Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert.

1. Herstellung von DNA und Glasmikropipetten zur Injektion <ol><li> Gute Qualität Glasmikropipetten sind unerlässlich, um anfängliche hohe Rate der Fehlgeburten durch den Verlust von Fruchtwasser zu reduzieren. Das Verfahren zur Glasmikropipetten ziehen ist gut 13,18,25 dokumentiert. Mit 1,2 mm Durchmesser gezogen Kapillaren in einem herkömmlichen Sutter P-97-Gerät mit den Einstellungen P = 500; Wärme = 300; Ziehen = 40; Velocity = 50; Zeit = 50. Den Abzieher mit 3 mm &quot;Trog&quot; Filamente (Sutter Instrument FT330B). Die 2 mm Größe Filamente für uns weniger zufriedenstellende Ergebnisse lieferte. Auf der anderen Seite, hat Abschrägung des Mikropipettenspitzen nicht scheinen, um für uns zu verbessern. </li><li> Auflösen gereinigt endotoxinfreiem Plasmid-DNA in PBS (Zellkultur), die 0,1% Fast Green bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 2 pg / pl. Die Fast Green machen den injizierten Lösung sichtbar im embryonalen Hirn Ventrikel. </li><li> Legen Sie 10 ul der DNA-Lösung in die Glasmikropipette. </li&gt; <li> Schließen Sie das Glasmikropipette dem Einspritzsystem (Pico Pump) oder Mund Pipette. </li></ol> 2. Anästhesie Vorbereiten des Operationstisches mit einem Heizkissen und der chirurgischen Instrumente. Schalten Sie die kalte Lichtquellen, um die Visualisierung der Embryonen zu erleichtern. Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente mit zum Beispiel eine Glasperle Sterilisator. Drei verschiedene Anästhesieverfahren sind für dieses Protokoll möglich (siehe Diskussion). Hier beschreiben wir die, die wir für die besten halte, mit Isofluran Inhalation für Narkose (Durchfluss 0,5 l / min) sowie die Wartung (Durchfluss 1 L / min). <ol><li> Führen Sie die Maus schwanger in einem kleinen transparenten (so die Maus bleibt sichtbar) Behälter mit dem Komesaroff Mark 5 Narkosegerät durch eine kurze Rohrlänge. </li><li> Füllen Sie den Verdampfer mit Isofluran, öffnen Sie dann die Sauerstoff-Flasche an das Gerät angeschlossen. Brennen Sie eine oder zwei Impulse isoflUrane / Sauerstoff (0,5 L / min) in den Behälter mit der Maus und Uhr für Narkose um in. </li><li> Nehmen Sie die Maus aus, bedecken ihre Augen mit Salbe zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen und passen die Flow-Anästhesie-Maske auf den Kopf sofort. </li></ol> 3. Laparotomie <ol><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch nach oben Heizkissen (sonst seine Körpertemperatur sinken wird sehr schnell abnimmt Heilungschancen) und sichern ihren Körper in Ort durch die Festsetzung seiner vier Beine an den Seiten mit Klebeband. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose, indem für den Verlust der Reaktion auf Reflexstimulation (zB Zeh oder Schwanz Prise mit festem Druck). </li><li> Rasur der Bauchdecke und desinfizieren sie mit dem iodophorpovidone-Iod (Braunoderm). </li><li> Einen Längsschnitt (1 bis 1,5 cm lang) auf der Bauchhaut. Dann schneiden Sie das Bauchfell. Zeigen Baumwolle Gaze um den Einschnitt. Machen Sie einen Uterushorns sichtbar und ziehen Sie es vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette auf die PBS gespült gauze. Spülen Sie die Gebärmutter mit PBS sehr oft, damit es immer angefeuchtet (2A und 2B). Während des gesamten Verfahrens zu vermeiden Ziehen des Mesometrium oder die Gebärmutter eng, da hohe Druck in der Gebärmutter für den Embryo Erhöhung der Chancen der Verlust von Flüssigkeit beim