This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to SB (BR-2215; SFB 497/A9).

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Recht durchgeführt und wurden von den Regierungsstellen in Tübingen genehmigt. 1. Herstellung der Mikropipetten, Lösungen und Membranen <ol><li> Herstellung von Mikropipetten <ol><li> Ziehen Glasmikropipetten mit einer Mikropipette Abzieher mit folgendem Programm: Wärme: 540, Ziehen: 125, Geschwindigkeit: 20 und Delay: 140. Die Nadellänge beträgt 5,5 cm. </li><li> Kegel Nadeln mit einem microgrinder einen geeigneten Spitzengröße von 4 mm zu erhalten. Speichern die Nadeln in einer Box oder 15 cm Petrischale werden Beschädigungen an den Spitzen. </li></ol></li><li> Zubereitung der Lösungen <ol><li> Plasmid-DNA-Lösung <ol><li> Vorbereitung von Plasmid-DNA, die die gewünschte cDNA-Konstrukts unter Verwendung eines Endotoxin-freien Maxi-Prep-Kit nach Herstellerprotokoll. </li><li> Einzustellen Plasmid-DNA-Lösung auf eine Endkonzentration von 3 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l (ohne GFP Spike vector) oder 4 &amp; mgr; g /ul (mit 1 ug GFP Spike Vektor) in endotoxinfreiem Tris-EDTA-Puffer, der Fast Green (Endkonzentration 0,05%). </li></ol></li><li> Laminin Stammlösung <ol><li> Man löst 1 mg Laminin in sterilem Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 ml. Bereiten Sie 100 ul Aliquots und bei -80 ° C. </li></ol></li><li> Poly-L-Lysin-Stammlösung <ol><li> Man löst 50 mg Poly-L-Lysin in 50 ml sterilem Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml. Bereiten Sie 1 ml Aliquots und lagern in -20 ° C. </li></ol></li><li> Füllen Hanks Balanced Salt Solution (Complete HBSS) <ol><li> Bereiten komplette HBSS durch Kombination von 100 ml 10x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES-Puffer (pH 7,4), 30 ml 1 M D-Glucose, 10 ml 100 mM CaCl 2, 10 ml von 100 mM MgSO 4 und 4 ml 1 M NaHCO 3. In sterilem Wasser bis zu 1 l und bei 4 ° C. HINWEIS: Autoklav alle Lösungen erwarten, 1 M HEPES-Puffer und 1 M D-Glucose, die fil sindter sterilisiert. </li></ol></li><li> Slice-Kultur-Medium <ol><li> Bereiten Scheibe Kulturmedium durch Zugabe von 35 ml von Basal Medium Eagle, 12,9 ml komplettem HBSS (1.2.4), 1,35 ml 1 M D-Glucose, 250 &amp; mgr; l von 200 mM L-Glutamin und 500 &amp; mgr; l Penicillin-Streptomycin erhalten ein Endvolumen von 50 ml. Hinzufügen Pferdeserum auf eine Endkonzentration von 5% und bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarosegel <ol><li> Vorbereiten einer 4% LMP Agarose-Lösung durch Zugabe von 2 g des LMP-Agarose auf 50 ml komplettem HBSS (1.2.4), gefolgt von Erhitzen in einer Mikrowelle für 1-2 min bei hoher Leistung. Diese Lösung wird in einem Wasserbad bei 37 bis 39 ° C. Die Lösung ist bei 4 ° C und Wiederverwendung. </li></ol></li><li> Paraformaldehydlösung <ol><li> In einem Abzug bereiten eine 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung durch Zugabe von 4 g Paraformaldehyd in 100 ml 1x PBS. Die Lösung wird auf 60 ° C und ein paar Tropfen 1 N NaOH, bis die Lösung cLear. </li></ol></li><li> Permeabilisierung Lösung <ol><li> Man löst 9 g BSA in 300 ml 1x PBS, enthaltend 0,3% Trition X-100 und bei 4 ° C. Zugabe von 10% Natriumazid für eine Langzeitspeicherung. </li></ol></li></ol></li><li> Beschichtung der Membraneinsätze <ol><li> Verdünne ein Aliquot von Laminin-Stammlösung (1.2.2) und ein Aliquot von Poly-L-Lysin-Stammlösung (1.2.3) in sterilem Wasser auf ein Endvolumen von 12 ml. </li><li> Platzieren Membraneinsätze in Platten mit 6 Vertiefungen mit jeweils gut mit 2 ml sterilem Wasser. 