. This facilitated the generation of lung sections from 200 &#181;m to 70 &#181;m thick, in mouse, pig, and human lungs, which require no antigen retrieval, and represent the least "processed" version of the native isolated tissue. Using these slices, we reveal a multiplex imaging readout capable of generating high-resolution images whose spatial protein expression can be used to quantify and better understand the mechanisms underlying lung injury and regeneration.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der räumlichen Proteinexpression anhand von Agarose-eingebetteten Lungengewebeschnitten 

We have developed a tissue-processing technique utilizing a vibratome and agarose-embedded lung tissue to generate lung sections, thereby permitting the acquisition of high-resolution images of lung architecture. We employed immunofluorescence staining to observe spatial protein expression using specific lung structural markers.

Automatisierter Vibratomschnitt von Agarose-eingebettetem Lungengewebe für die Multiplex-Fluoreszenzbildgebung

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...