Einspritzen was Abtreibung übertragen wird. </li></ol> 4. DNA-Injektion in das Gehirn Ventrikel <ol><li> Halten des Uterus in einer Weise, dass die Hirnkammern visualisiert werden kann. Nicht umfassend neu ein Embryo, der sich in einer ungünstigen Position liegt - das erhöht nur die Chancen der Abtreibung. </li><li> Ein Blick auf die Embryo Kopf von oben, die Lücke visuell lokalisieren oder Riss zwischen den linken und rechten kortikalen Hemisphären. Die Halbkugeln sind leicht zu unterscheiden und die lateralen Ventrikel in ihnen (nicht ins Visier genommen werden) können in der Regel als etwas dunkler Formen wahrgenommen werden. Wenn ein Embryo sich als optimaler Ausrichtung zur DNA-Injektion (Figures 2C und 2D), ist es möglich, die Gebärmutterwand durchstoßen und in die dritte Kammer auf einmal. Halten der Glas-Mikropipette auf 45 ° an der Gebärmutterwand und durchstechen am rostralen Ende des Spalts zwischen kortikalen Halbkugeln, dringt etwa 1 mm. Auf diese Weise wird die Spitze des Glas-Mikropipette wird in die dritte Ventrikel des Gehirns (nicht die lateralen Ventrikel) (2C und 2D). In Embryonen ungünstiger orientiert ist es sinnvoll, zunächst durchbohren der Gebärmutterwand (immer bei 45 °) in der Nähe des embryonalen Kopf, legen Sie die Mikropipettenspitze in die richtige Position zwischen den kortikalen Hemisphären und erst dann zu perforieren das Gehirn. Spritzen etwa 1 ul DNA-Lösung in den dritten Ventrikel (eine gute Injektion füllt die Ventrikel mit grünen Flüssigkeit). Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Embryonen von einem Uterus Horn. Dies ermöglicht einige Zeit für die DNA-Lösung gleichmäßig zu mischen mit dem ventrikulären Flüssigkeit und erreichen die Zellstofe Neuroepithel. </li></ol> 5. Targeting der Hypothalamus für die Elektroporation <ol><li> Schalten Sie das Elektroporator auf und passen Sie die Einstellungen entsprechend der embryonalen Alter (für E12.5 verwenden wir 5 Rechteck-Pulse, 50 V, 50 ms ON/950 ms OFF). Verwendung Pluspol der Edelstahl Nadelelektrode (CUY550-10) und als negativer Pol einer runden flachen Elektrode (CUY700P4L). (Es ist wichtig, dass die Elektroden kleiner als die Embryos sind, da sonst der Strom nur fließt, um den Embryo, aber nicht durch sie.) </li><li> Wählen Sie für die Elektroporation jene Embryonen, deren dorsalen Seite nach oben (dh wandte sich dem Experimentator) (wie die meisten von ihnen sind), und entsorgen Sie diejenigen, deren Ausrichtung ist nicht günstig. Jetzt ist es sicher, um die Gebärmutter mit Ethanol desinfiziert Finger oder mit Handschuhen berühren. Halten des Uterus mit einer Pinzette, würde jedoch der Stromfluss bei der Elektroporation stören. </li><li> Pierce die Gebärmutterwand durch das Embryonenschutzgesetz den Kopf zwischen dem amniotic sac und der Plazenta in Abstützung nach unten durch sie mit der Spitze der Nadelelektrode. Verwenden Sie den Zeigefinger der anderen Hand als Widerlager. Über 5 mm von der Elektrodenspitze muss nun zwischen der Fruchtblase und der Gebärmutterwand, etwa auf dem Niveau des Mittelhirns (2E und 2F). Denken Sie daran, dass dies das &quot;Targeting Elektrode&quot; ist, so wird seine Position zu bestimmen, welcher Teil des Hypothalamus Neuroepithel höchstwahrscheinlich transfiziert bekommen ist. Der Embryo muss sehr vorsichtig &quot;gequetscht&quot; zwischen den Elektroden. </li><li> Mit der anderen Hand, positionieren Sie den runden flachen Elektrode außerhalb der Gebärmutter Wand auf der gegenüberliegenden Seite des Embryos Kopf (2E und 2G). </li><li> Verwenden Sie den Fußschalter, um Spannung anzulegen (50 V, 50 ms ON, 950 ms AUS, 5 Rechteckpulse). </li><li> Langsam ziehen die Nadel-Elektrode aus der Gebärmutter, während die Gebärmutter wieder mit dem Zeigefinger der anderen Hand - wenn amniotic Flüssigkeit durch den durchlöcherten Wand verloren geht, in der Regel der Embryo unterziehen Abtreibung. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Embryonen. </li><li> Bringen Sie den Uterushorns in den Bauch und wiederholen Sie die Injektion und Elektroporation in den Überrest Horn. </li></ol> 6. Finishing der Chirurgie <ol><li> Nach der Injektion und Elektroporation von allen Embryonen, legen die Gebärmutter wieder in den Bauch sehr sorgfältig, exakt positioniert, wie sie vor und feucht die Bauchhöhle mit Kochsalzlösung vor dem Schließen waren. </li><li> Naht das Bauchfell mit Catgut (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Für die Schließung der Haut Verwendung &quot;unterbrochen Stich&quot; methodwith ein beständiger Naht (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L). </li><li> Desinfizieren Sie die Bauch Oberfläche mit PVP-Jod (Braunoderm) und injizieren eine nicht-steroidalen entzündungshemmenden subkutan (z. B. 100 ul einer Lösung von 1.10 Rimadyl in 0,9% NaCl) oder, noch besser, ein Opioid wie buprenorphine (Temgesic, 0,05 bis 0,1 mg / kg Körpergewicht in 0,9% NaCl), um Schmerzen zu lindern. </li><li> Entfernen Sie die Mutter aus der Narkose Maschine und legen Sie sie in einem Käfig, die von einem Heizkissen erwärmt wird. Überwachen Sie die Maus ständig, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. Später, überprüfen Sie die Tiere täglich um sicherzustellen, dass sie von dem Verfahren ohne Anzeichen einer Infektion oder Schmerzen erholt. </li></ol> 7. Analyse der Ergebnisse <ol><li> Ernten der Embryos (oder postnatals) entsprechend der gewünschten Tag der Analyse. Postnatale Mäuse (1 bis 2 Tage alten) werden durch Enthauptung getötet. </li><li> Trennen jedes Embryo nach dem vorhergehenden Elektroporation Annotation. Präparieren Sie das Gehirn unter einem Stereomikroskop und überprüfen unter dem Mikroskop grün fluoreszierende Signal (von der GFP-Reporter) in die entsprechende Region. </li><li> Der ausgewählte Gehirn kann &quot;frisch&quot; analysiert werden: fix das Gewebe für eine kurze Zeit in 4% Paraformaldehyd und einbetten in Agarose 4% oder in Gelatine-albumin, dann auf einem Abschnitt Vibratom-Typ (Abbildung 3). Nähere immunhistochemische Analyse (Abbildung 4), Kryo-schützen das Gehirn in 30% Saccharose-Lösung, in OCT Eindeckmediums (Tissue Tek) einzubetten dann schneiden 20 um Abschnitte in einem Kryostaten. </li></ol>

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C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus.">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets.">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Über der Narkose: Da in utero Elektroporation in den Hypothalamus kann technisch schwierig und erfordern längere Narkose Zeiten bevorzugen wir zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Verabreichung einer Mischung aus Sauerstoff und Isofluran. In unserer Erfahrung können Tiere bleiben entsprechend betäubt auf diese Weise für einen Zeitraum von bis zu einer Stunde mindestens, ist die Erholung der Mutter sehr schnell, und Embryo Überleben verbessert. Andere Ansätze zur Anästhesie zur Verfüg...