1 ml der Beschichtungslösung auf die Oberseite der Membran und inkubieren O / N bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Nach Inkubation die Membraneinsätze dreimal mit 1 ml sterilem Wasser und trocken. Verwenden beschichteten Membran-Einsätze am selben Tag oder bei 4 ° C für bis zu vier Wochen in einem trockenen 6-Well-Platte. </li></ol></li></ol> 2. DNA-Injektion und Elektroporation von E15.5 und E18.5 Embryonen <ol><li&gt; Anesthetize eine Zeit gepaart weiblichen Maus, indem Sie es in eine betäubende Kammer mit 5% Isofluran gesättigten und einem Verdampfer verbunden. Zirkulieren Isofluran und Sauerstoff mit einer Rate von 1 L / min. Halten Sie das Tier in der Box für 2-4 Minuten oder bis zum Unbewussten, die durch Zusammendrücken zwischen den Pfoten der Maus getestet wird. </li><li> Euthanize den bewusstlosen Maus durch Genickbruch an embryonalen Tag (E) 15,5 oder 18,5. Präparieren Sie die Gebärmutter, die die Embryonen 13 und legen Sie sie in eine Petrischale mit 15 bis 20 ml kaltem komplette HBSS. HINWEIS: Von diesem Punkt an, halten Sie die Embryonen und Gewebe auf Eis. </li><li> Verwenden Sie eine Schere, um jeden Embryo aus dem Uterushorn und Ort in eine zweite Petrischale mit kaltem HBSS komplett zu trennen. </li><li> Unter einem Binokular, trennen die Uterusmuskulatur Wand und die Plazenta mit einer feinen Pinzette (# 55) und eine Schere. Vorsichtig lösen, den Embryo aus dem Dottersack. </li><li> Verwenden Sie ein Paar Bonn Schere decapitate die Embryonen gerade oberhalb der Vorderbeine bei einem Winkel von 60º. Wenn das Experiment erfordert Genotypisierung der Embryonen, sammeln eine Gewebeprobe für die Isolierung genomischer DNA (ein kleines Stück Schwanz). </li><li> Übertragen Sie den Kopf, um eine saubere und trockene Petrischale. Da der Kopf war in einem Winkel von 60 ° enthauptet wurde, sollte der Kopf zur Seite neigen, wenn platziert dorsalen Seite nach oben. </li><li> Platzieren einer Nadel vorsichtig in der Mitte der Halbkugel in der Nähe der Bregma (1A, B). Injizieren etwa 2-3 &amp; mgr; l (bei 3 oder 4 ug / ul) DNA-Lösung, indem er auf das Pedal des Picospritzer III unter Verwendung von 30 Pfund Druck für die Dauer von 10-15 ms pro Impuls Aufbringen 5-8 Impulsen. Die Dauer und die Anzahl der Impulse ist abhängig vom Durchmesser des Nadelöffnung mit kleineren Öffnungen mehr Zeit erfordern. Der Abstand zwischen jedem Impuls beträgt 1 sec. </li><li> Vor dem Einsetzen der Elektroden, ein paar Tropfen von kompletten HBSS auf den Kopf des embryo. Die Elektroden werden in der Weise, daß die &quot;negative&quot; Klemme auf der gleichen Seite wie das injizierte Herzkammer und der &quot;positive&quot; Elektrode, die auf der gegenüberliegenden Seite des eingespritzten Ventrikel unter dem Ohr des Embryos Kopf (1C, D). Bewerben 5 Impulse von 50 V. <ol><li> Verwenden Sie 3 mm Elektroden für E 15.5 und 5 mm Elektroden für E 18.5. </li></ol></li></ol> 3. Präparation des Gehirns <ol><li> Nach der Elektroporation, beim Abziehen der Haut von dem Kopf mit Hilfe einer feinen Pinzette. Verwendung eines Paares von Feder Schere einen kleinen Einschnitt in der Mitte des Kleinhirns an der Mittellinie des Schädels. </li><li> Setzen Sie die Feder Schere in den Einschnitt und geschnitten längs entlang der Pfeilnaht. Ziehen Sie die Schädel und lösen das Gehirn aus dem Schädel durch die Verwendung einer feinen Pinzette. Übertragen Sie das gesamte Gehirn in 15-20 ml kaltem HBSS komplette Lösung. </li><li> Inzwischen pour 4% LMP-Agarose,bei 37-39 ° C in einem Wasserbad gehalten wird, in eine Abzieh-Form. </li><li> Nehmen Sie das Gehirn aus dem kompletten HBSS von einer kleinen Schaufel Spachtel und Abfluss über HBSS mit Hilfe feiner Seidenpapier oder Kimwipes. </li><li> Stellen Sie das gesamte Gehirn sanft in die Agarose und stellen Sie ihre Position mit einer feinen Nadel. Halten Sie die Form auf Eis, bis die Agarose verfestigte und der Block wird geschnitten (für Koronalschnitte die Riechkolben nach oben zeigen). </li></ol> 4. Vibratom Schnitte und Slice-Kultur- <ol><li> Schneiden Sie die LMP-Agarose-Blöcke und kleben sie auf dem Probentisch mit &quot;Superkleber&quot;. Nach der Kleber trocken Übertragung der Probentisch in die Pufferwanne des Vibratom und füllen mit eiskaltem HBSS abzuschließen, bis der Block in die Lösung eingetaucht. HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Instrumenten- und Geräteoberflächen mit 70% Ethanol vor dem Schneiden. </li><li> Bereiten 250 um dicken Vibratom Abschnitte mit einer neuen Klinge wie folgt. <ol><li> Schneiden Sie die Block with folgenden Einstellungen; Frequenz - 60 Hz, Amplitude - 0,7 um, Geschwindigkeit 16-18 mm / sek. Schneiden Sie die Abschnitte, die mit den obigen Einstellungen bei niedriger Geschwindigkeit (9 mm / s) das gewünschte Gewebe. Ab der Schnitt aus dem Hinterhirn, sammeln 5-7 Abschnitte aus dem Großhirn. </li><li> Übertragen Sie die Teile auf ein sauberes 6 Well-Kulturschale mit 5 ml eiskaltem HBSS mit Hilfe eines gebogenen Spatel zu vollenden und zu halten auf dem Eis, bis alle Abschnitte werden gesammelt (1E). </li></ol></li><li> Feuchten Sie die Membran in einem Quer Mode mit 100 ul HBSS komplette, bevor die Abschnitte auf der Membran, um die Ausrichtung der Abschnitte zu erleichtern. </li><li> Übertragen Sie die Abschnitte mit einem gebogenen Spatel auf die Membran (abholen eine Ecke des Abschnitts mit einer Pinzette und ziehen auf den Spatel und dann mit der Zange, um den Abschnitt auf die Membran zu drücken). Legen Sie bis zu fünf Abschnitte auf einer Membran und vereinbaren Sie mit einer Pinzette (1F). Nicht überlappen die Abschnitte miteinander. <ol><li> Nehmen Sie die überschüssigen HBSS von der Membran mit einer Pipette. Die spezifischen Membranen hier sind an einem Rahmen befestigt ist und in das Gewebekulturplatte, die das Gewebe in Kontakt zu sein, aber nicht durch das Mittel bedeckt ermöglicht eingefügt. </li></ol></li><li> Setzen Sie die Membraneinsätze in einen 6 Well-Platte mit 1,8 ml Stück Kulturmedium (1.2.5) (Abbildung 1 G, H). Inkubieren der Kulturschale bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 11 oder 14 DIV DIV. Ändern Sie die Hälfte des Mediums (0,9 ml) jeden zweiten Tag. HINWEIS: In diesem Stadium hinzu Reagenzien wie Bromdesoxyuridin (BrdU; 10 &amp; mgr; M Endkonzentration) für die Kennzeichnung von proliferierenden Zellen zu den Medien für die ersten 20 Stunden der Kulturzeit. </li></ol> 5. Fixierung der Sektionen durch Immunfluoreszenzfärbungen Gefolgt <ol><li> Verwenden Sie eine saubere und scharfe Skalpellklinge zu schneiden und trimmen die Membranen in Abhängigkeit von der Ausrichtung derdie Abschnitte. </li><li> Übertragen der Abschnitte zusammen mit der Membran auf eine Platte mit 24 Vertiefungen, die 1 ml 4% PFA (1.2.7). Inkubiere die Abschnitte für 1 h bei RT, gefolgt von 3 Waschungen mit 1x PBS für je 15 min. Inkubieren der Abschnitte O / N bei Permeabilisierung Lösung bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Am folgenden Tag, Inkubation der Schnitte mit geeigneten primären Antikörper, in Permeabilisierung Lösung verdünnt, O / N oder für 48 Stunden bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> 3 Mal Waschen Sie die Teile für 15 min mit 1x PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C mit den entsprechenden Sekundärantikörper in Permeabilisierung Lösung verdünnt. </li><li> Nach der Inkubation mit sekundären Antikörpern, waschen Sie die Teile einmal mit 1x PBS für 15 min, gefolgt von DAPI-Färbung für 10 min. </li><li> 3 mal mit 1x PBS Waschen Sie die Teile für 15 min je und übertragen auf Objektträger. Fügen ImmunoMount und sanft legen Sie eine Deckglas Sektionen. Trocknen Sie die Dias O / N bei 4 ° C und seal mit Nagellack. HINWEIS: Halten Sie die Folien immer bei 4 ° C. <ol><li> Analysieren Sie die Schnittkulturen durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1E). </li></ol></li></ol>