Genetische Manipulation des embryonalen Gehirn der Maus ist eine bevorzugte Ansatz über Entwicklungsregulation lernen. Die Erzeugung von mutierten Maus Linien ist jedoch langsam und teuer. Eine leistungsfähige Methode, um spezifische genetische Veränderungen in sich entwickelnden Neuronen des Gehirns von Säugetieren einzuführen, ist in utero Elektroporation. Im Wesentlichen besteht die Technik der DNA-Transfektion in die embryonalen Gehirn neuroepithelium mittels elektrischer Impulse, dann ermöglicht der Embryo für eine bestimmte Zeit überleben, sammeln das Gehirn und prüft sie auf mögliche neue, informative Phänotypen. Auf diese Weise kann der Experimentator Hypothesen fast sofort zu testen, ohne die langen Wartezeiten, die für die Produktion von Maus-Mutanten. Transfektion von DNA in sich entwickelnden Embryonen begann mit in ovo Elektroporation auf Hühnerembryonen 1. Der wesentliche Proof-of-Concept für die Maus wurde in Kultur durchgeführt <sup&gt; 2. Dies wurde bald von den ersten Beschreibungen der Technik auf der Maus in utero 3,4 gefolgt. Das Hauptproblem ist, das Gehirn des Embryos in der Gebärmutter entwickeln ohne sie zu töten oder die Mutter transfektieren. Lernen, um die notwendige Operation durchführen (Laparotomie, Injektion, die Elektroporation) erfordert eine lange Einarbeitungszeit. Sobald die Operation bis zu dem Punkt, wo der Embryo Überlebensverhältnis akzeptabel ist gemeistert, ist der nächste entscheidende Frage: Welche Hirnstrukturen zugänglich sind? Nicht überraschend, die ersten veröffentlichten Arbeiten zeigt erhaltenen Ergebnisse mit in utero Elektroporation auf die kortikale Entwicklung 5-9 konzentriert. Dies ist immer noch für die meisten Veröffentlichungen mit dieser Technik gilt, da der Bereich der Entwicklung Gehirn der Maus am besten zugänglichen chirurgischen Eingriffen ist der Kortex (Abbildung 1). Das Verfahren für die in utero Elektroporation in der Hirnrinde wurde beschriebenprint 10 und in Video 11-14. Eine Modifikation der Technik kann verwendet werden, um einen ventralen Teil des telencephalon, die Basalganglien 15 abzuzielen. Jenseits der telencephalon ist das Zwischenhirn (klassisch in Thalamus und Hypothalamus geteilt) eine Region des Vorderhirns mehr schwer zu erreichen. Eine kleine Anzahl von Papieren Berichte Targeting seiner Rückenflosse und am leichtesten zugängliche Teil, der Thalamus 16-19. Der Hypothalamus ist die ventralen Teil des Vorderhirns, damit die einen lokalisierten am tiefsten von der dorsalen Fläche (cortex) (Abbildung 1). Diese Region bleibt eine schwierige Herausforderung für die Forscher verpflichtet genetisch zu manipulieren das Gehirn der Maus in der Gebärmutter. Nach unserem Wissen, berichten nur sehr wenige Artikel über die Ergebnisse der in utero Transfektion in der Maus Hypothalamus 20,21. Allerdings ist die funktionelle Bedeutung des Hypothalamus cannot überbewertet werden, da sie Verhaltensweisen wie Essen und Trinken, Paarung, Aufzucht und Erziehung 22 regelt. Darüber hinaus tragen Veränderungen in Hypothalamus Entwicklung im späteren Leben Erkrankungen wie Übergewicht, Bluthochdruck, Diabetes und vorzeitige Pubertät 23 stammen. Die Möglichkeit, genetisch verändern die Hypothalamus während der Entwicklung würde ein sehr mächtiges Werkzeug, um es zu verstehen. Die grundlegende chirurgische Protokoll für die Laparotomie von schwangeren Mäusen, die wir verwenden hier ist ähnlich wie in anderen Protokollen 11,13,14,24 verwendet. Wir werden sie hier kurz beschreiben auf Vollständigkeit. Der Schlüssel zu unserem Verfahren, auf der anderen Seite, sind die Art der Anästhesie, der Ort der Injektion, die Art der Elektroden und das Einsetzen und Position der positiven Elektrode in bezug auf die Embryos Kopf. Wir bevorzugen zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Einatmen Gas über einfache intraperitoneale Anästhesie, seit der ehemalige ermöglicht dieetwas längere Narkose für eine schwierige Operation erforderlich. Isofluran Einatmen führt zu einer schnelleren Erholung von der Narkose, da in der Regel die Mutter zeigt ein normales Verhalten bereits Minuten nach der Operation. Die einfachste Punkt der Injektion der DNA-Lösung mit dem Glas-Mikropipette ist die laterale Ventrikel, was jedoch völlig ungeeignet Hypothalamus Elektroporation. Injektion direkt in den dritten Ventrikel ist in der Tat wichtig, tief Zwischenhirn Strukturen zielen. Es ist möglich, den Hypothalamus von E12.0 oder E12.5 mit Standard-, off-the-shelf Elektroden transfektieren. Wir haben einige der Elektroden durch Nepa Gene (Chiba, Japan) besonders zu diesem Zweck geeignet hergestellt gefunden. Mit unserem Verfahren erhalten wir Transfektion des gesamten Hypothalamus Neuroepithel oder teilweise, je nach regionalen Transfektion Elektrode Orientierung. Hier zeigen wir die Technik, durch Transfektion der mammillary Körper, wohldie tiefste und Einbau aller Hypothalamus Kerne. Darüber hinaus zeigen wir detaillierte histologische Analyse der transfizierten Zellen auf der zellulären Ebene der Auflösung. Ein Vergleich der in utero Elektroporation mit anderen Ansätzen zur Transfektion der Maus entwickelnde Gehirn in utero kann in der Diskussion Abschnitt gefunden werden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine</td>