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(2), (2007).</li><li>Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germinal+matrices+in+the+developing+dentate+gyrus+are+composed+of+neuronal+progenitors+at+distinct+differentiation+stages.">The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages.</a> Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).</li><li>Lechler, T., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin:+an+unexpected+regulator+of+microtubule+organization+in+the+epidermis.">Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis.</a> J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).</li><li>Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Der Hippocampus hat eine wichtige Funktion bei Lernen und Gedächtnis. Gyrus dentatus ist auch einer der beiden Hirnregionen, wo die Neurogenese tritt nicht nur während der Entwicklung, sondern auch im Erwachsenenalter. Die postnatale und adulte Neurogenese erfolgt in ähnlicher Weise mit vielen Gemeinsamkeiten. Definition der Regulierungsmechanismen dieser Faktoren wird sehr hilfreich für das Verständnis neurodegenerativer Erkrankungen, die wiederum zu neuen Therapien und präventive Maßnahmen zu führen. Um diese ...

Der Hippocampus spielt eine wichtige Rolle im Gedächtnis und Lernen sowie emotionales Verhalten. Eine Hauptfunktion besteht in der Konsolidierung des Kurzzeitgedächtnisses in das Langzeitgedächtnis, die hohe Plastizität des Nervensystems erfordert. Der Gyrus dentatus des Hippocampus wirkt als primäre Gateway für Eingabeinformation und ist auch einer der beiden Hirnregionen mit laufenden Neurogenese im Erwachsenenalter 1,2. Die Entwicklung der hippocampalen Struktur tritt während der späten Embryogenese und insbesondere während der ersten 3 bis 4 Wochen nach der Geburt 3. Während der frühen Entwicklung des Gyrus dentatus eine Stammzellpools hergestellt für postnatale erforderlich sowie adulte Neurogenese 4. Entwicklung von Nervenzellen durchlaufen verschiedene Stadien, von der Stammzelle über mehrere Stufen der Vorläuferzellen in die unreifen und schließlich reifen Neuronen während der postnatalen und adulten Neurogenese. In verschiedenen Stadien der Neurogenese die Expressionspezifische Gene erforderlich ist, um die Reifung und Integration neuer Neuronen in Hippocampus-Schaltung 5,6 erlauben. Verwendung Mausgenetik und Phänotypanalyse immunhistochemisch sowie molekulare Methoden erlaubt die Definition der Expressionsmuster und Funktion vieler dieser Gene. Neben Microarray-Analyse sowie Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) zur Verfügung gestellten Informationen über potenzielle direkte und indirekte Zielgene 7,8. Allerdings gibt es noch viele offene Fragen über die Regulierungsmechanismen der Hippocampus-Entwicklung, insbesondere die Entwicklung des Gyrus dentatus. Um einen tieferen Einblick, wie spezifische Gene reguliert ein System erforderlich erlaubt die Manipulation von einer kleinen Anzahl von Zellen durch Down- oder Hochregulierung des Gens von Interesse und / oder seinen Zielgenen und folgen ihr Schicksal während der Entwicklung zu erhalten. In utero Elektroporation von shRNAs, cDNA der Gene von Interesse oder Cre recombinase stellt ein solches Werkzeug. Um das Vorhandensein der gewünschten DNA oder kleine RNAs Expressionsplasmide sollte für die Elektroporation verwendet werden, zu gewährleisten. Dieser Ansatz ist erfolgreich bei der Untersuchung kortikalen Entwicklung 9,10 ein herausfordernder Ansatz Untersuchung der Entwicklung des Gyrus dentatus auf Grund der Position der hippocampalen Strukturen tiefer Gehirnschichten implementiert, aber ist. Ex utero Elektroporation gefolgt von organotypischen Kultur ist ein Ansatz, um dieses Problem zu umgehen 11,12. Im Gegensatz zu den in utero Elektroporation nicht den gesamten Embryo aber nur der Kopf verwendet ermöglicht es daher, die Elektroden in einer günstigeren Weise, die shRNA / DNA Richtung Hippocampus und Gyrus dentatus direkt auszulösen. Unsere Gruppe erfolgreich eingesetzt ex utero Elektroporation, um die Rolle des Transkriptionsfaktors BCL11B im Gyrus dentatus Entwicklung 8 studieren. BCL11B hat eine doppelte Funktion Gyrus dentatus Entwicklung regulating Vorläuferzellproliferation und Differenzierung wurde durch Immunhistochemie nachgewiesen. Um einen Mechanismus für BCL11B Einbindung in diesen Prozessen weiter zu definieren, wurden Protokolle des Polleux Gruppe 11,12 eingestellt, um den Gyrus dentatus, wie unten in dem Protokoll beschrieben untersuchen. In einem ersten Ansatz wurde die Frage angesprochen, ob BCL11B regelt neuronalen Zelldifferenzierung Zelle autonom. Ein zweiter Ansatz untersucht, ob Desmoplakin, Direkt Zielgen BCL11B, genügt, um die BCL11B Phänotyp retten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="271">
	<tbody>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:73px;">Company</td>
			<td style="width:63px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:64px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Flaming/ Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:73px;">Sutter Instruments Company (USA)</td>
			<td style="width:63px;">P-97</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fine Glass Pipettes</td>
			<td style="width:73px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:63px;">G100F-4</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Microgrinder</td>
			<td style="width:73px;">Narishige, Japan</td>
			<td style="width:63px;">EG-44</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Anesthetic Bracket unit</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0412</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Halovet Vaporizer</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0398</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Fluovac System</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0387</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">IMS Fluosorber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0415</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Anesthetizing Chamber</td>
			<td style="width:73px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:63px;">PY2 34-0460</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Electroporator</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">CUY21 EDIT</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P3</td>
			<td style="width:64px;">3 mm electrodes for E15.5</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Tweezers with disk electrodes</td>
			<td style="width:73px;">BEX Company</td>
			<td style="width:63px;">LF650P5</td>
			<td style="width:64px;">5 mm electrodes for E18.5</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Picospritzer III</td>
			<td style="width:73px;">Parker Hannifin Corporation</td>
			<td style="width:63px;">P/N 052-0500-900</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:71px;">HM 650V Vibrating Blade Microtome, 230V</td>
			<td style="width:73px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:63px;">920120</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:71px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Carl Zeiss Microscopy Gmbh</td>
			<td style="width:63px;">Stemi SV8</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Leica DM IL LED</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:73px;">Leica</td>
			<td style="width:63px;">Sp5II</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td rowspan="2" style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td rowspan="2" style="width:63px;">#353502</td>
			<td rowspan="2" style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">6 well dish</td>
			<td style="width:73px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:63px;">#657160</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Tissue culture inserts</td>
			<td style="width:73px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:63px;">#353090</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Fast Green</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">F7252</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:71px;">Laminin</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#L2020</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:73px;">Sigma</td>
			<td style="width:63px;">#P5899</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">15003-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:71px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:73px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:63px;">14084-08</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:71px;">Forceps</td>
			<td style="width:73px;">Dumont #55</td>
			<td style="width:63px;">11255-20 Inox</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">HBSS 10X</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">14180-046</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:71px;">BME</td>
			<td style="width:73px;">Life Technology</td>
			<td style="width:63px;">41010-26</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ablation des Transkriptionsfaktors BCL11B verursacht die Beeinträchtigung der Vorläuferzellproliferation und neuronalen Differenzierung, was zu einer reduzierten Gyrus dentatus Größe und die Zellzahl. Darüber mutierten Neuronen nicht in die Hippocampus-Schaltung verursacht Lern- und Gedächtnisstörungen 8 zu integrieren. Um Fragen bezüglich der regulatorischen Mechanismus (n) des BCL11B in diesen Prozessen ex utero Elektroporation beschäftigt war zu beantworten. A...