			<td>Sanofi GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>HDG9623</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin</td>
			<td>Pharma GmbH</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>44715</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>non-steroidal anti-inflammatory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunoderm</td>
			<td>Braun</td>
			<td>3887138</td>
			<td>povidone-iodine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic (buprenorphine)</td>
			<td>Essex Pharma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>opioid analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Ointment</td>
			<td>Pan-Ophtal</td>
			<td>7136926</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5</td>
			<td>Medical Developments Australia</td>
			<td>ACN 004 903 682</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome</td>
			<td>Precisionary Instr.</td>
			<td>VF-300</td>
			<td>Vibratome-type device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY21EDIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 1</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY550-10</td>
			<td>Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode 2</td>
			<td>Nepa Gene Co. Ltd.</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberoptic cold light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td>KL2500 LCD</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC120T-15</td>
			<td>1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>FST250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>py872-5272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection device</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Pneumatic Pico Pump PV820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thread Coated Vicryl</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V4914</td>
			<td>Peritoneal Suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Thr. Supramid</td>
			<td>Serag Wiessner</td>
			<td>TO07171L</td>
			<td>Skin Suture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of the mouse developing hypothalamus through in utero electroporation

Genetische Modifikation von bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirn von Säugetieren ist ein sehr mächtiges experimentellen Ansatz. Die Erzeugung neuartiger Mausmutanten ist oft frustrierend langsam. Es wurde gezeigt, dass der Zugang zum Gehirn der Maus zu entwickeln in der Gebärmutter mit hinreichender Post-OP-Überleben möglich ist. Dennoch Ergebnisse mit diesem Verfahren wurden fast ausschließlich für die meisten oberflächlich und leicht zugänglichen Teil des sich entwickelnden Gehirns gemeldet, dh die Rinde. Der Thalamus, ein schmaler und medialen Bereich, hat sich mehr schwer vorbei. Transfektion in tiefere Kerne, insbesondere diejenigen des Hypothalamus, ist vielleicht die größte Herausforderung und daher nur sehr wenige Ergebnisse gemeldet wurden. Hier zeigen wir ein Verfahren, um die gesamte Hypothalamus neuroepithelium oder ein Teil davon (Hypothalamus Regionen) für die Transfektion durch Elektroporation Ziel. Der Schlüssel zu unserem Ansatz sind länger Narkose mal, Injektion in den third Ventrikel und geeignete Art und die Positionierung der Elektroden. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse von Targeting und anschließende histologische Analyse der meisten vertieften Hypothalamus Kern, die mammillary Körper.

Die meisten Hypothalamus Neuronen zwischen E11.5 bis E15.2 geboren, nach der Geburt-dating-Analyse bei der Ratte 26 in die etwas kürzer Mausentwicklung 27,28 übersetzt. Der Gipfel des Hypothalamus Neurogenese bei E12.5 29-31 erreicht. Demgemäß wird zum Transfektion Alter für die vorliegende Studie (E12.5) gewählt wird, kann ein großer Teil der hypothalamischen Neuronen zu einem bestimmten rostro-kaudalen Niveau bezeichnet werden. Analyse bei E18.5 auf ...

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Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des Hypothalamus,<em&gt; In utero</em&gt; Genetische Manipulation seiner Entwicklung hat selten versucht worden. Wir zeigen ein detailliertes Verfahren für<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation in die Maus Hypothalamus und zeigen repräsentative Ergebnisse der vollständigen und teilweisen (regionalen) Hypothalamus Transfektion.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

15.7K Aufrufe.  University of Heidelberg. Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des Hypothalamus, In utero Genetische Manipulation seiner Entwicklung hat selten versucht worden. Wir zeigen ein detailliertes Verfahren für In utero Elektroporation in die Maus Hypothalamus und zeigen repräsentative Ergebnisse der vollständigen und teilweisen (regionalen) Hypothalamus Transfektion.

Serie: Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...