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-culture-mouse-hippocampal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

9.4K Aufrufe.  University of Ulm. Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Serie: Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific Cre models, deletion of a protein throughout a tissue or cell population often leads to complex phenotypes resulting from multiple interacting mechanisms. Determining whether a phenotype results from disruption of a cell autonomous mechanism, which is intrinsic to the cell in question, or from a non-cell autonomous mechanism, which would result from impairment of that cell&#8217;s environment, can be difficult to discern. To gain insight into protein function in an in vivo context, in utero electroporation (IUE) enables gene deletion in a small subset of cells within the developing cortex or some other selected brain region. IUE can be used to target specific brain areas, including the dorsal telencephalon, medial telencephalon, hippocampus, or ganglionic eminence. This facilitates observation of the consequences of cell autonomous gene deletion in the context of a healthy environment. The goal of this protocol is to show how IUE can be used to analyze a defect in radial migration in a floxed transgenic mouse line, with an emphasis on distinguishing between the cell autonomous and non-cell autonomous effects of protein deletion. By comparing the phenotype resulting from gene deletion within the entire cortex versus IUE-mediated gene deletion in a limited cell population, greater insight into protein function in brain development can be obtained than by using either technique in isolation.

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Induktion der Protein Deletion Durch<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kultur und Co-Kultur von Maus Eierstöcke und Eibläschen

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

Ex-vivo-Kultur von Chick Kleinhirn-Slices und räumlich gezielte Elektroporation von Körnerzellvorstufen

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate embryonic origins and functions &#8212; the neurohypophysis and the adenohypophysis. The developing mouse pituitary gland is tiny and delicate with an elongated oval shape. A coronal section is preferred to display both the adenohypophysis and neurohypophysis in a single slice of the mouse pituitary.
The goal of this protocol is to achieve proper pituitary coronal sections with well-preserved tissue architectures from developing mice. In this protocol, we describe in detail how to dissect and process pituitary glands properly from developing mice. First, mice are fixed by transcardial perfusion of formaldehyde prior to dissection. Then three different dissecting techniques are applied to obtain intact pituitary glands depending on the age of mice. For fetal mice aged embryonic days (E) 17.5 - 18.5 and neonates up to 4 days, the entire sella regions including the sphenoid bone, gland, and trigeminal nerves are dissected. For pups aged postnatal days (P) 5 - 14, the pituitary glands connected with trigeminal nerves are dissected as a whole. For mice over 3 weeks old, the pituitary glands are carefully dissected free from the surrounding tissues. We also display how to embed the pituitary glands in a proper orientation by using the surrounding tissues as landmarks to obtain satisfying coronal sections. These methods are useful in analyzing histological and developmental features of pituitary glands in developing mice.

We present a protocol to dissect pituitary glands and prepare pituitary coronal sections from developing mice.

Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ideal for experimentation. Currently, the study of these developmental pathways in the chicken embryo is conducted by applying inhibitors and drugs at localized sites and at low concentrations using a variety of methods. In vitro tissue&#160;culturing is a technique that enables the study of tissues separated from the host organism, while simultaneously bypassing many of the physical limitations present when working with whole embryos, such as the susceptibility of embryos to high doses of potentially lethal chemicals. Here, we present an organotypic culturing protocol for culturing the embryonic chicken half head in vitro, which presents new opportunities for the examination of developmental processes beyond the currently established methods.

Here, we present an organotypic culturing protocol to grow embryonic chicken organs in vitro. Using this method, the development of embryonic chicken tissue can be studied, while maintaining a high degree of control over the culture environment.

Organotypischen Kultur-Methode, die Entwicklung der embryonalen Gewebe zu studieren

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Zusammenfassung

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Induktion der Protein Deletion Durch

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine